Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro

Resumo

Este protocolo gera micromatrizes de biopartículas que fornecem enxame de neutrófilos espacialmente controlados. Ele fornece fácil acesso aos mediadores que os neutrófilos liberam durante a migração e permite análise quantitativa de imagem.

Resumo

O enxame de neutrófilos é um processo cooperativo pelo qual os neutrófilos selam um local de infecção e promovem a reorganização tecidual. Swarming tem sido estudado clássicamente in vivo em modelos animais mostrando padrões característicos de migração celular. No entanto, nos modelos vivo possuem várias limitações, incluindo mediadores intercelulares que são de difícil acesso e análise, bem como a incapacidade de analisar diretamente os neutrófilos humanos. Devido a essas limitações, há a necessidade de uma plataforma in vitro que estude com neutrófilos humanos e ofereça fácil acesso aos sinais moleculares gerados durante o enxame. Aqui, um processo de microcarimbo múltiplo é usado para gerar uma micromatriz de biopartículas que estimula o enxame imitando uma infecção in vivo. A micromatriz de biopartículas induz os neutrófilos a se aglomerarem de forma controlada e estável. Na micromatriz, os neutrófilos aumentam a velocidade e formam enxames estáveis em torno de aglomerados de biopartículas. Além disso, o supernatante gerado pelos neutrófilos foi analisado e 16 proteínas foram descobertas como expressos diferencialmente ao longo do aquecimento. Esta plataforma de aquecimento in vitro facilita a análise direta da migração de neutrófilos e liberação de proteínas de forma reprodutível e controlada espacialmente.

Introdução

Os neutrófilos, os mais abundantes glóbulos brancos da corrente sanguínea^1,estão ganhando atenção como potenciais metas diagnósticas e terapêuticas^2,3, porque podem estar envolvidos em uma variedade de condições médicas, incluindo gota^4,sepse³, trauma^5,6,câncer^1,7,8, e várias doenças autoimunes^5,9. O enxame de neutrófilos é um processo multiestágio, fortementeregulado com uma complexidade que o torna um foco particularmente interessante do estudo^5,10,11. Durante o enxame, os neutrófilos isolamum local de inflamação do tecido saudável circundante^5,10,11. A regulação adequada do enxame de nêutrons é essencial para promover a cicatrização da ferida e, finalmente, a resolução de inflamação^5,12. O enxame de neutrófilos tem sido estudado principalmente em roedores^12,13,14,15 e zebrafish^10,11,12,15 modelos. No entanto, a natureza desses modelos animais vivos dá origem a limitações⁵. Por exemplo, os mediadores liberados por neutrófilos durante o enxame não são facilmente acessíveis para análise⁵. Além disso, existem muitas fontes potenciais para um determinado mediador in vivo, por isso um experimento in vivo deve introduzir uma deficiência genética para inibir a produção celular e/ou interação, a fim de investigar o papel desse mediador em um determinado processo¹³. Um experimento in vitro contorna essa complicação permitindo a observação de neutrófilos sem o contexto de células adicionais. Além disso, pesquisas que descrevem a migração coordenada por neutrófilos humanos são limitadas^{em 16}. Em uma plataforma de enxame in vitro, os neutrófilos humanos podem ser diretamente analisados. Uma plataforma de enxame in vitro poderia expandir o conhecimento adquirido a partir de estudos in vivo, proporcionando oportunidades para preencher as lacunas deixadas pelas limitações dos estudos in vivo.

Para atender à necessidade de uma plataforma in vitro que imita o aquecimento vivo de neutrófilos, desenvolvemos uma plataforma de microestampagem que nos permite padronizar micromatrizes de biopartículas que estimulam o aquecimento de neutrófilos de forma espacialmente controlada. Geramos micromatrizes de biopartículas em slides de vidro em um processo de duas etapas. Primeiro, usamos microestampagem para gerar uma micromatriz de manchas de polieletrolito cdoico (CP). Em segundo lugar, adicionamos uma solução de biopartículas que aderem às manchas CP via interação eletrostática. Ao padronizar primeiro a camada CP, podemos padronizar seletivamente partículas carregadas negativamente para gerar o padrão desejado de aquecimento de neutrófilos. A camada positivamente carregada contém as biopartículas carregadas negativamente através da etapa vigorosa de lavagem que remove as biopartículas das áreas no deslizamento de vidro que não têm o CP. Além disso, o CP usado aqui, um copolímero de acrilamida e momer cationic quaternizado, é biocompatível, por isso não induz uma resposta dos neutrófilos. Ele tem uma carga superficial muito alta que imobiliza as biopartículas do tamanho de mícrons para o deslizamento de vidro, inibindo assim os neutrófilos de remover as partículas da posição padronizada no deslizamento de vidro. Isso resulta em agrupamentos de biopartículas dispostos em uma micromatriz. Quando adicionamos neutrófilos à micromatriz, eles formaram enxames estáveis ao redor dos aglomerados de biopartículas. Através do rastreamento da migração de neutrófilos, descobrimos que os neutrófilos migram ativamente para os aglomerados de biopartículas. Além disso, usamos esta plataforma para analisar certos mediadores que os neutrófilos liberam durante o enxame. Encontramos 16 mediadores que são expressos diferencialmente durante o enxame. Suas concentrações seguem três tendências gerais ao longo do tempo: aumento, diminuição ou pico. Nossa plataforma de aquecimento de neutrófilos in vitro facilita a análise do enxame de neutrófilos humanos controladoespacialmente, bem como a coleta e análise de mediadores liberados pelo swarming de neutrófilos. Em uma publicação anterior, demonstramos que pacientes com determinadas condições médicas (trauma, doença autoimune e sepse), tinham neutrófilos que funcionavam de forma diferente daqueles de doadores saudáveis⁵. Em estudos futuros, nossa plataforma poderia ser usada para analisar a função neutrófilo entre uma variedade de populações de pacientes. Esta plataforma pode analisar quantitativamente a complexa coordenação envolvida no aquecimento de neutrófilos. Estudos adicionais podem ser feitos para fornecer informações sobre a função neutrófilo de uma população específica de pacientes ou resposta neutrófilo a um patógeno de interesse.

Protocolo

Os autores reconhecem os voluntários saudáveis que gentilmente doaram seu sangue. Os amostras de sangue foram obtidos após o consentimento voluntário informado de acordo com o protocolo do Conselho de Revisão Institucional (IRB) #2018H0268 revisado pelo Comitê de Ciências Biomédicas da Universidade Estadual de Ohio.

1. Microfabricação da micromatriz de biopartículas

1. Utilizando procedimentos padrão de fotolitografia, gere o mestre wafer de silício.
   1. Gere uma prova do design desejado usando um software de design auxiliado por computador (CAD) e envie para um fabricante de fotomáscaras para produzir uma fotomáscara cromada. O design utilizado aqui é de 4 mm x 4 mm matrizes retangulares de 30 μm de diâmetro preenchidas em círculos com um espaçamento centro-a-centro de 150 μm. Este design pode ser modificado como desejado para diferentes aplicações.
   2. Spincoat uma camada de 40 μm de espessura de uma foto negativa resista a um wafer de silício. Asse wafer a 65 °C por 5 min e 95 °C por 10 min.
   3. Exponha wafer à luz UV através de uma fotomáscara cromada com 150-160 mJ/cm² (Figura 1A).
   4. Asse wafer a 65 °C para 5 min e 95 °C por 10 min. Submersa em desenvolvedor de fotoresist por 10 min e enxágue com álcool isopropílico. Nesta fase, o padrão deve ser visível no wafer (Figura 1B).
2. Misture completamente uma razão 10:1 de pré-polímero polidimetilexiano e seu agente de cura (ou seja, 20 g de pré-polímero e 2 g de agente de cura) e despeje a mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) não curada sobre o wafer mestre em uma placa de Petri (Figura 1C).
3. O vácuo trata a mistura de PDMS não curada até que não haja bolhas de ar sobre o wafer mestre. Cure a 65 °C durante a noite.
4. Use um bisturi para cortar ao redor do exterior da seção padronizada do wafer, e remova lentamente a laje de PDMS curada. Coloque a laje do PDMS em uma tábua de corte limpa com o lado estampado voltado para cima (Figura 1D).
5. Soque selos individuais da laje do PDMS com um soco de biópsia de 8 mm(Figura 1E). Para um slide de vidro, serão necessários oito selos.
6. Coloque cada selo de bruçado na fita adesiva para remover quaisquer detritos.
7. Com antecedência, prepare uma solução de 1,6 mg/mL de CP na água.
   1. Adicione a quantidade adequada do pó CP à água (por exemplo, de 0,8 g a 500 mL).
   2. Misture em uma placa de agitação à temperatura ambiente durante a noite, ou até que todo o sólido seja dissolvido na água. A solução CP pode ser armazenada em temperatura ambiente por 6 meses.
   3. Se desejar, torne a solução CP fluorescente adicionando poli-L-lysine rotulada com fluorescenina isothiocyanata (PLL-FITC).
      1. Aliquot cerca de 10 mL da solução CP. Adicione uma pequena quantidade de PLL-FITC (0,05 mg) ao volume alicitado. A quantidade pode ser alterada para ajustar o brilho da fluorescência conforme desejado.
      2. Vortex a solução CP rotulada com FITC para 20 s, ou até que a solução seja uma cor amarela uniforme e pálida. Proteja-se da luz e armazene a 4 °C por até 1 mês.
8. Com os selos de face-up, prime cada selo com 100 μL de 1,6 mg/mL solução de CP, garantindo que não se forme bolhas de ar entre a solução CP e o carimbo (Figura 1F).
9. Inverta os selos em uma camada de solução CP (Figura 1G).
10. Remova os selos da solução CP após 1h.
11. Dab cada carimbo molhado de frente para um slide de vidro limpo 6-8x para remover o excesso de líquido.
12. O vácuo trata os selos por 1-2 min.
13. Adere um espaçador de imagem de oito poços e 9 mm de diâmetro na parte superior de um slide de vidro limpo como guia para colocação de selos. Com este espaçador, cada escorregador de vidro pode ter oito micromatrizes.
14. Coloque um carimbo de frente para baixo no escorregador de vidro no centro de cada poço do espaçador de imagem (ou seja, use oito selos no total).
15. Coloque um peso equilibrado de 5,6 ± 0,1 g em cima de cada selo e deixe 10 min para estampagem(Figura 1H). Um peso equilibrado é necessário para garantir que o carimbo seja pressionado uniformemente para o slide de vidro e promover até mesmo a transferência do CP para o escorregador de vidro.
16. Remova os pesos e selos do slide de vidro (Figura 1I). Deixe a camada CP secar à temperatura ambiente por 24 h antes de adicionar as biopartículas, conforme descrito na etapa 1.17. Se o CP for marcado com FITC, a eficácia da estampagem pode ser verificada neste momento com um microscópio fluorescente de 488 nm antes de prosseguir para a etapa 1.17 (Figura 1M).
17. Corte uma placa de PDMS em branco para o tamanho do espaçador de imagem e use o soco de biópsia de 8 mm para criar poços no PDMS que se alinham com os poços de um espaçador de imagem. Adere a laje do PDMS ao slide de vidro com o espaçador de imagem(Figura 1J).
18. Descongele uma solução de biopartículas (por exemplo, E. coli ou zymosan) e dilua até 500 μg/mL em água para injeção (WFI).
    NOTA: As biopartículas não precisam ser opsonizadas. Receptores de superfície nutronéfilo reconhecem diretamente moléculas nessas partículas^19,20,21.
19. Adicione 100 μL de solução de biopartículas a cada PDMS bem no slide de vidro(Figura 1K).
20. Ame a lâmina de vidro por 30 min.
21. Enxágüe os poços completamente com água. A micromatriz de biopartículas pode ser armazenada em um ambiente livre de poeira a 4 °C por até 3 meses. Neste ponto, o padrão deve ser verificado com um microscópio fluorescente de 594 nm antes de seguir para a etapa 2.1 (Figura 1N).

2. Preparação de amostras

1. Colete pelo menos 2 mL de sangue fresco em tubos K2-EDTA do doador desejado. O rendimento esperado de neutrófilos é de 1-2 x 10⁶ células/1 mL de sangue inteiro. O ensaio por imagem requer aproximadamente 1,5 x 10⁵ neutrófilos, e a análise do supernatante requer 1 x 10⁶ neutrófilos. Use o sangue dentro de 4 h.
2. Separe glóbulos vermelhos (RBCs) adicionando um agente de agregação de eritrócitos em uma proporção de 1:5 para todo o sangue. Espere 45 min por uma camada translúcida (casaco buffy) para se separar da camada de RBCs.
3. Retire o casaco de buffy e lave com salina tampão de fosfato (PBS) usando 1 mL buffy coat: 9 mL PBS.
4. Centrífuga por 5 min a 190 x g e 20 °C.
5. Aspirar o supernatante e resuspender a pelota em 5 x 10⁷ células/mL.
6. Use um kit de seleção imunomagnética negativa para isolar neutrófilos.
   1. Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos/1 mL suspensão celular. Espere 10 min.
   2. Adicione 100 μL de suspensão de células magnéticas/1 mL. Espere 10 min.
   3. Adicione a suspensão da célula a um tubo de fundo redondo e coloque em um ímã cilíndrico. Espere 10 min.
7. Despeje supernatant em um tubo de centrífuga. Adicione até 10 mL da PBS. Centrífuga por 5 min a 190 x g e 20 °C.
8. Supernatant aspirado. Resuspender a pelota branca no IMDM com 0,4% de albumina de soro humano.
9. Núcleos de manchas com 20 μg/mL Hoechst 33342 por 10 min a 37 °C.
10. Adicione 5 mL de IMDM com 0,4% de albumina de soro humano para enxaguar. Centrífuga por 5 min a 190 x g e 20 °C.
11. Resuspender as células a 7,5 x 10⁵ células/mL no IMDM com 0,4% de albumina de soro humano.
12. Adicione 100 μL da suspensão celular a um poço PDMS contendo uma micromatriz de biopartículas. Certifique-se de que a suspensão celular seja convexa sobre o topo do PDMS bem e não contenha bolhas.
13. Veda com um deslizamento de cobertura de 12 mm de diâmetro. Cubra bem a abertura do PDMS com um deslizamento de cobertura de 12 mm de diâmetro. Pressione suavemente para o deslizamento de cobertura com pinças para que o excesso de suspensão celular escape até a borda do poço. Use um tecido para remover o excesso de suspensão celular.

3. Executando o ensaio e análise de imagem

1. Carregar matriz de micropartículas com células na estação de imagens de células vivas com um microscópio equipado com uma incubadora de gaiola situada em 37 °C, 5% CO₂e 90% umidade relativa.
2. Use microscopia fluorescente e de campo brilhante para gravar imagens a cada 10x de ampliação a cada 10 s a 405 nm, 594 nm e brightfield. Em um experimento típico, as imagens são coletadas até 2 h.
3. Use um software automatizado de rastreamento celular para rastrear a migração de neutrófilos individuais em direção ao cluster de biopartículas.
   1. Use o modo de autoregressão de um software de rastreamento de células de detecção de ponto. Defina o raio da mancha para 5 μm (o tamanho aproximado de um núcleo neutrófilo). Defina o comprimento mínimo da faixa para 120 s e um tamanho máximo de intervalo de um quadro.
   2. A partir dos dados gerados pelo software de rastreamento celular, extraios os arquivos que contêm a posição e a velocidade do nêutron. Esses arquivos podem ser usados com um software de grafografia para gerar faixas de migração de nêutrons(Figura2C)e um mapa de calor de velocidade versus tempo(Figura2D),respectivamente.
4. Use as imagens fluorescentes de 405 nm para rastrear o tamanho do enxame ao longo do tempo em um software de análise de imagem de sua escolha.
   1. Defina regiões de interesse (ROIs) em torno de cada aglomerado de biopartículas onde os neutrófilos se aglomerarão. Mantenha o mesmo tamanho ROI para analisar cada aglomerado de biopartículas.
   2. Analise a intensidade fluorescente média das imagens de 405 nm dentro de cada ROI ao longo do tempo.
   3. Gere uma curva de calibração de intensidade fluorescente média ao tamanho do enxame, fazendo medições manuais em vários tamanhos de enxame de 0 μm² ao tamanho máximo do enxame. Use esta calibração para calcular o tamanho do enxame ao longo do tempo.

4. Coleção supernatant e detecção de proteínas

1. Incubar os neutrófilos nos poços contendo a micromatriz de biopartículas a 37 °C e 5% co₂ por 3 h. Pegue amostras nos pontos de tempo desejados. Normalmente, as amostras serão colhidas às 0, 0,5, 1 e 3h. Para superar o limite de detecção do ensaio da matriz proteica, todo o volume de supernatant de um único poço (200 μL) foi usado para cada ponto de tempo. Cada ponto de tempo foi analisado em triplicado.
2. Usando um microscópio de campo brilhante, verifique se os enxames são formados na micromatriz.
3. Aspirar o supernatant com uma pipeta de 200 μL e carregar em um tubo de filtro de centrífuga de 0,45 μm.
4. Centrífuga o supernatante em 190 x g e 20 °C por 5 min e coletar o volume filtrado.
5. Armazene amostras a -80 °C até o horário de processamento.
6. Use um kit de micromatriz que detecta uma gama de proteínas humanas para processar amostras.
   1. Adicione 200 μL de cada amostra a um tubo de diálise separado fornecido com o kit.
   2. Coloque os tubos de diálise em um béquer contendo pelo menos 500 mL de PBS (pH = 8,0). Mexa delicadamente em uma placa de agitação por pelo menos 3 h a 4 °C. Mude o PBS no béquer e repita este passo.
   3. Transfira cada amostra para um tubo de centrífuga limpa e centrífuga em 9.000 x g por 5 min para remover quaisquer precipitados. Transfira cada supernatante para um tubo limpo.
   4. Biotinylate cada amostra adicionando 36 μL de reagente de rotulagem de 1x do kit por 1 mg de proteína total na amostra dialisada a 180 μL de amostra dialisada. Incubar a 20 °C por 30 min. Misture suavemente a cada 5 min.
   5. Adicione 3 μL de solução de parada fornecida com o kit em cada tubo de amostra. Transfira cada amostra para um tubo de diálise fresco e repita as etapas 4.6.2-4.6.3. Nesta fase, a amostra pode ser armazenada a -20 °C ou -80 °C até que você esteja pronto para prosseguir.
   6. O escorregador de vidro fornecido com o kit é armazenado a -20 °C. Deixe-o chegar à temperatura ambiente. Coloque o escorregador de vidro montado em um capô de fluxo laminar por 1-2h à temperatura ambiente.
   7. Adicione 400 μL do buffer de bloqueio fornecido com o kit em cada poço do slide de vidro montado. Incubar a temperatura ambiente por 30 min.
   8. Centrífuga as amostras preparadas para 5 min a 9.000 x g para remover precipitados ou partículas. Diluir 5x com tampão de bloqueio.
   9. Remova o tampão de bloqueio de cada poço. Adicione 400 μL das amostras diluídas nos poços apropriados. Incubar por 2h à temperatura ambiente enquanto balança.
   10. Decante as amostras de cada poço. Lave 3x com 800 μL do tampão de lavagem de 1x que forneci com o kit em temperatura ambiente por 5 min cada enquanto balançava.
   11. Em um recipiente limpo, submerga o escorregador de vidro montado em 1x tampão de lavagem I. Lave 2x à temperatura ambiente por 5 min cada enquanto balança.
   12. Adicione 400 μL de 1x streptavidin conjugado cy3 a cada submatriz. Cubra com tiras de adesivo de plástico. Proteja-se da luz para o restante do protocolo.
   13. Incubar por 2h à temperatura ambiente enquanto balança.
   14. Decante a solução e desmonte o deslizamento de vidro das câmaras de amostra.
   15. No tubo centrífuga de 30 mL fornecido com o kit, adicione cuidadosamente o escorregador de vidro e o buffer de lavagem suficiente de 1x I para cobrir o escorregador de vidro. Lave 3x por 10 min cada à temperatura ambiente enquanto balança.
   16. No tubo centrífuga de 30 mL, lave 2x com 1x tampão de lavagem II por 5 min cada uma à temperatura ambiente enquanto balança.
   17. Lave o slide de vidro com 30 mL de ddH₂O por 5 min. Remova o deslizamento de vidro do tubo de centrífuga e deixe secar por 20 min em capô de fluxo laminar. O slide de vidro preparado pode ser armazenado a -20 °C até estar pronto para escanear.
   18. Escaneie o deslizamento de vidro com um scanner de micromatriz em uma emissão de fluorescência de 555 nm.

Resultados

Quando os neutrófilos são adicionados à micromatriz de biopartículas, os neutrófilos que entram em contato com os clusters de biopartículas se ativam e iniciam a resposta ao enxame. A micromatriz de biopartículas foi validada usando microscopia fluorescente de lapso de tempo para rastrear a migração de neutrófilos para os clusters de biopartículas(Vídeo S1). A migração de núcleos de neutrófilos individuais é rastreada à medida que migram para o aglomerado de partículas. Quando os neutr...

Discussão

Desenvolvemos uma plataforma de microestampagem para gerar matrizes uniformes de biopartículas para estimular o aquecimento in vitro de neutrófilos. A natureza in vitro de nossa plataforma nos permite contornar as complicações que surgem com experimentos in vivo, ou seja, a má capacidade de analisar mediadores liberados por neutrófilos⁵. Além disso, os modelos vivos são tipicamente realizados em roedores^11,12,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18001	Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator	Okolab	777057437 / 77057343	Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17957	Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2	Nikon Instruments	MEA54010 / MEF55037	Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch	Sigma Aldrich	Z708925	To cut PDMS stamps
HetaSep	STEMCELL Technologies	7906	Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array	Raybiotech Inc.	AAH-BLG-1000-4	High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA)	Sigma Aldrich	A5843	Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053	To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes	Thermo Fisher Scientific	02-657-32	Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask	Front Range Photomask	N/A	Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner	Perkin Elmer	ASCNGX00	Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris	Bitplane	9.3.0	Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package	Nikon Instruments	MQS31100	Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)	Sigma Aldrich	P3069-10MG	30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer	Grace Bio-Labs	654008	8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer	University Wafer	590	Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater	Laurell	WS-650MZ-23NPPB	Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025	MicroChem	2025	Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer	MicroChem	Y020100	Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)	Dow	1673921	2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System	Kloé	UV-KUB 2	Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water	Thermo Fisher Scientific	A1287303	High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185	BASF	8185	Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate	Invitrogen	Z2843	Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array