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Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para o aumento in vivo da ininvitro-homing indução de células T regulamentares. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir localmente altas concentrações da vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e a vitamina A ativa (ácido retinoico ou AR) de novo.

Resumo

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa. Recentemente, mostramos que as células reguladoras t (Treg) são uma terapia promissora para a DII. Assim, este artigo apresenta um protocolo para o aumento in vivo da indução da pilha de Treg gut-homing. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo, vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e vitamina a-ida ativa (ácido retinóico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e AR com base em descobertas anteriores mostrando que 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeça de garfo P3 e interleucina-10) e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal nas células T. Para gerar tais células dendríticas projetadas, usamos um vetor lentiviral para transduzir células dendríticas para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase, que fisiologicamente catalisa a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 que codifica retinaldeído dehidrogenase 2, que fisiologicamente catalisa a síntese de AR. Este protocolo pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.

Introdução

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa1,2. Por esta razão, atualmente disponíveis E.U. Food and Drug Administration (FDA) medicamentos aprovados inibem as funções dos mediadores inflamatórios ou bloquear o homing de células imunes no intestino. No entanto, os mediadores inflamatórios e células imunes que são alvo também são necessários para defesas imunológicas. Como resultado, os inibidores do mediador inflamatório comprometem a defesa imunológica sistêmica e os bloqueadores de homing de células imunes enfraquecem a defesa imunológica do intestino, ambos os quais podem levar a graves conseqüências3,4. Além disso, os bloqueadores de homing de células imunes também podem bloquear o homing de células reguladoras T (Treg) no intestino e, portanto, pode piorar a tolerância imune do intestino já comprometida em pacientes com DII. Além disso, o bloqueio de células Treg homing no intestino também pode levar à supressão imunológica sistêmica devido ao acúmulo de células Treg no sangue5. Finalmente, inibidores e bloqueadores funcionam de forma transitória e, assim, exigem administrações frequentes. A administração freqüente desses inibidores e bloqueadores pode exacerbar ainda mais os efeitos colaterais desagradáveis.

Recentemente, propusemos uma nova estratégia que pode potencialmente mitigar ou até mesmo eliminar os efeitos colaterais associados com medicamentos atuais para o tratamento de DII6. Esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing em tecidos linfóides periféricos6. A lógica desta estratégia é que as células Treg gut-homing especificamente lar do intestino e, portanto, não irá comprometer as defesas imunológicas sistêmicas. Além disso, uma vez que as células Treg podem potencialmente formar memória7,8,células Treg gut-homing pode potencialmente fornecer um controle estável da inflamação crônica do intestino em pacientes com DII e, assim, o tratamento não deve precisar ser administrado com tanta freqüência. Além disso, uma vez que esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing in vivo, não tem a preocupação de instabilidade in vivo em um ambiente altamente pró-inflamatório que está associado com a transferência adotiva de células Treg geradas in vitro9,10. A este respeito, as células Treg in vitro geradas são uma das estratégias propostas para o tratamento de doenças autoimunes11,12,13 e rejeição de transplante14,15. Finalmente, nesta estratégia, as células dendríticas (DCs) são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo: vitamina D ativa (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) e vitamina ativa A (ácido retinoico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e RA porque 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeceira P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal em células T18. Porque ambos 1,25 (OH)2D e RA também podem tolerizar DCs28,29, razão que os DCs projetados serão mantidos de forma evigorada em um status tolerogênico in vivo e,portanto,contornar as preocupações de instabilidade in vivo que estão associados com DCs tolerogenic in vitro gerados (TolDCs)19,20,21. A este respeito, toldcs também são uma das estratégias propostas para in vivo aumento das funções celulares Treg19,20,21. Para apoiar o nosso raciocínio, mostramos que os DCs projetados, após a entrega in vivo, podem aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos6.

Uma vantagem adicional de nossa estratégia proposta é que 1,25 (OH)2D também tem outras funções que podem beneficiar potencialmente pacientes com DII. Essas outras funções incluem a capacidade de 1,25 (OH)2D para estimular a secreção de antimicrobianos22 e suprimir a carcinogênese23. Infecções e cânceres são freqüentemente associados à DII24,25.

Para gerar os DCs que podem produzir concentrações localmente altas de 1,25 (OH)2D e RA de novo, usamos um vetor lentiviral para projetar DCs para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase (1α-hidroxilase), que catalisa fisiologicamente a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 (ALDH1a2) que codifica retinaldeído dehidrogenase 2 (RALDH2), que fisiologicamente catalisa a síntese de RA6.

Como o aumento in vivo da inin vivo de indução de células Treg de homing intestinal é potencialmente importante no tratamento da DII, no seguinte protocolo, detalharemos os procedimentos para a geração das DCs de 1α-hidroxilase-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.

Protocolo

Todos os protocolos in vivo de estudo animal foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Loma Linda (IACUC), bem como pelo Animal Care and Use Review Office (ACURO) do Comando de Pesquisa médica e Material do Exército dos EUA (USAMRMC) do Departamento de Defesa.

1. Preparação do Lentivirus que expressa 1α-hydroxylase e RALDH2 (vírus lenti-CYP-ALDH)

  1. Dia 0: No início da manhã, prepare 5 x 105 células/mL de células 293T no meio de cultura celular CM-10-D.
  2. Semente 20 mL/prato em pratos de cultura de 150 mm x 25 mm. Cultura as células em 37 °C e 5% CO2 para 24 h. Confluência vai chegar a ~ 80-90% após 24 h.
  3. Dia 1: Faça 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl e 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquot e armazenar a -20 °C.
  4. Faça 2 M CaCl2 e guarde à temperatura ambiente.
  5. Para cada prato de cultura de 150 mm x 25 mm, prepare uma mistura de precipitação de DNA em um tubo de cultura estéril de 50 mL. Primeiro, adicione 1.620 μL de 2x HBS, 9,5 μg de PMD2G (VSVG), 17,5 μg de pCMVR8.74 (Capsid), 27 μg de Lenti-CYP-ALDH plasmid (um vetor lentiviral que transporta cyp27b1 e ALDH1a2). Em segundo lugar, adicione o H2O a um volume final de 3.037,5 μL.
  6. No último, adicione 202,5 μL de 2 M CaCl2 dropwise ao misturar a solução para concentrações finais de 1x HBS e 125 mM CaCl2. CaCl2 deve ser o último a ser adicionado. Deixe as misturas de transfecção à temperatura ambiente por 20 min com mistura ocasional. Para vários pratos de cultura de 150 mm x 25 mm, a uscale em conformidade.
  7. Adicione os 3.240 μL da mistura da precipitação do ADN dropwise a um prato da cultura de 150 mm x 25 milímetros que contem as pilhas 293T. Delicadamente redemoinho o prato cultura lado a lado, acrescentando a mistura de precipitação de DNA. Incubar o prato em 37 °C e 5% CO2 para 24 h.
  8. Dia 2: Retire a solução de transfecção de fosfato de cálcio, lave suavemente com 1x PBS e realiça a cultura celular com meio de cultura celular CM-4-D. Incubar as células a 37 °C e 5% CO2 para 24 h.
  9. Dia 3: Colha as supernatantes em garrafas de armazenamento estéreis e guarde a 4-8°C. Reabastecer a cultura celular com o novo meio de cultura de células CM-4-D. Cultura as células em 37 °C e 5% CO2 para mais 24 h.
  10. Dia 4: Colha as supernatantes em garrafas de armazenamento estéreis. Filtre os supernatants do dia 3 e do dia 4 através de um filtro de 0,45 μm. Para concentrar o vírus pseudotipo VSVG, transfira as supernatantes para tubos de centrífuga e gire a 4.780 x g para 24 h a 4 °C.
  11. Dia 5: Despeje os supernatants fora das pelotas (a pelota é muitas vezes visível) e permitir que os tubos para drenar em uma toalha de papel em um armário de biossegurança estéril por vários minutos.
  12. Resuspenda as pelotas por pipetting com PBS estéril contendo 5% glicerol. O volume de resuspensão será de 33,3 μL por prato de cultura de 150 mm x 25 mm.
  13. Aliquot 200 μL/tubo e armazenar a -80 °C. Faça um alibamento separado de 50 μL/frasco para fins de titration. Os titers devem estar dentro da escala de 108-109 unidades transducing (TUs)/mL.
  14. Adicione a lixívia nos pratos de cultura e descartá-los.
    NOTA: Estas células transfeccionadas são a maior preocupação de segurança no protocolo, uma vez que todos os elementos lentivirais são expressos nas células.

2. Geração de DCs derivados da medula óssea (BMDCs)

  1. Tibias colheita e fêmures de 4-5 ratos Balb / c em um tubo de polipropileno estéril de 50 mL contendo o meio de cultura6.
  2. Transfira o tibias e os fêmures em um prato da cultura de 100 mm x 20 mm que contem o meio da cultura. Retire os tecidos, como os músculos do tibias e fêmures usando tesoura dissecando e fórceps.
  3. Corte ambas as extremidades do tibias e fêmures para expor a cavidade da medula óssea.
  4. Desenhe 10 mL cultura média em uma seringa de 10 mL ligado a uma agulha de 30 G.
  5. Insira cuidadosamente a agulha na cavidade da medula óssea e lave a medula óssea em um tubo de polipropileno estéril de 50 mL limpo. Repita este procedimento, se necessário, para garantir que a medula óssea tenha sido completamente eliminada.
  6. Pelotas as células da medula óssea por centrífuga (400 x g)a 2-8 °C para 5 min. Aspirar o supernatant.
  7. Resuspenda a pelota com 5 mL de 1x de r$-teto de glóbulo vermelho.
  8. Incubar as células em temperatura ambiente por 4-5 min com agitação ocasional.
  9. Pare a reação adicionando 30 mL do meio da cultura.
  10. Pelotas as células por centrífuga (400 x g)em 2-8 °C para 5 min. Resuspender as células em 10 mL de CM-10-R meio de cultura celular. Se necessário, as células podem ser passadas através de um filtro de células de 40 μm para remover detritos.
  11. Executar uma contagem celular e ajustar as células para 1 x 106 células/mL usando cm-10-R célula si médio.
  12. Adicione fator estimulante recombinante de granulócito de murine/macrofago (GM-CSF, concentração final = 100 U/mL) e interleucina-4 (IL-4, concentração final = 10 U/mL).
    NOTA: As soluções de ações da GM-CSF e IL-4 são armazenadas a -80 °C a 100.000 U/mL (1.000x) e 10.000 U/mL (1.000x), respectivamente.
  13. Distribua as células em 6 placas de cultura de poços a 4 mL/bem e cultura as células a 37 °C e 5% CO2 para 48 h.
  14. Remova as células não aderentes com tubulação suave.
  15. Adicione o novo meio de cultura de células CM-10-R contendo o GM-CSF (100 U/mL) e il-4 (10 U/mL). Cultura as células para mais 48 h.
  16. Colhe células não aderentes (BMDCs) para transdução pelo vírus lenti-CYP-ALDH.

3. Transdução de DCs com vírus lenti-CYP-ALDH para gerar células DC-CYP-ALDH

  1. Prepare 1 x 106 DCs/bem em um volume total de 0,5 mL de m-10-R de cultura celular médio contendo 50 μL de vírus e 8 μg/mL protamina em uma placa de cultura de 6 poços.
  2. Cultura as células em 37 °C e 5% CO2 para 24 h.
  3. Substitua o meio por um meio fresco de cultura de células CM-10-R e cultura as células em 37 °C e 5% CO2 para mais 24 h. Neste momento, as atividades enzimáticas de 1α-hidroxilase e RALDH2 podem ser avaliadas (ver passo 4). Se necessário, repita os passos 3,1-3,3 para uma segunda transdução.
  4. Adicione o lipopolissacarídeo (100 ng/mL) e cultura as células para 24 h.
  5. Colher as células (células DC-CYP-ALDH) para experimentos.

4. Avaliação das 1α-hidroxilase superexpressa e RALDH2 nas células DC-CYP-ALDH

  1. Avaliação do 1α-hidroxilase superexpressa em células DC-CYP-ALDH
    1. Semente 1.0 x 106 células DC-CYP-ALDH/bem em 2 mL de mL de m-10-R de cultura celular em 12 placas de cultura de poços.
    2. Adicione 25 (OH)D à concentração final de 2,5 μM. Incubar as células DC-CYP-ALDH por 24 h.
    3. Colher os supernatants e armazenar a -20 °C.
    4. Ensaio para 1,25 (OH)2D concentrações nos supernatants usando um radioimmunoassay comercialmente disponível (RIA) (ver Tabela de Materiais).
    5. Determine a expressão de 1α-hidroxilase nas células DC-CYP-ALDH por triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) usando um anticorpo anti-CYP27B1.
  2. Avaliação do RALDH2 superexpressa nas células DC-CYP-ALDH
    NOTA: A expressão e atividade do RALDH2 superexpressa são determinadas usando um kit de detecção de aldeído dehidrogenase comercial (ALDH) (ver Tabela de Materiais).
    1. Semente 1 mL de DC-CYP-ALDH ou células de controle (1 x 105 células/mL no buffer de ensaio) em cada um dos dois tubos de 5 mL (um rotulado como "Controle" e o outro rotulado como "Teste").
    2. Adicione 10 μL de solução diethylaminobenzaldeída (DEAB) (1,5 mM em 95% etanol) a cada um dos tubos de controle e misture imediatamente. Deab é um inibidor RALDH2.
    3. Adicione 5 μL de substrato de fluorescência RALDH ativado (300 μM) aos tubos de controle e teste e misture imediatamente.
    4. Incubar os tubos por 45 min.
    5. Pelotas as células por centrífuga em 400 x g em 2-8 °C para 5 min. Aspirar os supernatants.
    6. Reconstitua as células em 200 μL de buffer de ensaio.
    7. Mantenha as células no gelo e proceder para análise pela FACS.

Resultados

As células DC-CYP-ALDH expressaram um aumento significativo na quantidade de 1α-hidroxilase. Para determinar se as células DC-CYP-ALDH geradas a partir de BMDCs expressaram um aumento significativo da quantidade de 1α-hidroxilase, os BMDCs foram transinduzidos com o vírus lenti-CYP-ALDH para produzir células DC-CYP-ALDH derivadas de medula óssea (células BMDC-CYP-ALDH). Posteriormente, as células BMDC-CYP-ALDH foram examinadas para a expressão de 1α-hidroxilase pela FACS. Nossos dados mostrara...

Discussão

Neste artigo descrevemos o uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos. Nossos dados mostraram que as células DC-CYP-ALDH podem sintetizar concentrações localmente altas de novo de 1,25 (OH)2D e AR in vitro na presença de substratos correspondentes (ou seja, 25[OH]D e retinol, respectivamente). Porque concentrações sanguíneas suficientes de 25 (OH) D e retinol podem ser facilmente alcançadas através de suplementaçõe...

Divulgações

Os Drs. Xiaolei Tang e David J. Baylink são inventores de uma patente pendente relacionada a este estudo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Escritório do Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde através do Peer Reviewed Medical Research Program no âmbito do Prêmio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este trabalho também foi parcialmente apoiado por Bolsas de Inovação em Pesquisa do Departamento de Medicina da Universidade de Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT], e 325491 [DJB]).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL syringesThermoFisher ScientificCat# 03-377-23
100 mm x 20 mm culture dishesSigma-AldrichCat# CLS430167
12-well culture platesThermoFisher ScientificCat# 07-200-82
150 mm x 25 mm culture dishesSigma-AldrichCat# CLS430559
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)Sigma-AldrichCat# H4014
293T cellsATCCCRL-3216
2-mercaptoethanolThermoFisher ScientificCat#: 21985023
6-well culture platesThermoFisher ScientificCat# 07-200-83
ALDEFLUOR kitStemcell TechnologiesCat# 01700
Anti-CYP27B1AbcamCat# ab95047
BD FACSAria IIBD BiosciencesN/A
CaCl2Sigma-AldrichCat# C1016
CM-10-D cell culture mediumDMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-10-R cell culture mediumRPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-4-D cell culture mediumDMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mLSigma-AldrichCat# CLS430513
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mLSigma-AldrichCat# CLS430514
Dissecting scissorThermoFisher ScientificCat# 08-940
DMEM mediumThermoFisher ScientificCat# 11960044
Fetal bovine serumThermoFisher ScientificCat# 16000044
ForcepsThermoFisher ScientificCat# 22-327379
Gibco ACK lysing bufferThermoFisher ScientificCat# A1049201
GlycerolSigma-AldrichCat# G5516
Goat anti-rabbit IgGAbcamCat# ab205718
HEPESMilliporeCat# 391340
Lenti-CYP-ALDHCustom-made1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.
L-glutamineThermoFisher ScientificCat#25030081
LipopolysaccharideSigma-AldrichCat# L3755
Murine GM-CSFPeprotechCat# 315-03
Murine IL-4PeprotechCat# 214-14
Na2HPO4Sigma-AldrichCat# NIST2186II
NaClSigma-AldrichCat# S9888
NeedlesThermoFisher ScientificCat# 14-841-02
Nonessential Amino AcidsThermoFisher ScientificCat#: 11140076
pCMVR8.74AddgenePlasmid# 22036
Penicillin/StreptomycinThermoFisher ScientificCat#15140148
Phoshate Balanced Solution (PBS)ThermoFisher ScientificCat#: 20012027
PMD2GAddgenePlasmid# 12259
Polypropylene tube, 15 mLThermoFisher ScientificCat# AM12500
Polypropylene tube, 50 mLThermoFisher ScientificCat# AM12502
Protamine sulfateSigma-AldrichCat# P3369
Rabbit polycloncal IgG isotype controlAbcamCat# ab171870
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurementHeartland Assays
RPMI 1640 medium, no glutamineThermoFisher ScientificCat# 21870076
Sodium pyruvatThermoFisher ScientificCat#: 11360070
Sorvall Legend XTR CentrifugeThermoFisher ScientificCat# 75004521
Sterile Cell strainers, 40 mmThermoFisher ScientificCat# 07-201-430
Sterile storage bottles, 500 mLThermoFisher ScientificCat# CLS431432

Referências

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