Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos

Resumo

Este protocolo demonstra o registro em tempo real de relações completas de resposta a dose para ativação gpcr induzida por agonista a partir de uma única camada celular cultivada em um único microeletrodo usando medidas de impedância sem rótulo. O novo esquema de dosagem aumenta significativamente o throughput sem perda na resolução de tempo.

Resumo

Ensaios baseados em impedância sem rótulos são cada vez mais usados para estudar contraato sinuoso ativado rGP em experimentos de cultura celular. A abordagem fornece monitoramento celular em tempo real com uma resolução de tempo dependente do dispositivo até várias dezenas de milissegundos e é altamente automatizada. No entanto, quando os números de amostra ficam altos (por exemplo, estudos de dose-resposta para várias ligas diferentes), o custo para as matrizes de eletrodos descartáveis, bem como a resolução de tempo disponível para gravações sequenciais bem-por-bem podem se tornar limitadoras. Portanto, apresentamos aqui um protocolo de adição agonista em série que tem o potencial de aumentar significativamente a produção de ensaios GPCR sem rótulos. Usando o protocolo de adição agonista serial, um agonista gpcr é adicionado sequencialmente em aumentar as concentrações em uma única camada celular enquanto monitora continuamente a impedância da amostra (modo agonista). Com essa abordagem serial, agora é possível estabelecer uma curva completa de resposta de dose para um agonista GPCR de apenas uma camada de célula única. O protocolo de adição agonista serial é aplicável a diferentes tipos de acoplamento GPCR, G_q G_i/0 ou G_s e é compatível com níveis de expressão recombinantes e endógenos do receptor em estudo. O bloqueio de receptores por antagonistas gpcr também é avaliado (modo antagonista).

Introdução

Este relatório apresenta uma descrição detalhada de um protocolo de adição serial desenvolvido para a quantificação da ativação do receptor acoplado por proteínaG induzida por ligand (GPCR) em células cultivadas aderentamente por medições de impedância sem rótulo. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) estão envolvidos em uma infinidade de funções fisiológicas e doenças humanas¹. Por causa disso e sua boa acessibilidade na superfície celular, os GPCRs são um dos alvos mais importantes de drogas. Esta avaliação se reflete em um número estimado de ~700 medicamentos aprovados visando GPCRs, equivalente a uma participação de ~35% em todas as drogas comercializadas².

O desenvolvimento de novas drogas compreende dois processos centrais: (i) a identificação e caracterização funcional de moléculas-alvo biológicas, e (ii) a descoberta de novas substâncias de chumbo e seu desenvolvimento em drogas administradas. Em ambos os processos, métodos eficientes são necessários para avaliar quantitativamente as interações medicamentosas-alvo e a resposta biológica subsequente a jusante. Diferentes estágios do processo pré-clínico de desenvolvimento de medicamentos fazem uso de diferentes métodos de análise que vão desde estudos de interação biomolecular entre medicamentos e alvos, além de estudos funcionais sobre células na cultura, até experimentos sobre material de órgãos excizados ou animais inteiros. Tanto, a significância fisiológica quanto a complexidade biológica aumentam do primeiro para o último³. Embora seja o objetivo global de minimizar os experimentos com animais, estudos farmacológicos usando órgãos isolados de animais de laboratório ou mesmo animais inteiros são considerados inevitáveis para caracterizar de forma abrangente novos candidatos a medicamentos. Em termos de leitura analítica, estudos de farmacologia de órgãos fornecem uma resposta funcional distal e integrativa "holística" de maior relevância fisiológica. Uma desvantagem desses experimentos é que eles não são compatíveis com triagem de alto desempenho por razões técnicas e éticas e foram amplamente substituídos por estudos baseados na cultura celular in vitro⁴.

Métodos para quantificar a ativação do GPCR nas culturas celulares incluem diferentes ensaios químicos baseados em rótulos, que detectam especificamente segundo mensageiros, estado de fosforilação de proteínas de sinalização a jusante, ativação transcricional através de certos fatores de transcrição ou tráfico de receptor intracelular induzido por ligand^4,5. Uma desvantagem desses ensaios baseados em rótulos é a necessidade de rotular as células com corantes potencialmente prejudiciais ou marcadores radioativos. Isso muitas vezes requer executar o ensaio como uma determinação de ponto final para um tempo de exposição que tem que ser especificado um priori. O uso de ensaios de ponto final baseados em rótulos sofre desse timing muito limitado e tendencioso do experimento e do risco de que rótulos químicos e sondas possam interferir na fisiologia celular regular – potencialmente despercebida pelo experimentador.

Nos últimos anos, ensaios sem rótulos para monitoramento da ativação do GPCR surgiram, como técnicas baseadas em impedância ou métodos ópticos que aplicam grades ressonantes de guia de onda^5,6. A rotulagem das células não é experimentalmente necessária com essas abordagens. Como essas leituras físicas operam em sinais de baixa amplitude, tais métodos são considerados não invasivos, permitem o monitoramento contínuo celular potencialmente em tempo real e o tempo de observação é limitado apenas pela cultura celular não pela leitura. Semelhante às leituras de órgãos inteiros, abordagens sem rótulos comumente relatam respostas de células holísticas, muito a jusante da ativação do receptor quando a integração ao longo de toda a rede de sinalização leva a mudanças dependentes do tempo, mas sim inespecíficas na morfologia celular ou redistribuição em massa. Considerando que ensaios baseados em impeção medem a assinatura dielétrica de mudanças na forma celular^7,8, as medidas usando grades ressonantes de guia de onda são sensíveis a alterações no índice refrativo na interface do substrato celular decorrentes da redistribuição dinâmica de massa (DMR)⁹. O caractere integrativo torna os métodos livres de rótulos extremamente sensíveis aos eventos mediados por receptores, independentemente do tipo(s) de proteína G (G_q , G_i/0, G_12/13) ou β-arrestin envolvido na cascata de sinalização 6 e adequado para níveis endógenos de expressão do receptor.

Em um ensaio baseado em impedância sem rótulo padrão, as células são cultivadas em placas multi-bem com eletrodos de filme de ouro coplanar depositados na parte inferior de cada poço¹⁰. Essas matrizes de eletrodos estão conectadas a um analisador de impedância e as respostas das células a um estímulo experimental são registradas a partir de poços individuais por leituras de impedância resolvidas pelo tempo. Em um ensaio típico gpcr um ligand é adicionado em concentrações individualmente diferentes para cada bem individual. As alterações induzidas no curso de tempo de impedância são então analisadas em relação a características de curva característica, como mudança máxima de sinal, área a curva, mudança de sinal dentro de um determinado intervalo de tempo ou inclinação da curva em um ponto de tempo especificado, a fim de quantificar a potência e eficácia do ligand¹¹.

O custo das matrizes de eletrodos pode limitar a aplicação dessa técnica em campanhas de triagem de alto nível (HTS). Além disso, com o aumento do número de amostras a serem seguidas em paralelo, o número de medições individuais aumenta e, assim, reduz a resolução de tempo disponível para cada poço gradualmente - mesmo para gravações multicanais de última geração. Nessas condições, respostas rápidas e transitórias das células podem escapar da medição. Além disso, o convencional bem – uma abordagem de concentração impõe um fator de tempo e custo significativo sem recursos perfundidos em desenvolvimentos de órgãos-on-chip ou body-on-chip em relação à sua adequação na análise de interação ligand-GPCR.

Por essa razão, desenvolvemos um protocolo de dosagem stepwise que permite a gravação de curvas completas de resposta de dose da ativação gpcr induzida por ligand em monocamadas de células cultivadas, monitorando continuamente a impeância de um único poço enquanto a concentração agonista é aumentada stepwise. O protocolo de adição agonista em série aumenta significativamente o throughput por poço de uma concentração para 10 ou mais concentrações, como mostrado no exemplo atual das células U-373 MG humanas, que expressam endógenamente o receptor histamina 1 (H1R). Assim, o método tem o potencial de melhorar significativamente o throughput em estudos de dose-resposta sem rótulos, enquanto a resolução de tempo é mantida no máximo instrumental.

Protocolo

1. Semeade celular em matrizes de eletrodos

NOTA: A seleção do layout do eletrodo é uma troca entre sensibilidade e número de células em estudo. Quanto menor o eletrodo, mais sensível é a medida, mas menor é o número de células em estudo. Para as células que mostram fortes flutuações de impedância ao longo do tempo em condições de linha de base, eletrodos maiores ou interdigitados são preferíveis.

1. Pré-aqueça todas as soluções necessárias para a passagem e semeade padrão das células em um banho de água de 37 °C. Para ensaios com células U-373 MG humanas é preciso: salino tampão de fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio, 0,05% (w/v) trypsin, cultura celular média (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) suplementada com 5% (v/v) soro de bezerro fetal (FCS), 2 mM L-glutamina e 100 μg/mL penicilina/estreptomicina).
2. Enxágüe a camada celular da cultura do estoque cultivada na parte inferior da cultura celular convencional frascos ou pratos com PBS duas vezes.
3. Remova o PBS, adicione a solução de trippsina (1 mL para 25 cm²) e deixe as células incubarem a 37 °C por 5 min (aplica-se às células U-373 MG).
4. Controle para o distanciamento completo das células do fundo do substrato de crescimento por microscopia.
5. Pare a reação da trippsina assim que as células estiverem completamente separadas adicionando 9 mL de cultura celular média por 1 mL de trippsina à suspensão celular. Enxágue cuidadosamente as células remanescentes do fundo do substrato da cultura celular, canalizando a suspensão sobre o substrato.
6. Colete a suspensão celular com uma pipeta e transfira-a para um tubo de centrífuga (tubo de 15 mL ou 50 mL).
7. Gire as células por centrífuga a 110 x g por 10 min à temperatura ambiente.
8. Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda completamente a pelota celular em meio de cultura antes de contar as células (por exemplo, usando um hemacyômetro para microscópios de contraste de fase e contagem manual).
9. Ajuste a suspensão celular à densidade celular desejada. Para experimentos com células U-373 MG, use 100 000 células/cm² para cultivar uma camada celular de confluente dentro de 48 h. Isso se traduz em uma densidade celular de 200 000 células/mL para matrizes de eletrodos de 8 poços com uma área de crescimento de ~0,8 cm² e um volume de poço de 400 μL.
   NOTA: Para experimentos reprodutíveis de ativação gpcr, as células devem ser cultivadas em monocamadas confluentes nas matrizes de eletrodos. Para garantir a expressão adequada do receptor na superfície celular, as células devem ser semeadas pelo menos 36 h antes de realizar o experimento. Testar diferentes densidades celulares para semeadecelular é muitas vezes significativo para identificar as melhores condições experimentais.
10. Adicione a suspensão celular aos poços da matriz de eletrodos e deixe as vendas se acalmarem à temperatura ambiente por 10 a 15 min, a fim de garantir a distribuição homogênea das células na parte inferior dos poços.
11. Cultivar células por pelo menos 36 h em uma incubadora padrão de cultura celular com 5% de CO₂ (dependente do tipo médio) a 37 °C e atmosfera umidificada. Mude a cultura celular a 24 h antes do experimento.
12. No dia do experimento, inspecione as camadas celulares nas matrizes de eletrodos por microscopia de eletrodos por (contraste de fase) microscopia para garantir a cobertura completa de eletrodos com células.

2. Equilíbrio de células em meio soro-livre

1. Meio pré-quente sem soro, neste estudo: o meio L15 de Leibovitz.
2. Remova o meio de cultura celular das células cultivadas em matrizes de eletrodos e substitua por meio pré-aquecido sem soro. Use 200 μL para matrizes de eletrodos de formato 8-well e 150 μL para matrizes de eletrodos de 96 poços.
3. Deixe as células equilibrarem em meio soro livre de soro a 37 °C por pelo menos 2h. O tempo de equilíbrio depende fortemente do tipo celular. Por exemplo, as células U-373 MG precisam de 2h, as células CHO precisam de 4h, baec pode exigir equilíbrio noturno no meio L-15.
   NOTA: O meio L-15 é independente de CO₂ e requer uma atmosfera livre de CO_2. Para o equilíbrio em L-15, a incubadora de 0 % de CO₂. O equilíbrio pode ser monitorado por leituras de impedância, o que recomendamos fazer para os primeiros experimentos.

3. Monitoramento do equilíbrio celular com leituras de impedância

1. Coloque a matriz de eletrodos no suporte de matriz de conexão do analisador de impedance.
2. Certifique-se de um contato adequado de baixa impedância entre eletrodos e analisador de impedância. Esta verificação é individualmente diferente para diferentes instrumentos.
   NOTA: Se o instrumento não fizer conexão com os eletrodos, abra o grampo de contato novamente, reajuste a matriz de eletrodos para o posicionamento adequado dentro do suporte e a reformulação.
3. Selecione o formato de eletrodo e/ou multi-poço sitonada na interface do usuário do software.
4. Configure os parâmetros de medição. Diferentes opções estão disponíveis.
   NOTA: Para selecionar a frequência CA mais sensível, referimos-nos aos manuais de literatura e instrumento, pois depende do layout do eletrodo e do tipo celular em estudo. Normalmente, a frequência de sensoriamento está na faixa de 4 kHz – 50 kHz. Aqui, as células U-373 MG foram cultivadas em eletrodos de trabalho circular de 250 μm de diâmetro e foram monitoradas em uma frequência CA de 12 kHz.
   1. Se os modos de aquisição de dados de frequência única e múltipla estiverem disponíveis, selecione o modo de frequência única para garantir a resolução máxima do tempo. A medição será realizada nesta única frequência. Para os instrumentos mais difundidos, há uma série de frequências pré-definidas ao longo da janela de frequência disponível.
   2. Se o número de poços em estudo for baixo ou a resolução de tempo não for crítica, selecione gravações de várias frequências. As leituras de impedance em um número especificado de frequências serão registradas para todos os poços para análises posteriores em profundidade.
      NOTA: A resolução de tempo diminui com o aumento do número de frequências registradas por poço e o aumento do número de poços. As opções de seleção do modo de frequência e aquisição de dados variam de acordo com o tipo de instrumento e a versão.
5. Inicie a aquisição de dados do curso de tempo.
6. Siga a impedância da camada celular (pelo menos 2 h) até que a impedância tenha estabilizado. Enquanto isso, prepare as soluções agonistas.
7. Quando as camadas de células atingirem um nível estável de impedância, ou (i) proceder para a adição agonista em série dentro do mesmo experimento ou (ii) encerrar a aquisição de dados e iniciar um novo conjunto de dados para monitorar a ativação do receptor induzido por agonistas.

4. Preparação de soluções agonistas para experimentos em modo agonista

1. Calcule a concentração de soluções agonistas conforme necessário para cada etapa da dosagem em série de acordo com a equação (1). n varia de 1 ao número total de adições em série i. x denota concentração e volume no poço na etapa n. y denota concentração e volume da "solução a ser adicionada" na etapa n.

NOTA: Considere o número de réplicas e calcule o volume total de "solução a ser adicionada" para cada etapa de concentração. Os resultados de um cálculo típico são dados nas tabelas 1-4. É preciso uma ideia geral sobre a faixa de concentração agonista para ser estudada, pois a faixa define as concentrações e o número de porções a serem administradas durante a adição serial. Usando o protocolo de adição agonista serial, a concentração agonista é aumentada stepwise. Portanto, a quantidade de agonista já está no poço quando a próxima dose é adicionada tem que ser levada em conta. Quando o número de moléculas agonistas já presentes no poço é de n_x = c_x =V_x (com a concentração atual c_x e volume V_x) e o número de moléculas no poço após a próxima adição é n_x+y, o número de moléculas a serem adicionadas_{n y} é determinado pela concentração c_y e volume V_y da solução a ser aplicada ao poço (n_y =_c y ◗ V_y). Depois de adicionar uma porção de agonista, a nova quantidade de moléculas agonistas no poço é: c_x+y ◗ V_x+y = c_x ◗ V_x + c_y ◗ V_y. Este cálculo se aplica a cada etapa subsequente. Devido à interdependência da concentração agonista no poço e à quantidade de agonista nas porções a serem adicionadas a cada passo, é importante definir as concentrações finais após cada passo de antecedência.

Modo 1: O volume no poço aumentará a cada passo à medida que o líquido é continuamente adicionado.
Usando este modo e um formato de 8 poços, use V_x1 = 200 μL e V_{y1 ....} V_yi = 30 μL.

Modo 2: O volume no poço é constante, pois o volume adicionado a cada etapa é removido pouco antes da adição subsequente.
Usando este modo e um formato de 96 poços, use V_x1 = 150 μL e V_{y1 ....} V_yi = 75 μL.

2. Imprima a folha de dados com o volume total por concentração e instruções detalhadas para pipetting.
3. Prepare todas as soluções no valor necessário. Faça todas as soluções agonistas no mesmo meio sem soro que usado para o equilíbrio das células.
   ATENÇÃO: O dihidrocloreto de histamina é considerado perigoso pelo Padrão de Comunicação de Risco OSHA de 2012 (29 CFR 1910.1200). Histamina causa irritação da pele, irritação grave nos olhos, pode causar reação alérgica à pele, alergia, sintomas de asma ou dificuldades respiratórias se inalada e pode causar irritação respiratória. Por favor, considere a ficha de segurança.
   NOTA: Faça soluções agonistas o mais frescas possível. A estabilidade dos agonistas na solução pode variar consideravelmente. Armazene soluções a 4 °C ou abaixo até o uso no experimento. Para algumas moléculas, aditivos estabilizadores adicionais, como a BSA, ao usar moléculas à base de peptídeos ou à base de lipídios, podem ser considerados para evitar adsorção às paredes de poços e tubos.
4. Se realizar o experimento em formato de 96 poços, transfira soluções para uma placa convencional de 96 poços (sem eletrodos) e use um tubo de canal de 8(ou 12-) para transferência rápida de líquido para a matriz de eletrodos.

5. Preparação de soluções agonistas para experimento em modo antagonista

NOTA: Prepare a solução antagonista com a concentração a ser aplicada durante todo o processo. O volume e a concentração da solução antagonista dependem do modo de adição agonista (1 ou 2). Exemplos para experimentos em formato de 8 poços ou 96 poços no modo de adição 2: (A) formato de 8 poços (V_x1 = 200 μL, V_Antagonist = 200 μL); (B) formato de 96 poços (V_x1 = 150 μL, V_Antagonist = 75 μL).

1. Calcule a concentração de cada solução agonista necessária para cada etapa da dosagem em série, conforme descrito na etapa 4.1.
2. Faça todas as soluções agonistas no mesmo meio sem soro usado para o equilíbrio das células e adicione o antagonista na mesma concentração final planejada para os respectivos poços no experimento.
   NOTA: Neste caso, a solução de estoque de histamina (10 mM) é preparada em meio L-15. Quando os agonistas são dissolvidos em outros solventes (por exemplo, sulfoxide dimetil (DMSO), o etanol) deve ser incluído para explicar o aumento da carga de solventes a cada etapa de adição.

6. Realizar o protocolo de adição serial no modo agonista

1. Inicie a aquisição de dados conforme descrito nas etapas 3.1 – 3.5.
2. Pré-aqueça as soluções agonistas antes de usá-las colocando-as na incubadora cerca de 10 a 15 min antes da adição.
   NOTA: Ao usar substâncias termolabile, as soluções não devem ser mantidas a 37 °C por muito tempo. Se o pré-aquecimento de 10 a 15 min for considerado crítico, traga soluções para 37 °C pouco antes de adição em um banho de água.
3. Execute a dosagem serial agonista dependente do modo de adição selecionado. Seguindo o modo 1 o volume total no poço aumenta a cada adição da próxima dose. No modo 2, o mesmo volume adicionado a cada passo também é removido novamente pouco antes de adicionar a próxima dose mais alta.
   NOTA: O tempo necessário para o equilíbrio da camada celular entre duas doses agonistas subsequentes depende do tempo de resposta das células. Um experimento inicial no modo paralelo (um bem – uma concentração) revela (i) tempos de resposta celular para diferentes concentrações agonistas e (ii) o parâmetro de curva mais sensível (por exemplo, no máximo da impedância, impedância após o tempo x).

A: Formato modo 1 / 8-well

1. Adicione 30 μL da primeira solução com a menor concentração de agonista às células que foram equilibradas em 200 μL de meio soro livre de soro.
2. Deixe as células responderem e equilibrem o período pré-definido de tempo (por exemplo, 15 min).
3. Adicione 30 μL da segunda solução com a próxima maior concentração.
4. Repita as etapas 6.3.1-6.3.3 com a terceira, quarta, e assim por diante, solução agonista.
   NOTA: Trabalhar com 10 etapas de concentração resultará em um volume total de 500 μL no final do experimento, que está um pouco abaixo do volume máximo aplicável desses poços de ~ 550 μL.

B: Formato modo 2 / 96-well

NOTA: Pausa a aquisição de dados durante cada etapa de manuseio líquido (adição/remoção) através do software do instrumento de impedância ao executar experimentos em formato de 96 poços. A movimentação líquida mais elaborada pode interferir na aquisição de dados. Use uma pipeta multicanal.

1. Pausa na aquisição de dados.
2. Adicione 75 μL da primeira solução com a menor concentração de agonista às células que foram equilibradas em 150 μL de meio soro livre de soro.
3. Retome a aquisição de dados.
4. Deixe as células responderem e equilibrem o período pré-definido de tempo (por exemplo, 15 min).
5. Cerca de 1 a 2 min antes do tempo de equilíbrio regular terminar, pausar a medição e remover 75 μL de cada poço.
   NOTA: O ponto de tempo em que a solução deve ser removida depende do número de poços monitorados em paralelo e da velocidade de tubulação. O tempo necessário para a remoção das soluções não deve exceder o tempo entre as etapas subsequentes.
6. Adicione 75 μL da segunda solução com a próxima maior concentração e retome a medição.
7. Repita as etapas 6.3.8-6.3.10 com a terceira, quarta, e assim por diante, solução agonista.

7. Realizar o protocolo de adição serial no modo antagonista

1. Inicie a medição conforme descrito nas etapas 3.1 – 3.5.
2. Durante o equilíbrio das camadas celulares, prepare a solução antagonista (por exemplo, 200 μL de cloridrato de difenidágua de 1,5 μM no meio L15).
   ATENÇÃO: Cloridrato de difenidágua tem potenciais efeitos agudos na saúde. É prejudicial se engolido ou inalado, pode causar irritação nos olhos e na pele. Pode causar irritação respiratória e do trato digestivo. Por favor, considere a ficha de segurança.
3. Pré-aqueça as soluções antagonistas e agonistas colocando-as na incubadora cerca de 10 a 15 min antes de se adição às culturas celulares (cf. 6.2). Se os poços sem antagonistas forem incluídos no ensaio também, também meio pré-quente sem soro.
4. Adicione a solução antagonista aos poços designados. Deixe as células equilibrarem com o antagonista por 15 a 20 min. Se os poços sem antagonistas forem incluídos, adicione o mesmo volume de meio sem soro a esses poços.
5. De acordo com a adição antagonista no modo 2,remova a solução dos poços
   (A) formato 8-well (200 μL)
   (B) formato de 96 poços (75 μL)
6. Execute a sequência de adição agonista como descrito na etapa 6.3.

8. Exportação e análise de dados

1. Dados de exportação usando o software do instrumento de impedância, a fim de converter todos os dados registrados de proprietários em formatos de dados comuns (por exemplo, csv). Esta etapa permite a reorganização e apresentação de dados com outros pacotes de software.
2. Carregue os dados formatados pelo CSV para software de análise de dados científicos.
3. Normalize os valores de impedância subtraindo a impugenção do último ponto de dados antes da primeira adição da solução agonista e definindo o tempo de acréscimo para t = 0. Traçar o curso de tempo da impedância normalizada.
4. Traçar os cursos de tempo individuais e identificar a máxima em impedância após cada etapa de acréscimo. Componha uma folha de dados com esses valores.
5. Traçar os valores de alterações máximas (ou mínimas, se aplicável) de impedância em função da concentração agonista. Isso pode ser feito para poços individuais ou para as médias (média ± SD).
6. Use uma rotina de montagem de dados para determinar concentrações eficazes semi-máximas (EC₅₀₎e resposta máxima (E_Max)usando o modelo logístico de quatro parâmetros (equação 2):

NOTA: c indica a concentração agonista, A₁ é o mínimo e A₂ é o máximo assimptote da curva sigmoidal dose-resposta (A₂ = E_Max). EC₅₀ é a concentração no ponto de inflexão da curva, e n corresponde à encosta da Colina.

Resultados

Um esquema típico para preparar as várias soluções agonistas é mostrado para um experimento usando matrizes de eletrodos de 8 poços com histamina como agonista nas tabelas 1-4. Tabela 1 e Tabela 2 apresentam volumes e concentrações para um experimento utilizando o modo de adição 1 (cf., Figura 1),enquanto a Tabela 3 e a Tabela 4 apresentam volumes e concentrações para um experime...

Discussão

Este protocolo descreve um método para medições de impedância sem rótulos para determinar a relação de dose-resposta da ativação gpcr induzida por agonistas na ausência ou presença de antagonistas específicos para o mesmo receptor. A prova de conceito desse método foi apresentada em uma publicação recente¹². Para nosso conhecimento, é o primeiro estudo descrevendo o estabelecimento de uma curva completa de resposta de dose da ativação GPCR mediada por agonistas usando uma única ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bürker counting chamber	Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany)	640210
cell culture flasks 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Centrifuge (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Diphenhydramine hydrochloride	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D3630
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)
96-well electrode arrays (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S0615
Histamine dihydrochloride	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	4017.1
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	51022515	class II safety cabinet
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	21083-027
L-glutamine	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	G7513
Micropipette large (100 - 1000 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704780
Micropipette large (20 - 200 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704778
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)	Nikon (Düsseldorf, Germany)
Penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	P0781
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D8537
Pipette, serological	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	607 180
Pipettor (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Germany)	26300
Trypsin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	T4174	in PBS with 1 mM EDTA
Tube, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	188 271
Tube, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	210 261
U-373 MG cells	ATCC (Rockville, MD, USA)	ATCC HTB-17
water bath (TW21)	Julabo (Seelbach, Germany)	\