Um modelo de interposição venosa de coelho imitando cirurgia de revascularização usando enxertos de veia para avaliar hiperplasia intimal sob pressão arterial

Resumo

O presente protocolo visa criar experimentalmente hiperplasia intimal venosa submetendo veias à pressão arterial arterial para o desenvolvimento de estratégias para atenuar a hiperplasia intimal venosa após cirurgia de revascularização usando enxertos venosos.

Resumo

Embora enxertos venosos tenham sido comumente usados como enxertos autólogos em cirurgias de revascularização para doenças isquêmicas, a patência a longo prazo permanece pobre devido à aceleração da hiperplasia intimal devido à exposição à pressão arterial. O presente protocolo é projetado para o estabelecimento de hiperplasia intimal venosa experimental interpondo veias jugulares de coelho às artérias carótidas ipsilaterais. O protocolo não requer procedimentos cirúrgicos profundos no tronco do corpo e a extensão da incisão é limitada, o que é menos invasivo para os animais, permitindo a observação a longo prazo após a implantação. Este procedimento simples permite aos pesquisadores investigar estratégias para atenuar a progressão da hiperplasia intimal dos enxertos venosos implantados. Utilizando este protocolo, reportamos os efeitos da transdução de microRNA-145 (miR-145), que é conhecida por controlar o fenótipo das células musculares lisas vasculares (VSMCs) do estado proliferativo ao estado contrátil, em enxertos venosos colhidos. Confirmamos a atenuação da hiperplasia intimal dos enxertos venosos através da transdução de miR-145 antes da cirurgia de implantação através da mudança do fenótipo dos VSMCs. Aqui relatamos uma plataforma experimental menos invasiva para investigar as estratégias que podem ser usadas para atenuar a hiperplasia intimal de enxertos venosos em cirurgias de revascularização.

Introdução

O número de pacientes que sofrem de doenças isquêmicas devido à aterosclerose está aumentando em todo o mundo¹. Apesar dos atuais avanços em terapias médicas e cirúrgicas para doenças cardiovasculares, as doenças isquêmicas do coração, como o infarto do miocárdio, continuam sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade². Além disso, as doenças arteriais periféricas caracterizadas pela redução do fluxo sanguíneo para os membros induzem isquemia crítica aos membros, onde aproximadamente 40% dos pacientes perdem as pernas dentro de 6 meses após o diagnóstico, e a taxa de mortalidade é de até 20%³.

Cirurgias de revascularização, como enxerto de bypass da artéria coronária (CABG) e cirurgia de bypass para artérias periféricas, são as principais opções terapêuticas para doenças isquêmicas. O objetivo dessas cirurgias é fornecer uma nova via sanguínea para fornecer fluxo sanguíneo suficiente em direção ao local distal das lesões estenóticas ou ocluídas das artérias ateroscleróticas. Embora enxertos arteriais in situ, como artérias torácicas internas para CABG, sejam preferidos como enxertos de bypass devido à paciência mais longa esperada, enxertos venosos, como veias saphenous autólogas, são comumente utilizados devido à maior acessibilidade e disponibilidade⁴. O ponto fraco dos enxertos venosos é a baixa taxa de patency em comparação com a dos enxertos de artéria⁵ devido à hiperplasia intimal acelerada quando submetida à pressão arterial, o que leva à doença do enxerto venoso⁶.

A doença do enxerto venoso desenvolve-se através dos seguintes três passos: 1) trombose; 2) hiperplasia intimal; e 3) aterosclerose⁷. Para enfrentar a doença do enxerto venoso, muitas pesquisas básicas têm sido realizadas⁸. Até agora, nenhuma estratégia farmacológica além de terapias antiplaquetárias e de redução de lipídios são recomendadas para prevenção secundária após cirurgias de revascularização coronariana ou periférica nas diretrizes recentes^9,,10,11,12. Assim, para superar a doença do enxerto venoso, especialmente a hiperplasia intimal, é necessário o estabelecimento de uma plataforma experimental relevante para novos estudos.

A hiperplasia intimal é um fenômeno adaptativo que ocorre em resposta à mudança no ambiente, onde as células musculares lisas vasculares (VSMCs) proliferam, se acumulam e geram matriz extracelular no intima. Consequentemente, apresenta uma base para o ateroroma de enxerto⁷. No hiperplástico intima, os VSMCs suportam a proliferação, e a produção em vez de contração, denominada "mudança phenotípica"⁸. É um dos principais alvos de pesquisa para controlar o fenótipo dos VSMCs dos enxertos venosos para prevenir a doença do enxerto venoso, e inúmeros estudos básicos têm sido realizados sobre este tema⁸. No entanto, um estudo clínico controlado randomizado que teve como objetivo alcançar o controle farmacológico do fenótipo VSMC mostrou resultados limitados¹³. Além disso, não há terapias padronizadas para prevenir hiperplasia intimal. Mais pesquisas básicas, incluindo estudos de modeloanimal, são necessárias.

Para promover pesquisas nesse campo, é fundamental estabelecer um modelo animal que recapitula enxertos venosos sob pressão arterial, permitindo uma observação pós-operatória de longo prazo. Carrel et al. estabeleceram um modelo canino de implantação da veia jugular externa na artéria carótida¹⁴. Tem sido utilizada uma variedade de enxertos venosos para investigar os efeitos fisiológicos e patológicos das alterações na pressão arterial, incluindo a veia cava inferior enxertada na aorta torácica ou abdominal, ou a veia safena enenxertada na artéria femoral^15,16,17. Esses modelos foram construídos em animais maiores, como porcos ou cães, que são adequados para imitar uma doença do enxerto venoso em um caso clínico. No entanto, o estabelecimento de um modelo animal que possa ser preparado sem técnicas cirúrgicas especiais e a um custo menor seria ideal para pesquisadores que tentam desenvolver uma nova estratégia terapêutica para atenuar a hiperplasia intimal através do controle do fenótipo VSMC in vivo. Inicialmente, foi introduzida a interposição da veia jugular na artéria carótida em um coelho no campo da neurocirurgia^18,19. Posteriormente, foi aplicada a pesquisas sobre hiperplasia intimal^20,21. O modelo inicial consiste apenas na interposição venosa, economizando tempo. Além disso, um estudo subsequente demonstrou que a preparação de um enxerto venoso também afetou a hiperplasia intimal²². Davies et al. avaliaram o efeito da lesão do cateter de balão na hiperplasia intimal em uma interposição venosa de coelho modelo^23,24. Embora a lesão do cateter de balão, além da interposição venosa, tenha sido mais relevante para um ambiente clínico, também foi desejado um modelo mais reprodutível. Assim, Jiang et al. examinaram o impacto dos ambientes de fluxo diferencial na hiperplasia intimal e estabeleceram um procedimento de ligadura de ramo distal como um modelo reprodutível²⁵. No entanto, eles utilizaram uma técnica de punho no momento da interposição do enxerto venoso que parece diferente da anastomose costurada à mão no ambiente clínico. No presente protocolo, relatamos um procedimento reprodutível, clinicamente relevante e amplamente disponível para a preparação de um modelo de interposição venosa de coelho para avaliar a hiperplasia intimal sob pressão arterial.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos realizados em animais devem ser realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (www.nap.edu/catalog/5140.html) ou outras diretrizes éticas adequadas. Os protocolos devem ser aprovados pela comissão de bem-estar animal na instituição apropriada antes de prosseguir.

1. Preparação de animais

1. Compre coelhos brancos japoneses machos (ou coelhos com tamanho equivalente do corpo) pesando 2,7-3,0 kg.
2. Aclimate os coelhos por 1 semana em um ciclo claro-escuro de 12 horas e alimente uma dieta regular de comida de coelho antes do procedimento.

2. Anestesia e configuração animal

NOTA: Todos os procedimentos subsequentes devem ser realizados sob condições assépticas. O campo cirúrgico e os dispositivos devem ser desinfetados com 10% de solução de povidone-iodo, 70% de álcool ou um composto quaternário de amônio antes do uso.

1. Anestesiar um coelho com administração intravenosa de sódio pentobarbital (25 mg/kg) através da veia auricular.
2. Depois de garantir que o coelho perdeu sua força, transfira-o para uma mesa de operação e coloque-o na posição supina. Cubra o nariz e a boca com uma máscara anestéstica. Iniciar a administração da anestesia geral com a inalação de 0,7-1,0% mistura isoflurano-oxigênio.
   NOTA: Se o coelho começar a se mover, um surto temporal de isoflurano de até 2% será eficaz.
3. Corte a pele no pescoço e no ombro usando um cortador de cabelo elétrico. Depois de desinfetar a superfície pulverizando 70% de etanol ou outra solução antisséptica, raspe o resto do cabelo na região cervical com uma navalha. Desinfete o campo cirúrgico com 10% de povidone-iodo e administre cloridrato de lidocaína (3 mg/kg) subcutâneamente como anestesia local.
   NOTA: Examine o movimento repetitivo da traqueia. Observe a pulsação da veia jugular e da artéria carótida. Quando as taxas respiratórias e pulsátilas diminuem, considere uma redução temporária na administração da anestesia. Monitorar a saturação percutânea de oxigênio e a freqüência de pulso também é útil.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. Colheita da veia jugular

NOTA: Os anestésicos locais (como a lidocaína) devem ser usados antes de fazer a incisão cutânea.

1. Antes da incisão da pele, administre enrofloxacina profilática (5 mg/kg) subcutâneamente. Para analgesia, administre 0,05 mg/kg de buprenorfina subcutânea duas vezes por dia durante 3 dias.
   NOTA: Para evitar uma queda na temperatura corporal, pode ser utilizado um esfoliante cirúrgico do local da incisão em vez de pulverizar o corpo do animal com 70% de etanol.
2. Incise 50-60 mm da região cervical com bisturi cirúrgico longitudinalmente. Dissecar sem rodeios os tecidos subcutâneos e a fáscia para expor um segmento de 20 a 30 mm da veia jugular. Liga todos os ramos da veia exposta com suturas de seda 4-0.
3. Coloque uma sutura de seda 2-0 em torno das veias jugular internas e externas para realizar a ligadura imediatamente após a incisa da veia jugular no próximo passo.
4. Incida a parede venosa (aproximadamente 1 mm) do lado distal da veia. Insira um cateter de balão 2-French do corte em direção ao lado proximal da veia. Liga a sutura de seda 2-0 nos locais distais das veias jugularas.
5. Infle o balão com 0,2 mL de ar. Desnuda a intimação da veia usando três passagens do cateter para esfoliação endotelial.
   NOTA: Este procedimento é considerado equivalente à distensão de enxerto de veia safena em cirurgias de revascularização humana, o que causa esfoliação endotelial.
6. Liga a extremidade proximal da veia. Corte a veia para colher.
   NOTA: Distingue cuidadosamente a extremidade distal e proximal da veia colhida, pois a anastomose na artéria deve ser realizada de forma invertida (ou seja, a extremidade distal da veia deve ser anastomosa da extremidade proximal da artéria). Por exemplo, a inserção de um cateter intravenoso de um determinado lado funcionaria como um marcador.
7. Para manipulações terapêuticas para a veia jugular colhida, trate a veia colhida com métodos projetados para cada questão de pesquisa (por exemplo, eletroporação²⁶ ou imersão direta com soluções²⁷ para transdutação de microRNAs nas veias).
   NOTA: Para este protocolo, os enxertos venosos foram embebidos em solução salina tamponada por fosfato, microRNA de controle e microRNA-145. O protocolo pode ser pausado aqui.

4. Interpor a artéria carótida pela veia jugular colhida

1. Exponha um segmento de 20 a 30 mm da artéria carótida ipsilateral. Separe a artéria cuidadosamente da veia e nervo próximo. Liga todos os ramos da veia exposta com sutura de seda 4-0.
2. Administrar o sódio de heparina por via intravenosa (200 UI/kg). Espere de 3 a 4 min.
3. Fixar as extremidades proximal e distal da artéria com grampos cirúrgicos. Corte a artéria no meio, entre os grampos. Injete salina normal na artéria carótida incisiva proximamente e distalmente para distendir a artéria.
   NOTA: Uma artéria carótida de coelho tende a encolher. Escolha um site bem distendido como um site de anastomose.
4. Anastomose a veia colhida para a artéria de uma forma invertida de ponta a ponta.
   1. Insira um cateter intravenoso de 20 G na veia colhida desde o distal até a direção proximal para manter o lúmen venoso aberto durante a anastomose distal.
   2. Anastomose a extremidade proximal da veia para a extremidade distal da artéria usando 8-0 suturas interrompidas de polipropileno. Coloque dois estiques de âncora no local e no local oposto. Adicione o lado superior da linha de anastomose entre as estrias de âncora.
   3. Vire a artéria e o enxerto de veia de cabeça para baixo. Adicione stiches na parte restante da linha de anastomose.
   4. Retire o cateter intravenoso da veia. Aperte o enxerto venoso proximamente e decline a artéria carótida distalmente. Verifique se o enxerto venoso está se expandindo gradualmente.
   5. Anastomose a extremidade distal da veia para a extremidade proximal da artéria usando 8-0 suturas interrompidas de polipropileno. Declâmp a artéria para verificar o sangramento dos locais de anastomose. Adicione suturas para hemostasia, se necessário.
      NOTA: Uma compressão suave do local sangrando com gaze e espera pode ser suficiente para hemostasia. Verifique a expansão imediata e a forte pulsação do enxerto venoso após a depressão proximal. Se isso não for observado, considere repetir as etapas 4.4.2-4.4.3
5. Liga a artéria carótida interna com uma sutura de seda 4-0 para simular uma condição de escoamento ruim e para facilitar a hiperplasia intimal.
6. Limpe a ferida com salina. Feche a ferida usando 3-0 poliglactina 910, camada por camada.

5. Procedimentos pós-operatórios

1. Acabe com a anestesia e remova a máscara de anestesia depois de verificar a respiração espontânea do animal. Verifique as condições do animal com freqüência até que ele se recupere da anestesia.
2. Mantenha o animal separado de outros animais até que a função respiratória seja totalmente restaurada. Apoie a respiração manualmente, se necessário. Não devolva o animal para um grupo maior até a recuperação completa.
3. Verifique a ingestão de alimentos e água após a recuperação da anestesia e forneça suporte nutricional adequado. Administrar analgésicos (por exemplo, buprenorfina 0,05-0,2 mg/kg subcutâneamente 2x por dia durante 3 dias) e verificar se há sinais de desconforto ou dor.

Resultados

A Figura 1A mostra uma imagem representativa de hiperplasia intimal bem sucedida em 2 semanas após a cirurgia de interposição venosa (painel superior). O painel inferior mostra os efeitos terapêuticos de nanopartículas poli(ácido cogólico- lacótico-co-glicólico) microRNA-145 que atenuaram a hiperplasia intimal (painel inferior). A Figura 1B mostra a comparação da hiperplasia intimal entre o grupo controle utilizando os grupos de controle de solução ...

Discussão

O presente protocolo foi projetado para fornecer uma plataforma experimental para testar várias intervenções moleculares ou genéticas para VSMCs para controlar o fenótipo do estado proliferativo para o estado contrátil e, posteriormente, atenuar a progressão da hiperplasia intimal venosa in vivo. Utilizando este modelo, preparamos com sucesso a hiperplasia intimal 2 semanas após a cirurgia (Figura 1A) e indicamos o potencial terapêutico do microRNA-145 para controlar o fenótipo VSM...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone-iodine solution	Nakakita	872612	Surgical expendables
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	Surgical expendables
4-0 Silk suture	Alfresa pharma	GA04SB	Surgical expendables
8-0 polypropylene suture	Ethicon	8741H	Surgical expendables
Cefazorin sodium	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	Antibiotics
Fogarty Catheter (2Fr)	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	Surgical expendables
Heparin	Nipro	873334	Anticoagulant
Intravenous catheter (20G)	Terumo	SR-OT2051C	Surgical expendables
Isoflurane	Fujifilm	095-06573	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	MP Biomedicals	193917	Anesthesia
Pentobarbital sodium	Tokyo Chemical Industry	P0776	Anesthesia