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Resumo

O objetivo geral do protocolo é preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter ordenadas, uniformes, estáveis e biocompatíveis em um substrato planar de 1 cm2 que pode ser usado para síntese proteica sem células.

Resumo

Os avanços na resolução espacial e na sensibilidade de detecção da instrumentação científica possibilitam a aplicação de pequenos reatores para pesquisas biológicas e químicas. Para atender à demanda por microreatores de alto desempenho, desenvolvemos um dispositivo Femtoliter droplet array (FemDA) e exemplificamos sua aplicação em reações de síntese proteica livre de células massivamente paralelas (CFPS). Mais de um milhão de gotículas uniformes foram prontamente geradas dentro de uma área do tamanho de um dedo usando um protocolo de vedação de óleo de duas etapas. Cada gotícula estava ancorada em uma microcâmara femtoliter composta por um fundo hidrofílico e uma parede lateral hidrofóbica. A estrutura hidrofóbica híbrida e os óleos de vedação dedicados e surfactantes são cruciais para manter a solução aquosa femtoliter no espaço femtoliter sem perda de evaporação. A configuração femtoliter e a estrutura simples do dispositivo FemDA permitiram o consumo mínimo de reagentes. A dimensão uniforme dos reatores de gotículas tornou as medições quantitativas e de curso de tempo em larga escala convincentes e confiáveis. A tecnologia FemDA correlacionou o rendimento proteico da reação do CFPS com o número de moléculas de DNA em cada gotícula. Agilizamos os procedimentos sobre a microfabização do dispositivo, a formação das gotículas femtoliter e a aquisição e análise dos dados de imagem microscópica. O protocolo detalhado com o baixo custo otimizado de execução torna a tecnologia FemDA acessível a todos que possuem instalações padrão de limpeza e um microscópio de fluorescência convencional em seu próprio lugar.

Introdução

Pesquisadores usam reatores para realizar reações bioquím químicas. Há esforços significativos que têm sido feitos para reduzir o tamanho do reator e aumentar o rendimento experimental, a fim de diminuir o consumo de reagentes e, ao mesmo tempo, melhorar a eficiência do trabalho. Ambos os aspectos visam libertar os pesquisadores de uma carga de trabalho pesada, diminuindo o custo e acelerando a pesquisa e o desenvolvimento. Temos um roteiro histórico claro sobre o desenvolvimento das tecnologias do reator do ponto de vista dos volumes de reação e do throughput: bicos únicos/frascos/tubos de ensaio, tubos mililitros, tubos microliteres, microliter 8-tube tiras, microliter 96/384/1536-well placa, e nanoliter/picoliter/picoliter/femtoliter reatores1,,2,3,,4,5,6,7. Análogo à redução do tamanho do recurso de transistores em chips de circuito integrados na indústria de semicondutores nas últimas décadas, os microreatores bioquímicos estão passando por redução de volume e integração do sistema. Tais ferramentas de pequena escala tiveram um impacto profundo na biologia sintética baseada em células ou sem células, a biocoformação biomafatorial e a prototipagem e triagem de alta produtividade8,,9,,10,,11,12. Este artigo descreve nosso recente esforço no desenvolvimento de uma tecnologia única de gotículas e demonstra sua aplicação no CFPS13, uma tecnologia fundamental para a biologia sintética e comunidades de triagem molecular14. Em particular, fornecemos intencionalmente um protocolo otimizado e de baixo custo para tornar o dispositivo FemDA acessível a todos. O protocolo de baixo custo e fácil de lidar para o dispositivo miniaturizado contribuiria para os propósitos educacionais das universidades e ajudaria a disseminar a tecnologia.

FemDA prepara gotículas femtoliter a uma densidade ultra-alta de 106 por 1 cm2 em um substrato de vidro planar. Nós revestemos um polímero hidrofóbico, CYTOP15,no substrato de vidro e gravado seletivamente (removido) CYTOP em posições predefinidas para gerar uma matriz de microcâmara no substrato. Assim, a microcâmara resultante é composta por uma parede lateral hidrofóbica (CYTOP) e um fundo hidrofílico (vidro). Quando fluimos sequencialmente água e óleo sobre a superfície padronizada, a água pode ser presa e selada nos microchambers. A estrutura hidrofóbica-em-hidrofóbica é vital para repelir a água fora dos microchambers, isolar microreatores individuais e reter uma pequena solução aquosa dentro do espaço femtoliter. A propriedade única foi aplicada com sucesso para a preparação de gotículas de água em óleo e microcompartamentos lipídes bicamadas16,17. Em comparação com o protótipo do dispositivo16,primeiro otimizamos o processo de microfabaçação para realizar uma remoção completa do polímero CYTOP, bem como uma exposição completa do fundo de vidro. CYTOP é um fluoropolímero especial com tensão superficiais (19 mN/m) inferior à de materiais microrretores convencionais, como vidro, plásticos e silicone. Seu bom desempenho óptico, elétrico e químico já foi utilizado no tratamento superficial de dispositivos microfluidos18,19,20,,21,,22,,23,,24. No sistema FemDA, para obter uma boa moçação do óleo na superfície CYTOP, a tensão superficial do óleo deve ser menor do que a da superfície sólida25. Caso contrário, o óleo líquido em contato com a superfície sólida tende a se tornar esférico em vez de se espalhar sobre a superfície. Além disso, descobrimos que alguns óleos populares de perfluorocarbono (por exemplo, 3M FC-40)16 e óleos de hidrofluoroether (por exemplo, série 3M Novec) podem dissolver CYTOP como resultado da morfologia amorfa do CYTOP, que é fatal para medição quantitativa e seria questionável em termos de contaminação cruzada entre gotículas. Felizmente, identificamos um óleo biocompatível e ecologicamente correto que exibe tensão superficial mais baixa (< 19 mN/m)13. Também encontramos um novo surfactante que pode dissolver-se no óleo selecionado e funcionar em baixa concentração (0,1%, pelo menos 10 vezes menor do que os populares relatados anteriormente26,27)13. A interface água/óleo resultante pode ser estabilizada pelo surfactante. Devido à alta taxa de evaporação do óleo, após a descarga com o óleo, aplicamos outro óleo biocompatível e ambientalmente amigável para substituir o primeiro a selar os microchambers. Chamamos o primeiro óleo (ASAHIKLIN AE-3000 com 0,1 wt % SURFLON S-386) o "óleo de descarga" e o segundo óleo (Fomblin Y25) o "óleo de vedação", respectivamente.

A estratégia de vedação de óleo em duas etapas pode realizar uma formação robusta da matriz de gotículas femtoliter em minutos e sem instrumentação sofisticada. Devido ao problema de evaporação, tem sido considerado desafiador gerar microreatores menores do que os volumes picoliter28. A FemDA abordou essa questão otimizando sistematicamente os materiais e processos utilizados para a elaboração de microreatores/gotículas. Várias características notáveis das gotículas resultantes incluem a alta uniformidade (ou monodispersidade), estabilidade e biocompatibilidade na escala femtoliter. O coeficiente de variação (CV) do volume de gotículas é de apenas 3% (sem correção de vinheta para as imagens microscópicas), o menor CV entre as plataformas de gotículas do mundo, o que garante uma medição altamente paralela e quantitativa. A gotícula femtoliter é estável por pelo menos 24 horas sem contaminação cruzada entre gotículas à temperatura ambiente, o que é valioso para uma medição confiável do curso de tempo. Em relação à biocompatibilidade, conseguimos sintetizar várias proteínas a partir de um DNA modelo de cópia única na gotícula femtoliter, que anteriormente havia sido considerada difícil ou ineficiente29,30. Seria digno de elucidar por que algumas proteínas capazes de ser sintetizadas no FemDA não podem ser sintetizadas em outros sistemas de gotículas. FemDA não foi meramente um avanço técnico, mas também realizou uma medição quantitativa sem precedentes que pode correlacionar o rendimento da proteína (como refletido pela intensidade da fluorescência da gotícula) ao número de moléculas de DNA modelo em cada gotícula. Como resultado, o histograma da intensidade de fluorescência de gotículas do CFPS baseado em FemDA mostrou uma distribuição discreta que pode ser bem encaixada por uma soma de distribuições gaussianas de intervalos de pico a pico iguais. Além disso, a probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson31. Assim, o rendimento diferente de proteínas em cada gotícula pode ser normalizado com base na distribuição discreta. Este recurso crítico nos permite separar as informações de atividade enzimática da intensidade aparente, que ainda não está disponível com outras plataformas de microreatores. Os sistemas de classificação de células/gotículas microfluidas existentes são habilitados em classificação totalmente automática e bons em concentrar amostras, mas às vezes só podem produzir um histograma relativamente amplo ou de cauda longa no aspecto analítico32,33. Nosso sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatível estabelece um novo benchmark e um alto padrão analítico no campo do desenvolvimento de microreatores.

Os óleos e surfactantes que poderiam ser usados para a preparação de gotículas ainda são muito limitados34. A combinação de ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 estabelecida na FemDA é um novo membro do crescente arsenal da interface fisioquímica entre a fase aquosa e a fase13do óleo . A nova interface em FemDA é fisicamente estável, quimicamente inerte e biologicamente compatível com a transcrição complexa, tradução e máquinas de modificação pós-translacional para muitos tipos de proteínas13. Seria bastante atraente encontrar uma proteína que não pode ser sintetizada nas configurações de gotícula. Além disso, a economia de custos dos reagentes é mais evidente no sistema de gotícula femtoliter do que no sistema de reator nanoliter e picoliter35,36. Em particular, muitas vezes haveria um grande volume morto, que é causado principalmente por tubos ou suprimentos externos, em sistemas microfluídicos de geração de droplet, mas não em nosso FemDA. O formato de matriz também é favorecido pela caracterização microscópica repetida e detalhada (semelhante à chamada análise de alto conteúdo) para cada reator37, em vez de apenas um único instantâneo para um objeto em movimento rápido. A escala femtoliter permitiu a integração de mais de um milhão de reatores em uma área do tamanho de um dedo, enquanto o mesmo número de reatores nanoliteres (se existir) requer sobre a área do metro quadrado, o que seria sem dúvida impraticável para fabricar ou usar tal sistema.

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Protocolo

1. Microfabricação do substrato de matriz de microcrobra femtoliter

NOTA: Realize o seguinte experimento de microfabização em uma sala de limpeza. Use luvas e um terno de limpeza antes de entrar na sala de limpeza.

  1. Substrato de vidro de cobertura de limpeza
    1. Coloque o vidro da tampa em um rack de coloração de vidro de cobertura. Sonicar o vidro de cobertura em hidróxido de sódio de 8 M (NaOH) por 15 min a temperatura ambiente (RT).
      ATENÇÃO: O NaOH em altas concentrações é altamente perigoso para a pele e os olhos. Manuseie-o suavemente sem qualquer respingo.
    2. Tire o rack da solução NaOH e enxágue o vidro de cobertura usando água por dez vezes. Mantenha o vidro da tampa na água pura.
      NOTA: Descarte os resíduos alcalinos para o tanque designado. A solução NaOH pode ser reciclada para a garrafa original e usada por até cinco vezes.
    3. Seque cada pedaço de vidro de cobertura com uma pistola de ar.
    4. Asse o vidro de cobertura seca em uma placa quente a 200 °C por 5 minutos. Mantenha a orientação do lado superior do substrato de vidro consistente durante os seguintes processos de manuseio.
  2. Silanização da superfície de vidro
    1. Reinicie o vidro de cobertura limpo em um rack de coloração seca.
    2. Adicione 150 mL de etanol em um béquer PTFE. Use uma agulha (22 G x 70 mm) equipada com seringa de 1 mL para desenhar 0,075 mL de (3-aminopropil)triexisilano e injete imediatamente no etanol (ou seja, 0,05 vol %). Puxe e empurre a seringa várias vezes para enxaguar o interior da seringa. Mexa a solução com a agulha para torná-la homogênea.
      NOTA: (3-aminopropil)triethoxysilane pode ser armazenado à temperatura ambiente e 1 atm pressão por dois anos com uma vedação apertada. O etanol absoluto deve ser bem selado após o uso. Não recomendamos o uso de reagentes vencidos.
    3. Incubar o vidro de cobertura na solução de aminosilano de 0,05 vol % por 1 h na RT.
    4. Enxágüe o vidro da tampa usando água pura por cinco vezes. Mantenha o vidro da tampa na água pura.
      NOTA: Descarte os resíduos para o tanque designado.
    5. Seque cada pedaço de vidro de cobertura com a pistola de ar.
    6. Coloque todo o vidro de cobertura seca na folha de alumínio. Asse o copo de cobertura na placa quente a 80 °C por 5 minutos.
  3. Perfluoropolímero CYTOP de revestimento de spin
    1. Coloque o vidro de cobertura em um mandril de vácuo personalizado de um revestimento de spin(Figura 1A). Ligue o interruptor de vácuo para fixar o substrato de vidro.
      NOTA: O design do mandril a vácuo é crucial para um revestimento uniforme de polímero viscoso no substrato retangular (24 mm × 32 mm) e fino (0,13-0,17 mm) substrato(Figura 1A). Descobrimos que um estágio de amostra retangular com múltiplos orifícios (48 orifícios, cada um com 1 mm de diâmetro) conectando-se ao canal de vácuo funcionou melhor do que o estágio redondo com um único orifício central.
    2. Solte 70-90 μL de polímero CYTOP tipo A no centro do substrato de vidro. Reveste imediatamente o polímero(Figura 1B).
      NOTA: A condição de revestimento de spin (3.400 rpm, 30 s) fornece 3 μm de espessura. Use a micropipette projetada para líquido viscoso. Segure a micropipette na vertical para fazer o polímero cair quase perfeitamente no substrato. Uma bolha de ar é frequentemente gerada dentro da ponta da pipeta à medida que o êmbolo se move para baixo. Não deixe cair a última gota de CYTOP com a bolha.
    3. Pegue o vidro revestido com os dedos segurando os cantos do substrato de vidro e coloque-o sobre a folha de alumínio.
    4. Repita as etapas 1.3.1-1.3.3 para revestir todas as peças restantes do vidro de cobertura.
    5. Asse o copo revestido a 80 °C por 30 min e depois a 200 °C por 1h.
      NOTA: Este processamento cura totalmente o CYTOP e liga o CYTOP à superfície do vidro. Cubra a área de cozimento com uma tampa feita de papel alumínio para evitar poeira potencial durante o processo de cozimento de longa data, se necessário.
    6. Remova o vidro de cobertura revestido de CYTOP da placa de aquecimento e esfrie para RT. Pegue cuidadosamente cada pedaço do vidro revestido e inspecione-o para ver se está devidamente revestido. Descarte o substrato exibindo revestimento inhomogêneo.
      NOTA: A superfície de um CYTOP bem revestido deve parecer plana sem padrões irregulares semelhantes ao arco-íris(Figura 1C). A inspeção visual de um ângulo adequado pode julgar rapidamente o achatamento, bem como a qualidade do revestimento. O protocolo pode ser pausado aqui.
  4. Fotoresist de spin-coating
    1. Coloque o vidro de cobertura revestido de CYTOP no mandril a vácuo (ver passo 1.3.1) do revestimento de giro. Ligue o interruptor de vácuo para fixar o vidro de cobertura.
    2. Queda de 0,2-0,3 mL de fotoresist no centro do substrato. Imediatamente gire o fotoresist a 6.000 rpm por 60 s.
      NOTA: Não deixe cair a última gota do fotoresist com bolhas. Se o revestimento de giro suportar maior velocidade de giro, a velocidade de giro pode ser de até 7.500 rpm para obter um revestimento mais fino. A baixa energia superficial do CYTOP impede que a maioria dos fotoresistas seja aderida à sua superfície. Se o fotoresist AZ P4903 não estiver disponível, o fotoresist AZ P4620 é uma boa alternativa.
    3. Pegue o substrato revestido com dois dedos segurando cantos do substrato. Limpe o excesso de fotoresist próximo à borda do substrato (muitas vezes chamado de remoção de contas de borda ou EBR) usando um limpador limpo encharcado de etanol(Figura 1D). Coloque o substrato sobre a folha de alumínio.
      NOTA: A acetona NÃO é recomendada para ebr.
    4. Repita as etapas 1.4.1-1.4.3 para girar o fotoresist para as peças restantes de vidro de capa revestido CYTOP. Pegue cada pedaço do vidro revestido e inspecione-o para ver se está devidamente revestido.
      NOTA: A superfície de um fotoresist bem revestido deve parecer plana sem padrões irregulares(Figura 1D). A inspeção visual de um ângulo adequado pode julgar rapidamente o achatamento, bem como a qualidade do revestimento. O substrato que exibe revestimento inhomogêneo pode ser reciclado através da lavagem com acetona, 2-propanol e H2O em sequência, e reutilizado.
    5. Asse o substrato revestido a 110 °C por 5 minutos na placa de aquecimento.
    6. Remova o substrato revestido da placa quente e esfrie para rt. Deixe-nos ficar por 30 minutos com umidade relativa de 40%-60% para reidratação do fotoresist.
      NOTA: H2O é necessário para a seguinte reação fotoquímica. O fotoresist assado perdeu o conteúdo H2O dentro do fotoresist. O processo de reidratação permite que H2O seja absorvido do ar. A umidade relativa abaixo de 20% ou superior a 80% não é adequada para o processo de reidratação.
  5. Photolithography
    1. Durante o tempo de espera da reidratação (ver passo 1.4.6), inicie o alinhador da máscara. Aqueça a fonte de luz. Carregue a máscara cromada.
      NOTA: Siga o manual de instruções para operar o alinhador de máscaras. A máscara fotográfica pode ser fabricada através da litografia do feixe de elétrons (EB) se a instalação EB estiver disponível. Alternativamente, o fotomask pode ser terceirizado para uma empresa local.
    2. Carregue o substrato rehidratado (após terminar a etapa 1.4.6) no mandril(Figura 1E).
    3. Definir parâmetros de exposição. Exponha o substrato para 25 s com uma intensidade UV de 13 mW/cm2 (h-line) no modo de contato a vácuo. Em seguida, descarregue o substrato e coloque-o no rack de coloração de vidro de cobertura (o mesmo rack usado na etapa 1.1.1).
    4. Repita as etapas 1.5.2-1.5.3 para expor as peças restantes do substrato rehidratado.
  6. Desenvolvimento
    1. Desenvolva o substrato por 5 minutos para dissolver o fotoresist exposto(Figura 1F). Durante o qual, agite suavemente o rack no desenvolvedor uma vez no ponto de tempo de 4 minutos.
      NOTA: O desenvolvedor era AZ 300 MIF. Desenvolvedores alcalinos alternativos (por exemplo, AZ 400 K) são geralmente aplicáveis para o desenvolvimento, mas devem exigir otimização das condições de desenvolvimento (por exemplo, tempo, temperatura, agitação). NÃO use béquers de vidro como recipiente de desenvolvedor.
    2. Enxágüe o substrato usando água pura por dez vezes. Mantenha o vidro da tampa na água pura.
      NOTA: Descarte o desenvolvedor para o tanque designado.
    3. Seque completamente cada pedaço de substrato com a pistola de ar.
  7. Gravura de íons reativos
    1. Coloque o substrato seco (a partir da etapa 1.6.3) na câmara de reação da máquina de gravura de íons reativos (RIE).
      NOTA: De acordo com a regra de manutenção da instalação, a máquina RIE pode estar sempre desligada ou desligada todas as vezes. Se o interruptor estiver desligado, ligue o interruptor de acordo com o manual.
    2. Etch o CYTOP descoberto pelo fotoresistista com o plasma O2 (Figura 1G).
      NOTA: A condição rie foi a seguinte. Taxa de fluxo de gás O2: 50 sccm; pressão da câmara: 10.0 Pa; Potência RF: 50 W; tempo de gravação: 27 min. O tempo de gravação foi otimizado para a gravura completamente de 3 μm de espessura do CYTOP.
    3. Pegue cada pedaço de substrato da câmara de reação usando a pinça e coloque-os no rack de coloração de vidro da tampa.
      NOTA: De acordo com a regra de manutenção da instalação, a câmara de reação pode exigir um curto processo de limpeza de plasma O2 (por exemplo, tempo de gravação: 5 min) para manter a câmara de reação limpa após cada execução.
  8. Remoção fotoresist e limpeza
    1. Sonicar o substrato em acetona por 5 min no RT para dissolver o fotoresist restante.
    2. Sonicar o substrato em 2-propanol por 5 min no RT.
    3. Enxágüe o substrato usando água pura por cinco vezes. Sonicar o substrato por 5 min na RT. Enxágue a amostra usando água pura por mais cinco vezes. Mantenha o substrato em água pura.
    4. Seque cada pedaço de substrato com a pistola de ar(Figura 1H).
      NOTA: O substrato pode ser armazenado em uma placa de petri de plástico. O substrato fabricado é estruturalmente estável na RT por pelo menos um ano. O protocolo pode ser pausado aqui.
    5. Caracterize o perfil superficial do substrato preparado como preparado por microscopia confocíquica de varredura a laser tridimensional (3D), interferometria de luz branca (ou interferometria de varredura de coerência) ou microscopia eletrônica de varredura. Use o respectivo software para medir o diâmetro e a profundidade dos microchambers resultantes.
      NOTA: A amostra pode ser reutilizada para outros experimentos após a caracterização com o microscópio confocal de varredura a laser 3D não-contato e não destrutivo ou interferômetro de luz branca. O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Preparação do microcanal polidimetilsiloxano (PDMS)

NOTA: NÃO use luvas de látex para manusear PDMS. Em vez disso, use luvas de polietileno (PE).

  1. Fazendo o mestre microcanal
    1. Corte uma fita de filme Kapton de revestimento duplo em uma forma de microcanal definida (3 mm x 19 mm) usando um cortador de desktop.
      NOTA: A fita kapton foi nº 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), resultando em uma altura de canal de 135 μm. O cortador de desktop STIKA usa um plugin (disponível no site da Roland: https://www.rolanddga.com) da Adobe Illustrator para executar o corte de acordo com o desenho no arquivo Adobe Illustrator. O protocolo pode ser pausado aqui.
    2. Coloque cada fita kapton cortada no fundo plano de uma placa de Petri. A placa petri padrão de 90 mm pode acomodar 12 pedaços da fita.
      NOTA: A estrutura de relevo serve como mestre para a moldagem de réplicas do PDMS. Pressione a superfície da fita suavemente com uma pinça se houver alguma bolha de ar entre a fita e o substrato da placa de Petri. Alternativamente, a litografia clássica macia pode ser aplicada para preparar o mestre em um waferde silício 38. O protocolo pode ser pausado aqui.
  2. Curando resina PDMS na placa de Petri com padrão de fita
    1. Use novas luvas pe, e transfira 2,5 g de agente de cura do elastômero de silicone SYLGARD 184 usando uma pipeta de plástico descartável no béquer plástico especificado(Figura 2A).
    2. Mude-se em luvas novas e transfira 25 g da base prepolímero do elastômero de silicone SYLGARD 184 usando uma seringa descartável de 50 mL no béquer de plástico acima.
      NOTA: Troque as luvas aqui para evitar a possível contaminação cruzada do agente de cura para a base.
    3. Use uma batedeira de deaeração para misturar e desaerar a mistura (programa: mistura de 3 minutos seguida de deaeração de 2 min).
      NOTA: Se a misturadora de deaeração não estiver disponível, uma mistura agitada manualmente (por cerca de 15 minutos) pode ser desgaseada em uma câmara de vácuo.
    4. Despeje a mistura PDMS na placa petri com padrão de fita(Figura 2B). Coloque a placa de Petri em uma mini câmara de vácuo e desaerar a mistura PDMS por 1-3 h(Figura 2C).
      NOTA: Se algum ar permanecer na mistura PDMS após 1h, tire a placa de Petri da câmara de vácuo, quebre a bolha de ar usando um soprador de ar e, em seguida, coloque a placa de Petri de volta na câmara de vácuo e continue o processo de desaeração.
    5. Coloque a placa de Petri em forno a 60 °C durante a noite para curar o PDMS (Figura 2D).
      NOTA: Embora o aumento da temperatura possa encurtar o tempo de cura, a temperatura máxima que pode ser tolerada pela placa petri de poliestireno sem deformação física é de cerca de 60 °C.
  3. Moldagem de réplica do canal PDMS
    1. Retire o elastomer PDMS curado da placa de Petri(Figura 2E).
    2. Corte cada pedaço de blocos de canais PDMS usando um cortador de cabo plano(Figura 2F).
    3. Coloque o elastômero PDMS em um tapete de corte voltado para o lado do canal para cima. Faça um buraco em cada extremidade do canal usando um soco de biópsia(Figura 2G).
    4. Limpe a superfície do canal PDMS com fita adesiva. Em seguida, enrole a resina PDMS em outro pedaço de fita adesiva para mantê-la limpa antes de usar. Armazene o canal PDMS preparado em uma placa de Petri limpa.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. Montagem do dispositivo de matriz de microchamador femtoliter

  1. Coloque alguns pedaços de limpadores limpos encharcados de água ao longo da parede interna de uma placa de Petri para fazer uma câmara umidificante simplificada. Coloque a resina PDMS coberta pela fita escocesa na câmara umidificante e sele a câmara usando filme de parafina. Incubar por pelo menos 3h, mas não mais do que um dia.
    NOTA: PDMS é um material poroso que permite que o gás passe através da resina39. A estrutura porosa do PDMS leva a uma absorção de moléculas de água do entorno até chegar a um equilíbrio. Este pré-tratamento enche os poros de PDMS com vapor de água e pode reprimir significativamente a evaporação de gotículas aquosas adjacentes à borda do canal PDMS.
  2. Tire a fita adesiva da resina PDMS. Posicione o canal PDMS na área de matriz de microcletrades do substrato(Figura 2H).
    NOTA: A resina PDMS adere reversivelmente à superfície CYTOP. Pressione o bloco PDMS suavemente com uma pinça para remover quaisquer bolhas de ar entre a resina PDMS e o substrato se existir.
  3. Insira uma ponta de pipeta não filtrada de 200 μL a uma (como saída) dos orifícios do canal PDMS.
    NOTA: A força de adesão entre PDMS e CYTOP é limitada. Para evitar a deformação física da resina PDMS, bem como o desprendimento do canal PDMS fora da superfície, não insira a ponta da pipeta muito profunda.

4. Solução de reação de carregamento ao dispositivo montado

  1. Coloque um microtubo de alumínio no gelo. Prechill o óleo de descarga (óleo ASAHIKLIN AE-3000 misturado com 0,1 wt % SURFACTANTE SURFLON S-386) em um microtubo de 1,5 mL no suporte de alumínio.
  2. Coloque outro bloco de alumínio no gelo.
  3. Preparação da solução de reação CFPS
    1. Prepare a solução de reação CFPS em um tubo PCR. Misture cada componente de alíquota do kit CFPS, um DNA de modelo diluído (conforme exemplificado aqui pela proteína fluorescente mNeonGreen40 e Escherichia coli alcalina fosfate41) solução, e outros componentes necessários de acordo com as necessidades específicas (por exemplo, inibidor de RNase, substrato fluorogênico, acompanhante).
      NOTA: O DNA do modelo utilizado para CFPS deve ser preparado de acordo com a instrução do kit CFPS correspondente. Esta demonstração aplicou um sistema de expressão baseado em T742. Como o consumo de reagente no dispositivo FemDA é bastante pequeno, 10 μL é grande o suficiente para preencher todo o canal PDMS.
    2. Para a síntese de proteína fluorescente mNeonGreen, misture os componentes na seguinte ordem: adicione 2,7 μL de H2O sem nuclease a uma alíquota de 6 μL da solução A (do kit CFPS); adicionar 0,3 μL de inibidor de RNase; adicionar 1,5 μL de solução de DNA de modelo diluído; misture brevemente e transfira a mistura para uma alíquota de 4,5 μL da solução B (do kit CFPS).
      NOTA: O volume total é de 15 μL. Como a quantidade de cada alíquota é proporcional ao volume total da mistura final, um volume total inferior a 10 μL pode resultar em um volume muito pequeno (< 0,2 μL) de alguma alíquota componente.
    3. Para síntese de fosfatase alcalina, misture os componentes na seguinte ordem: adicione 1,2 μL de H2O a 6 μL de solução A; adicionar 0,3 μL de inibidor de RNase; adicionar 0,6 μL de melhorador de ligação de dissulfeto 1 e 2 (a partir de um kit); adicionar 0,3 μL de 5 mM 6,8-difluoro-4-metilumbelliferyto fosfato (DiFMUP); adicionar 1,5 μL de solução de DNA; misture brevemente e transfira a mistura para 4,5 μL de solução B.
      NOTA: No ensaio da fosfatase alcalina, o substrato fluorogênico DiFMUP pode produzir altamente fluorescente 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcoumarina (DiFMU) sobre o decote enzimático do grupo fosfato terminal.
  4. Desenhe 10 μL da mistura usando uma ponta de pipeta não filtrada de 200 μL. Insira a ponta da pipeta no orifício de entrada (consulte a etapa 3.3) do canal PDMS. Empurre para baixo no êmbolo para injetar a solução no canal até que ela transborda da tomada (onde outra ponta de pipeta já foi inserida na etapa 3.3).
  5. Separe a pipeta da ponta da pipeta e mantenha essas duas pontas de pipeta ainda inseridas na entrada e na saída.
    NOTA: Evite gerar bolhas de ar durante a tubulação. Não deixe o polegar do êmbolo até separar a pipeta da ponta da pipeta para evitar o backflow da solução dentro do canal PDMS.

5. Geração de matriz de gotícula femtoliter (FemDA) para CFPS

  1. Transfira todo o conjunto do dispositivo montado para o bloco de alumínio pré-refrigerado (ver passo 4.2). Confirme cuidadosamente que a área de matriz de microcâmara passa rapidamente de translúcida(Figura 2I) para transparente(Figura 2J).
    NOTA: A solução de reação CFPS não pode entrar diretamente nos microchambers. A solubilidade do ar na água é em proporção inversa à temperatura. O ar preso se dissolverá na solução depois que o dispositivo foi movido de RT para a baixa temperatura. A mudança de transparência é um indicador visual conveniente para avaliar se a solução entra nos microchambers.
  2. Desenhe 30 μL do óleo de descarga pré-refrigerado (ver passo 4.1) e transfira imediatamente o óleo para a ponta de pipeta inserida por entrada a partir de sua abertura superior. O óleo de descarga se move para o canal e extrudia a solução de reação em excesso localizada fora dos microchambers. Cada microcâmara é isolada pelo óleo de descarga.
    NOTA: A interface móvel entre a solução de reação e o óleo de descarga é visível, o que ajuda as pessoas a observar o movimento do fluido dentro do canal. A solução extrudada pode ser coletada no tubo anterior, armazenada a 4 °C, e reutilizada para outro dispositivo FemDA ou uma reação a granel paralela (no microtubo ou em uma placa de microtúrculo).
  3. Pré-desenhe 30 μL de óleo de vedação (Fomblin Y25) para uma ponta de pipeta filtrada de 200 μL. Pendure a pipeta em algum lugar.
  4. Remova simultaneamente as duas pontas de pipeta inseridas (ver as etapas 3.3 e 4.4) do dispositivo. Mova imediatamente o dispositivo do bloco de alumínio para o parafilm.
    NOTA: Use uma pinça para corrigir (mas mantenha-se longe da área do canal) no dispositivo no bloco de alumínio durante o período de remoção das pontas da pipeta.
  5. Insira imediatamente a ponta de pipeta pronta contendo o óleo de vedação (ver passo 5.3) na entrada do canal PDMS e injete o óleo no canal até que ele transborde da tomada.
    NOTA: Realize esta etapa assim que mover o dispositivo para RT. Para evitar o fluxo de volta dentro do canal, não deixe o polegar do êmbolo até que o óleo de vedação transborde da tomada. O óleo de descarga evapora imediatamente após sair da saída do canal, enquanto o óleo de vedação se acumula na tomada devido à sua perda de evaporação extremamente baixa.
  6. Separe a pipeta da ponta da pipeta e, em seguida, remova a ponta da pipeta do dispositivo. Limpe a superfície PDMS usando um pedaço do limpador limpo e, em seguida, aplique uma nova gota de óleo de vedação na entrada e saída, respectivamente. As gotículas femtoliter são seladas em microchambers individuais pelo óleo.
    NOTA: Use uma pinça para corrigir (mas mantenha-se longe da área do canal) no canal PDMS no substrato durante o período de remoção da ponta da micropipette.
  7. Limpe a umidade acumulada na superfície inferior do vidro de cobertura. O dispositivo FemDA preparado está agora pronto para incubação e imagens de microscopia.

6. Imagem de microscopia

  1. Inicie um microscópio de fluorescência invertido. Aguarde a estabilização (resfriamento) da câmera. Use uma lente objetiva de imersão de óleo de 60x ou 100x. Coloque o dispositivo FemDA no estágio motorizado. Defina os parâmetros de imagem.
    NOTA: Os parâmetros de imagem incluem o caminho do arquivo, canais de imagem, filtros, tempos de exposição (em geral, 100 ms é suficiente; tempo mais curto ou maior também é possível de acordo com a especificação da câmera) e intensidade da luz.
  2. Encontre o avião focal. Ajuste a posição do eixo z da lente objetiva e fixe o plano focal usando um sistema de foco automático interno. Defina a região de interesse (ROI; ou seja, x, y-axis) a ser imageada.
    NOTA: Os principais fabricantes de microscópio (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) oferecem a opção de integrar o sistema de foco automático com o microscópio. Este sistema de foco automático é necessário para manter o plano focal constante durante a imagem automática de várias áreas. Os ROIs cobrem a área femda no canal PDMS.
  3. Capture as imagens de fluorescência. Capture um único quadro de uma imagem de campo brilhante desfocado (BF) para cada ROI. NÃO altere a ordem e as coordenadas dos ROIs ao fotografar os diferentes canais.

7. Análise de dados de imagem

NOTA: Analise os dados da imagem usando um plugin caseiro (chamado "FemDA") baseado em Fiji (http://fiji.sc) para extrair a intensidade de fluorescência de cada gotícula43. Instale a versão correta de Fiji de acordo com o sistema operacional. Fiji suporta a maioria dos formatos de arquivo de imagem (por exemplo, o arquivo nd2 do microscópio Nikon, arquivo czi do microscópio Zeiss) usando um plug-in "Bio-Formats".

  1. Instalação de plugin
    1. Copie e cole o arquivo de plugin (que está disponível no momento da consulta ao autor correspondente ou através do seguinte link institucional: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) na pasta "plugins" de Fiji.
    2. Iniciar o software Fiji; o plugin "FemDA" pode ser encontrado no menu suspenso "Plugins" de Fiji.
  2. Pré-processamento de dados de imagem
    1. Abra a imagem BF desfocada (ver passo 6.3). Clique em Processo | Subtrair fundo... para remover fundos contínuos suaves de cada quadro dos dados de imagem(Figura 4B). Clique em Processo | Filtros | Mediana para reduzir o ruído de cada quadro dos dados da imagem(Figura 4C).
    2. Clique em Imagem | Ajuste | Limiar para verificar e separar o primeiro plano (indicando os microchambers) do fundo (indicando a área fora dos microchambers) de cada quadro dos dados da imagem (inserções ampliadas na Figura 4A-C).
      NOTA: Selecione um algoritmo adequado da lista de drop-down na janela Limiar para que apenas as áreas de microcâmara, bem como as bordas de cada microcâmara, possam ser identificadas e destacadas como o primeiro plano. Em particular, a maioria das bordas destacadas deve ser contínua sem lacunas.
  3. Determinação da coordenada de gotícula
    1. Clique em Plugins | FemDA | Análise FemDA para abrir a interface gráfica do usuário (GUI) do plugin personalizado (metade superior da Figura 4D).
    2. Insira o número mínimo e máximo aproximado de pixels de uma única microcâmara. Insira a circularidade mínima e máxima esperada (0: forma arbitrária; 1: círculo perfeito) dos microchambers. Insira o número do quadro do quadro inicial e o quadro final.
    3. Clique em Gerar ROI na GUI para detectar cada microcâmara, e os ROIs detectados com sucesso são mostrados em um ROITablede janela pop-up .
    4. Volte para a janela Análise FemDA e clique no botão Aplique máscara de ROI para verificar se os microchambers sobre os quadros foram detectados corretamente (inferior esquerdo da Figura 4D). Se não, modifique alguns deles e repita o clique em Gerar ROI e Aplicar máscara de ROI. Se sim, vá para o próximo passo.
      NOTA: Pode haver muito poucos microchambers que não podem ser bem identificados como o ROI (ver a metade inferior da Figura 4D) por qualquer algoritmo do Limiar devido ao contraste insuficiente entre o primeiro plano e o fundo. Não é problemático no ponto de vista estatístico.
  4. Extração de intensidade de fluorescência
    1. Abra a imagem da fluorescência e traga-a para a frente. Clique em Aplicar a máscara roi novamente para aplicar os ROIs determinados na imagem de fluorescência (inferior direito da Figura 4D).
    2. Selecione one-shot para analisar uma imagem de ponto final (como exemplificado com os dados mNeonGreen) ou Time-Lapse para analisar um data de curso de tempo (como exemplificado com os dados fosfatados alcalinos).
    3. Entrada 100 na caixa O número de pixels superiores significa que apenas os 100 pixels superiores de cada ROI serão usados para calcular a intensidade média da gotícula correspondente. Se a entrada 0 no número de pixels superiores,todos os pixels de cada ROI serão usados para calcular a intensidade média da gotícula correspondente.
      NOTA: Pode haver uma deriva de vários pixels entre as imagens BF e fluorescência, o que significa que alguns pixels dentro dos ROIs podem pertencer ao fundo da imagem de fluorescência. Assim, o plugin fornece uma opção para especificar o número de pixels classificados em alta intensidade para o cálculo da intensidade média de cada gotícula.
    4. Para analisar a imagem de ponto final (ou seja, selecione One-Shot na etapa 7.4.2), clique no botão Medir intensidade para calcular as intensidades médias de todas as gotículas detectadas. O ROITable é atualizado com os novos dados da imagem de fluorescência. Enquanto isso, um histograma é exibido em uma nova janela pop-up Histogram (Figura 4E).
      NOTA: Alterar o tamanho da lixeira na caixa O número da caixa pode otimizar a exibição do histograma. Uma adequada para uma soma de distribuições gaussianas pode ser realizada na GUI desenvolvida. A janela popup Log de Fiji exibe os resultados de montagem. Alternativamente, exporte os dados clicando no botão salvar como texto e realizar várias análises estatísticas com outros softwares ( Figura4F, G).
    5. Para a análise da imagem do curso de tempo (ou seja, selecione Time-Lapse na etapa 7.4.2), a janela pop-up é o Curso de Tempo de Intensidade em vez de Histograma, que contém um histograma correspondente a um ponto de tempo específico e um enredo de intensidade de tempo(Figura 5). Os dados textuais também podem ser exportados usando o menu Arquivo da janela pop-up.

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Resultados

O processo de microfabricação consiste em limpeza de substratos, funcionalização de superfície, revestimento CYTOP, fotolitografia, gravura a seco, despojo fotoresist e limpeza final. É importante ressaltar que o protocolo apresentado permitiu a remoção completa do polímero CYTOP hidrofóbico dentro dos microchambers Figura 3A, produzindo uma estrutura hidrofóbica-hidrofóbica altamente paralela em um substrato de vidro de cobertura padrão. Com o auxílio do protocolo de vedação...

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Discussão

A medição altamente quantitativa baseada nas gotículas altamente uniformes, estáveis e biocompatíveis no FemDA possibilitou a distribuição discreta, a característica única do nosso estudo diferente das outras. Otimizamos sistematicamente e detalhamos os processos de microfabização e formação de gotículas neste artigo. Existem várias etapas críticas no protocolo estabelecido.

Primeiro, o revestimento uniforme do polímero CYTOP altamente viscoso no substrato de vidro fino retang...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo número de subvenção JSPS KAKENHI JP18K14260 e pelo orçamento da Agência japonesa de Ciência e Tecnologia da Terra Marinha. Agradecemos a Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) por fornecerem as instalações de caracterização. Agradecemos a Ken Takai (JAMSTEC) pelo suporte a software comercial. A microfabização foi realizada na Supercleanroom Takeda Sentanchi, a Universidade de Tóquio, apoiada pelo "Programa plataforma de nanotecnologia" do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão, Número de Subvenção JPMXP09F19UT0087.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-aminopropyl)triethoxysilaneSigma-Aldrich440140
1 mL syringeTerumoSS-01T
2-propanolKanto ChemicalEL gradeEL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscopeLasertecOPTELICS HYBRIDOther similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringeTerumoSS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphateThermo Fisher ScientificD6567Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
AcetoneKanto ChemicalEL gradeEL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blowerHozanZ-263
Aluminum blockBIO-BIKAB-24M-02
Aluminum microtube standBIO-BIKAB-136C
ASAHIKLIN AE-3000AGC(Test sample)Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiperOzu028208
Biopsy punch with plungerKaiBPP-10F
Cover glassMatsunami GlassNo. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)Size-customized.
Cover glass staining rackNakayama803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiperNippon Paper CreciaC100-M
Cutting matGE HealthcareWB100020
CYTOPAGCCTL-816AP
Deaeration mixerThinkyAR-100
Desktop cutterRolandSTIKA SV-8
DeveloperAZ Electronic MaterialsAZ 300 MIFAZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tapeTeraoka Seisakusho7602 #25
EthanolKanto ChemicalEL gradeEL: for electronic use.
Purity 99.5%.
FijiVersion: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutterTokyo-IDEALMT-0100
Fomblin oilSolvayY25, or Y25/6Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plateAS ONETH-900
Injection needleTerumoNN-2270C22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscopeNikonEclipse Ti-EEpifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraphSynergyVersion: 4.5
Mask alignerSUSSMA-6Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipetteGILSONE M250ECapillary piston tip: CP250
Microsoft ExcelMicrosoftVersion: 16.16.15
Mini vacuum chamberAS ONEMVP-100MV
Nuclease-free waterNIPPON GENE316-90101
ParafilmAmcorPM-996
PCR tubeNIPPON GeneticsFG-021D/SP
Petri dishAS ONEGD90-15Diameter 90 mm, height 15 mm.
PhotoresistAZ Electronic MaterialsAZ P4903AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate readerBioTekPOWERSCAN HT
Polyethelene glovesAS ONE6-896-02Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kitNew England BiolabsE6800S or E6800LFor cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching systemSamcoRIE-10NROther RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitorNew England BiolabsM0314S
Scotch tape3M810-1-18D
Sodium hydroxide solutionFUJIFILM Wako Pure Chemical194-095758 M concentration; danger.
Spin coaterOshiganeSC-308
SURFLON S-386 surfactantAGC(Test sample)Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomerDowSylgard184Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
TweezersIdeal-tek2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleanerAS ONEASU-2M
Vacuum chuckOshigane(Customized)Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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