Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais

Resumo

Este protocolo descreve em detalhes como o material vegetal para imunolocalização de proteínas e pectinas arabinogalactanas é fixado, embutido em uma resina acrílica hidrofílica, seccionada e montada em lâminas de vidro. Mostramos que epítopos relacionados à parede celular serão detectados com anticorpos específicos.

Resumo

O desenvolvimento da planta envolve ajustes constantes da composição e estrutura da parede celular em resposta a estímulos internos e externos. As paredes celulares são compostas de polissacarídeos de celulose e não celulósicos, juntamente com proteínas, compostos fenólicos e água. 90% da parede celular é composta de polissacarídeos (por exemplo, pectinas) e proteínas arabinogalactanas (AGPs). A imunolocalização fluorescente de epítopos glicanos específicos em seções histológicas vegetais continua sendo uma ferramenta fundamental para descobrir a remodelagem de redes, estrutura e componentes de polissacarídeos de parede.

Aqui, relatamos um procedimento otimizado de imunolocalização fluorescente para detectar epítopos glicanos de AGPs e pectinas em tecidos vegetais. A fixação de paraformaldeído/glutaraldeído foi utilizada juntamente com a incorporação LR-White das amostras da planta, permitindo uma melhor preservação da estrutura e composição do tecido. Foram utilizadas seções finas das amostras incorporadas obtidas com ultra-microtódomo para imunolocalização com anticorpos específicos. Esta técnica oferece grande resolução, alta especificidade e a chance de detectar vários epítopos glicanos na mesma amostra. Esta técnica permite a localização subcelular de glicanos e detecta seu nível de acumulação na parede celular. Também permite a determinação de padrões espátulais-temporais de AGP e distribuição de pectina durante os processos de desenvolvimento. O uso desta ferramenta pode, em última análise, orientar as instruções de pesquisa e vincular glicocanos a funções específicas nas plantas. Além disso, as informações obtidas podem complementar estudos bioquímicos e de expressão genética.

Introdução

As paredes celulares das plantas são estruturas complexas compostas de polissacarídeos e glicoproteínas. As paredes celulares são estruturas extremamente dinâmicas cuja arquitetura, organização e composição variam de acordo com o tipo celular, localização, estágio de desenvolvimento, estímulos externos e internos¹. Proteínas arabinogalactanas (AGPs) e pectinas são componentes importantes da parede celular vegetal. AgPs são proteínas altamente glicosylated e pectinas são polissacarídeos homogalacturoanos cuja composição, quantidade e estrutura variam muito durante diferentes estágios de desenvolvimento vegetal^2,3,4. Estudos de AGPs e pectina revelaram seu envolvimento em diversos processos vegetais, como morte celular programada, resposta a estresses abióticos, reprodução sexual de plantas, entre muitos outros⁵. A maioria desses estudos começou com informações obtidas a partir de estudos de imunolocalização.

Dada a sua complexidade, o estudo das paredes celulares requer muitas ferramentas diferentes. A detecção de epítopos glicanos usando anticorpos monoclonais (mAbs) é uma abordagem valiosa para resolver a distribuição de polissacarídeos e glicoproteínas ao longo desta estrutura. Há uma grande coleção de mAbs disponíveis para detectar epítopos glicanos e a especificidade de cada mAb está sendo continuamente melhorada, bem como⁶. A técnica aqui descrita é aplicável a todas as espécies vegetais, e é uma ferramenta perfeita para orientar futuras direções de pesquisa que podem envolver técnicas mais caras e complexas.

Nesta técnica, anticorpos específicos são quimicamente conjugados a corantes fluorescentes como FITC (isotiocianato de fluoresceína), TRITC (tetrametilrhodamina-5-(e 6)-isothionato) ou vários corantes de Fluor Alexa. A imunofluorescência oferece várias vantagens, permitindo uma localização subcelular clara e rápida de glicocanos que podem ser diretamente observados sob um microscópio de fluorescência. É altamente específico e sensível, uma vez que a preparação da amostra pode efetivamente proteger a estrutura natural do antígeno, mesmo que presente em quantidades menores. Permite a detecção de múltiplos antígenos na mesma amostra e, o mais importante, oferece resultados de alta qualidade e visualmente bonitos. Apesar do grande poder oferecido pelos estudos de imunolocalização da fluorescência, muitas vezes são considerados difíceis de executar e implementar provavelmente devido à falta de protocolos detalhados que permitem a visualização das diferentes etapas do procedimento. Aqui, fornecemos algumas diretrizes simples sobre como executar essa técnica e como obter imagens de alta qualidade.

Para o protocolo aqui apresentado, as amostras devem primeiro ser fixadas e incorporadas utilizando o fixador mais adequado. Embora considerada como uma técnica demorada e relativamente tediosa, a fixação adequada e a incorporação da amostra vegetal é a chave para garantir um ensaio de imunolocalização bem-sucedido. Para isso, o mais usual é a fixação química usando fixação de crosslinking, como aldeídos. Fixações transversais estabelecem ligações químicas entre moléculas do tecido, estabilizando e endurecendo a amostra. Formaldeído e glutaraldeído são fixativos transfronteiriços, e às vezes uma mistura de ambos os fixativos é usada⁷. O formaldeído oferece grande preservação estrutural dos tecidos e por longos períodos de tempo, produzindo pequenas retrações teciduais e sendo compatível com a imunosstaining. Glutaraldeído é um fixador mais forte e estável geralmente usado em combinação com formaldeído. O uso de glutaraldeído tem algumas desvantagens que devem ser levadas em conta, pois introduz alguns grupos de aldeído gratuitos no tecido fixo, o que pode gerar alguma rotulagem inespecífica. Além disso, a ligação cruzada entre proteínas e outras moléculas ocasionalmente pode tornar alguns epítopos alvo inacessíveis para os anticorpos. Para evitar isso, a quantidade e a duração da fixação devem ser cuidadosamente definidas.

Após a fixação, as amostras são incorporadas na resina adequada para endurecer antes de obter as seções. Resina de Londres (LR-White) resina acrílica é a resina escolhida para estudos de imunolocalização. Ao contrário de outras resinas, lR-White é hidrofílico, permitindo que os anticorpos cheguem aos seus antígenos, sem necessidade de qualquer tratamento para facilitar isso. O LR-White também tem a vantagem de oferecer baixa fluorescência automática, permitindo uma redução do ruído de fundo durante a imagem de imunofluorescência.

Existem muitas técnicas de coloração disponíveis para detectar diferentes componentes da parede celular, como coloração azul alciano, coloração azul toluidina ou coloração periódica de ácido -Schiff (PAS). Nada disso oferece o poder das análises de imunolocalização⁸. Essa abordagem dá maior especificidade na detecção de glicanos, oferecendo informações mais amplas sobre a composição e estrutura da parede celular.

Protocolo

1. Preparação da amostra: fixação, desidratação e incorporação LR-White

1. Fixação e desidratação
   NOTA: O processo de fixação é fundamental para preservar a amostra; cruzando moléculas, o metabolismo celular é interrompido, garantindo a integridade celular e prevenindo a difusão molecular. Os agentes fixadores e a concentração utilizada devem ser ajustados a esse fim, deixando os antígenos suficientemente expostos para interagir com os anticorpos. O protocolo a seguir combina a leve capacidade fixativa do paraformaldeído, com o efeito mais forte do glutaraldeído. Suas proporções foram otimizadas para AGPs e componentes de parede celular, mas é adequada para outras proteínas e estruturas celulares. O processo de desidratação subsequente preparará as amostras para incorporação LR-White. Tecidos vegetais de várias espécies vegetais foram usados neste experimento. Amostras de suber quercus foram coletadas de árvores cultivadas no campo. As amostras de Trithuria submersa foram gentilmente compartilhadas conosco por Paula Rudall (Kew Gardens, Londres, Reino Unido).
   1. Semear todas as plantas arabidopsis diretamente no solo e crescer em uma instalação de crescimento interior com 60% de umidade relativa e um ciclo dia/noite de luz de 16h a 21 °C e 8h de escuridão a 18 °C. Selecione os tecidos vegetais a serem analisados e corte amostras de tamanho não superior a 16 mm^2.
   2. Transfira imediatamente a amostra para um frasco de vidro previamente preenchido com solução fixativa fria suficiente (2% formaldeído (c/v), 2,5% glutaraldeído (w/v), 25 mM PIPES pH 7 e 0,001% Tween-20 (v/v)) para submergir completamente as amostras(Figura 1A).
      ATENÇÃO: Formaldeído e glutaraldeído são agentes fixadores que podem ser prejudiciais por inalação e contato. Realize o passo de fixação em um capô de fumaça e use roupas de proteção adequadas e luvas de nitrilho. Todas as soluções a partir desta etapa, incluindo a série de álcool até 70%, devem ser armazenadas para posterior descontaminação por equipe especializada.
   3. Depois de juntar todas as amostras, refresque o fixador.
   4. Transfira os frascos para uma câmara de vácuo e aplique lentamente o vácuo. Ao atingir -60 kPa, o material flutuante começará a afundar até o fundo do frasco (Figura 1B).
   5. Mantenha-se sob um vácuo de no máximo -80 kPa por 2 h em temperatura ambiente.
   6. Solte lentamente o vácuo, sele o frasco de vidro e coloque durante a noite a 4 °C.
   7. Descarte quaisquer amostras que não afundaram durante a fixação durante a noite. Lave as amostras restantes com 25 mM PBS pH 7 por 10 min, seguida de uma lavagem de 20 min em pH tampão PIPES de 25 mM 7.2.
   8. Desidratar as amostras em uma série de etanol (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% e 3x 100% etanol) para 20 min cada. Transfira imediatamente as amostras desidratadas para frascos de vidro rotulados para incorporação(Figura 1C).
      NOTA: O processo de desidratação pode ser pausado na etapa de 70% de etanol.
2. Incorporação de resina LR-White
   NOTA: LR-white é uma resina acrílica não hidrofóbica com baixa viscosidade, tornando-a ideal para penetrar tecidos com muitas camadas de paredes celulares grossas. LR-White também vem em várias notas de dureza compatíveis para cortar a maioria das amostras de plantas. Certifique-se de que a resina usada já está fornecida com o catalisador adequado misturado, ou siga as instruções do fornecedor para preparar a resina. O processo de incorporação a seguir é lento, mas os resultados justificam muito os meios.
   1. Perfunda as amostras incubando com a resina LR-White em uma série de concentração crescente de resina (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) no etanol, incubando por 24 h a 4 °C em cada etapa.
      ATENÇÃO: A resina LR-White é uma resina acrílica de baixa toxicidade; no entanto, pode ser um irritante para a pele pelo contato e inalação. Trabalhar em uma área bem ventilada ou sob um capô de fumaça com desgaste protetor adequado e luvas de nitrito é altamente recomendado.
   2. Atualize a resina LR-branca e incubar por mais 12 h a 4 °C.
   3. Prepare o tamanho adequado incorporando cápsulas de gelatina (tamanho 1 (0,5 mL) para amostras de até 3 mm, 2 x 0,37 mL para amostras de até 5 mm ou 3 x 0,3 mL para amostras de até 8 mm, e etiquetas de papel(Figura 1D).
      NOTA: Selecione o tamanho da cápsula para ser ligeiramente maior que a amostra, de modo que a amostra possa ser completamente fechada na resina. Além disso, lembre-se de rotular as etiquetas com um lápis, pois caneta ou tintas impressas contaminarão a resina, arruinando a amostra.
   4. Aplique uma gota de resina LR-branca fresca no fundo de cada cápsula.
   5. Coloque uma amostra em cada cápsula de gelatina e encha a capacidade máxima com resina fresca. Coloque a tampa da cápsula e pressione suavemente para formar um selo hermético(Figura 1E).
   6. Polimerizar a resina por 24 a 48 h a 58 °C, ou até endurecer totalmente.
   7. Armazene amostras em temperatura ambiente.
      NOTA: A resina LR-branca pós-polimerização está inerte.

2. Preparação para deslizamentos

NOTA: Os slides de vidro devem estar limpos, livres de qualquer poeira, graxa ou quaisquer outros contaminantes. Mesmo novos slides devem ser limpos, pois alguns fornecedores usam óleos e detergentes para evitar que os slides fiquem juntos. Qualquer graxa ou detergente interferirá com a adesão da seção ao slide, mesmo se tratada com poli-L-lysine. Fiapos e poeira afetarão as observações do espécime e possivelmente arruinarão o experimento. Slides revestidos de Teflon com poços de reação são perfeitos para esta tarefa. São acessíveis, reutilizáveis e reduzem drasticamente a quantidade de solução de anticorpos necessária. Com limpeza adequada, a imunolocalização fluorescente de excelente qualidade pode ser realizada a um custo muito acessível.

1. Lavagem de slides
   1. Coloque os slides em um rack de coloração e cubra com solução de limpeza (0,1% SDS (w/v), 1% de ácido acético (v/v), 10% etanol (v/v)).
   2. Mantenha uma leve agitação por 20 minutos.
   3. Transfira os racks de coloração para um banho ddH₂O com leve agitação por 10 minutos. Repita 4 vezes.
   4. Escorra cuidadosamente os racks antes de mergulhar brevemente em 100% de etanol e deixe os slides secarem em um ambiente sem poeira.
   5. Armazene até o uso.
2. Revestimento de poli-l-lysina (opcional)
   NOTA: Pequenas seções geralmente grudam muito bem em limpar lâminas de vidro. Esta etapa só é recomendável para seções maiores (>2 mm²). Seções maiores tendem a dobrar e enrugar, e não são aconselháveis. No entanto, se necessário, use slides de reação com furos maiores. Limpe-os como acima e prossiga da seguinte forma.
   1. Coloque lâminas limpas em uma placa de Petri quadrada. Pipeta solução de 0,001% poli-L-lysine (c/v) para cobrir os orifícios dos slides, sem transbordar.
   2. Deixe os slides secarem durante a noite a 40 °C em pratos fechados de Petri.
      NOTA: Os slides revestidos estão prontos para uso imediato e podem ser armazenados em um ambiente livre de poeira à temperatura ambiente, por vários meses.

3. Corte e secção de amostras

1. Aparação de amostras
   1. Com uma lâmina afiada, corte os blocos LR-White sob um estereótipo para formar uma estrutura em forma de pirâmide onde o ápice é perpendicular à área de interesse da amostra(Figura Suplementar 1A).
      NOTA: O porta-amostras de ultra-microtómetro é uma excelente ferramenta para fixar o bloco. Se o dispositivo não tiver um suporte de amostra universal, use o mais adequado para blocos redondos.
   2. Corte a estrutura piramicular removendo fatias finas do excesso de resina perpendicularmente ao eixo principal da pirâmide.
   3. Prossiga até que a amostra seja alcançada formando a superfície de corte. Dentro da superfície de corte, a amostra alvo deve ser idealmente incluída em uma forma trapezoide.
      NOTA: O bloco de resina pode ser ainda mais aparado em um ângulo de fenda para reduzir a área da superfície da seção com uma lâmina afiada(Figura 1F).
2. Secção semifina
   NOTA: Será utilizado um microtome com facas de vidro. A capacidade do anticorpo de se ligar ao epítope condicionará o sucesso da reação imunolabeling. A natureza hidrofílica da resina LR-White permitirá um bom contato dos anticorpos com as seções amostrais. Seções mais finas apresentarão coloração mais fraca do Calcofluor que será usada para ajudar a localizar as seções e ajudar no processo de imagem. O mesmo vale para outras manchas que podem ser aplicadas posteriormente. Além disso, a espessura excessiva afetará a qualidade de aquisição de imagens. Um bom compromisso para a espessura da seção pode ser encontrado entre 200 e 700 nm, dependendo das características do tecido. Monte os blocos firmemente no porta-espécimes do ultra-microtómetro.
   1. Com um ultra-microtómeo, faça seções com espessura entre 200 e 700 nm(Figura 1G).
   2. Verifique a área da seção transferindo algumas seções para uma gota ddH₂O em um slide de vidro. Coloque o slide em uma placa quente de 50 °C até que a água evapore. Mancha colocando uma queda de 1% Toluidine Blue O (w/v) em solução de ácido bórico de 1% (c/v) sobre as seções para 30 s. Enxágüe e observe sob o microscópio.
   3. Ao encontrar a estrutura desejada, transfira uma ou duas seções para cada gota de ddH₂O previamente colocada em cada poço de um slide de reação limpo.
   4. Coloque cada slide em uma placa de petri limpa e limpa de 10 cm e deixe secar a 50 °C.
   5. Armazene slides em uma caixa de arquivo limpa até usar.

4. Imunolocalização

NOTA: O procedimento de imunolocalização fluorescente depende do uso sequencial de dois anticorpos. O anticorpo primário é levantado contra um antígeno alvo específico. O anticorpo secundário é levantado especificamente contra o anticorpo primário e para técnicas fluorescentes é conjugado a um fluoróforo (FITC neste protocolo específico). O anticorpo primário será usado para detectar o antígeno alvo na amostra, e o anticorpo secundário será usado para marcar o local onde o anticorpo primário conectado à amostra após lavar o excesso de anticorpos primários. Os controles são uma parte importante deste ensaio e devem ser sempre realizados para garantir a precisão das observações. Um poço no slide deve ser reservado para uso como controle negativo, onde o tratamento de anticorpos primários será ignorado e, portanto, nenhum sinal deve ser observado no final do experimento. Um controle positivo deve ser incluído no experimento tratando um bem com um anticorpo que a rotulagem já é conhecida e certa. O controle positivo é usado para confirmar a eficácia da rotulagem de anticorpos secundários e as condições de reação, enquanto o controle negativo testa a especificidade do anticorpo secundário.

1. Prepare uma câmara de incubação colocando algumas toalhas de papel amortecidos na parte inferior de uma caixa de pontas de pipeta e enrolando-a com papel alumínio(Figura Suplementar 1B-1E). Coloque os slides na câmara de incubação.
2. Pipeta uma queda de 50 μL por 8 mm de solução de bloqueio (5% leite seco sem gordura (c/v) em 1 M PBS) e incubar por 10 minutos. Remova a solução de bloqueio e lave todos os poços duas vezes com PBS por 10 minutos.
3. Preparar as soluções primárias de anticorpos (ver Tabela Suplementar 1),anticorpo 1:5 (v/v) na solução de bloqueio; fazer uma estimativa de cerca de 40 μL por 8 mm bem.
   NOTA: A concentração do anticorpo deve ser ajustada de acordo com o protocolo da fabricação.
4. Faça uma lavagem final com ddH₂O por 5 min, nunca deixe os poços secarem completamente.
5. Pipeta a solução de anticorpos primária para os poços de reação. Solução de bloqueio de pipeta para os poços de controle.
6. Feche a câmara de incubação e deixe ficar por 2h em temperatura ambiente seguido de pernoite a 4 °C. Prepare a solução de anticorpos secundários, 1% em solução de bloqueio (v/v) cerca de 40 μL por poço. Mantenha-o coberto com papel alumínio.
7. Lave todos os poços duas vezes com PBS por 10 minutos, seguido de 10 minutos adicionais com ddH₂O. Certifique-se de que nenhum vestígio da solução de bloqueio ou depósitos seja visível nos poços.
8. Pipeta a solução de anticorpos secundários para todos os poços. De agora em diante, proteja os slides da luz.
9. Incubar por 3-4 h no escuro à temperatura ambiente.
10. Lave todos os poços duas vezes por 10 min com PBS seguido de outra lavagem de 10 min com ddH₂O.
11. Aplique uma gota de calcofluor (1:10.000 (w/v) fluorescente mais brilhante 28 em PBS) em cada poço. Sem lavar, aplique uma gota de meio de montagem (ver Tabela de Materiais) em cada poço e coloque uma mancha de cobertura(Figura 1H).
12. Observe com um microscópio de fluorescência, equipado com lente 10x/0.45, 20x/0,75, 40x/0,95 e 100x/1.40 lente, use UV (para mancha de calcofluor) e filtros FITC, para detectar parede celular e imunolocalizaçãorespectivamente (Figura 1I). Utilize os seguintes comprimentos de onda: excitação/emissão (nm) 358/461 para UV e 485/530 para FITC.
13. Para uma melhor visualização dos resultados sobrepõem ambas as imagens com ImageJ ou similar.

Resultados

Em um experimento bem-sucedido, o anticorpo secundário identificará especificamente a localização do epítope específico em verde brilhante, de forma consistente, permitindo a caracterização da composição da parede celular em um determinado estágio de desenvolvimento da célula, tecido ou órgão. Por exemplo, o anticorpo LM6 tem uma alta afinidade por 1,5-arabinan, um composto com tipo-I rhamnogalacturonan que pode ser encontrado abundantemente rotulando a parede celular do suber anther em desenvolvim...

Discussão

O método de imunolocalização fluorescente nas plantas aqui descrito, embora perfeitamente simples, conta com o sucesso de vários pequenos passos. A primeira delas é a preparação e fixação da amostra. Durante este primeiro passo, uma mistura de formaldeído e glutaraldeído é usada para cruzar a maioria dos componentes celulares. O formaldeído na solução proporciona uma fixação leve e reversível, enquanto o glutaraldeído proporciona uma ligação forte e mais permanente; o equilíbrio entre os dois fixati...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Absolute ethanol	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size should fit the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
Vacuum chamber	na	na
Vacuum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)