JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O objetivo do ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico é avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas medindo a produção de produtos de peroxidação lipídica, principalmente malondialdeído, utilizando espectrofotometria de comprimento de onda visível a 532 nm. O método descrito aqui pode ser aplicado ao soro humano, lises celulares e lipoproteínas de baixa densidade.

Resumo

Apesar de sua limitada especificidade analítica e robustez, o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido amplamente utilizado como uma métrica genérica de peroxidação lipídica em fluidos biológicos. É frequentemente considerado um bom indicador dos níveis de estresse oxidativo dentro de uma amostra biológica, desde que a amostra tenha sido adequadamente manuseada e armazenada. O ensaio envolve a reação de produtos lipídicos de peroxidação, principalmente malondialdeído (MDA), com ácido tiobarbitúrico (TBA), o que leva à formação de adutos MDA-TBA2 chamados TBARS. O TBARS produz uma cor vermelho-rosa que pode ser medida espectrofotometricamente a 532 nm. O ensaio TBARS é realizado em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C. O MDA puro é instável, mas essas condições permitem a liberação de MDA de MDA bis (acetal de dimetila), que é usado como padrão analítico neste método. O ensaio TBARS é um método simples que pode ser concluído em cerca de 2 h. A preparação dos reagentes de ensaios são descritas em detalhes aqui. Pesquisadores conscientes do orçamento podem usar esses reagentes para experimentos múltiplos a um custo baixo em vez de comprar um kit de ensaio TBARS caro que só permite a construção de uma única curva padrão (e, portanto, só pode ser usado para um experimento). A aplicabilidade deste ensaio TBARS é mostrada em soro humano, lipoproteínas de baixa densidade e lises celulares. O ensaio é consistente e reprodutível, e os limites de detecção de 1,1 μM podem ser alcançados. Recomendações para o uso e interpretação do ensaio espectrofotométrico TBARS são fornecidas.

Introdução

A peroxidação lipídica é um processo no qual radicais livres, como espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio, atacam ligações duplas carbono-carbono em lipídios, um processo que envolve a abstração de um hidrogênio a partir de um carbono e inserção de uma molécula de oxigênio. Esse processo leva a uma mistura de produtos complexos, incluindo, radicais lipídicos e hidroperóxidos como produtos primários, bem como malondialdeído (MDA) e 4-hidroxynonenal como produtos secundários predominantes1.

O MDA tem sido amplamente utilizado em pesquisas biomédicas como um marcador de peroxidação lipídica devido à sua reação fácil com ácido tiobarbitúrico (TBA). A reação leva à formação do MDA-TBA2, um conjugado que absorve no espectro visível a 532 nm e produz uma cor vermelho-rosa2. Outras moléculas derivadas da peroxidação lipídica além do MDA também podem reagir com TBA e absorver luz a 532 nm, contribuindo para o sinal de absorção global que é medido. Da mesma forma, o MDA pode reagir com a maioria das outras classes principais de biomoléculas, potencialmente limitando sua acessibilidade para reação com TBA3,4. Como tal, este ensaio tradicional é simplesmente considerado para medir "substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico" ou TBARS5.

Quando corretamente aplicado e interpretado, o ensaio TBARS é geralmente considerado um bom indicador dos níveis globais de estresse oxidativo em uma amostra biológica6. Infelizmente, como documentado por Khoubnasabjafari e outros, o ensaio TBARS é frequentemente conduzido e interpretado de maneiras que facilitam conclusões duvidosas3,4,7,8,9,10,11. As causas para isso estão enraizadas principalmente em variáveis pré-analíticas relacionadas à amostra e na falta de robustez de ensaios que proíbe variações aparentemente menores no protocolo de ensaio sem alterações substanciais nos resultados do ensaio1,7,12,13.

Variáveis pré-analíticas relacionadas ao manuseio e armazenamento de bioespecímen (por exemplo, o plasma de sangue mantido temporariamente a -20 °C)14,15 podem ter um grande impacto nos resultados do ensaio TBARS16,17; tanto que os resultados do ensaio TBARS não devem ser comparados em diferentes laboratórios, a menos que seja justificado por dados explícitos de validação analítica interlaboratória. Esta recomendação é semelhante à forma como as manchas ocidentais são comumente usadas e interpretadas. Comparações de densidades de banda são válidas para estudos dentro da mancha e talvez dentro de laboratório, mas comparar densidades de banda entre laboratórios é geralmente considerado uma prática inválida.

Alguns pesquisadores sugeriram que o MDA medido pelo ensaio TBARS simplesmente não atende aos critérios analíticos ou clínicos exigidos de um biomarcador aceitável3,9,10,18,19. De fato, se o ensaio não tivesse sido desenvolvido há mais de 50 anos, provavelmente não teria ganho o uso generalizado e a aceitabilidade tácita que tem hoje. Embora existam outros ensaios com maior sensibilidade analítica, especificidade e robustez utilizadas para determinar o estresse oxidativo, o ensaio TBARS baseado na absorção a 532 nm permanece de longe um dos ensaios mais utilizados para a determinação da peroxidação lipídica20, e assim a avaliação do estresse oxidativo.

O ensaio TBARS só pode ser encontrado como um kit caro (mais de 400 dólares americanos), no qual as instruções não fornecem informações detalhadas sobre a maioria das concentrações dos reagentes utilizados. Além disso, os reagentes fornecidos só podem ser usados para um experimento, pois apenas uma curva padrão colorimétrica pode ser feita por kit. Isso pode ser problemático para pesquisadores que pretendem determinar níveis de oxidação dentro de algumas amostras em diferentes pontos de tempo, porque a mesma curva padrão não pode ser usada em vários momentos. Portanto, vários kits precisam ser comprados para vários experimentos. Atualmente, a menos que um kit caro seja comprado, não há um protocolo detalhado disponível para como realizar um ensaio TBARS. Alguns pesquisadores no passado descreveram vagamente como realizar um ensaio TBARS21,22, mas nem um protocolo totalmente detalhado ou um vídeo abrangente sobre como conduzir o ensaio TBARS sem um kit caro está disponível na literatura.

Aqui relatamos uma metodologia detalhada e analiticamente validada para fins sobre como realizar um ensaio TBARS de forma simples, reprodutível e barata. Alterações na peroxidação lipídica do soro humano, lisatos hepG2 e lipoproteínas de baixa densidade após o tratamento com íons cu(II) são demonstradas como aplicações ilustrativas para o ensaio TBARS. Os resultados demonstram que este ensaio TBARS é consistente e reproduzível no dia-a-dia.

Protocolo

Os espécimes de soro humano foram obtidos de voluntários consentidos sob aprovação do IRB e de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinque. Os espécimes foram codificados e desidentifilados antes da transferência para o laboratório analítico.

1. Preparação da amostra

  1. Lises celulares HepG2
    1. Semente cerca de 10 x 106 células HepG2 por frasco em 16 frascos T75 com 14 mL de mídia EMEM complementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) e células de cultivo por 2 dias.
    2. Prepare o buffer RIPA: em um tubo de 50 mL, adicione 1,5 mL de 5 M NaCl, 2,5 mL de 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL de reagente NP-40 e, em seguida, leve o volume final para 50 mL com água DI.
    3. Prepare o tampão de lise: alíquota de 20 mL de tampão RIPA em um tubo de 50 mL e adicione 200 μL de uma solução inibidora de protease de 100x para inibir a degradação da proteína e lipídica. Armazenar a 4 °C.
      NOTA: O tampão de lise é compatível com reagentes TBARS e não interfere com a absorvência a 532 nm. Se o planejamento de usar um tampão de lise diferente ou adicionar ingredientes adicionais ao tampão de lise, estudos preliminares de validação precisam ser feitos para verificar se os componentes do buffer de lise são compatíveis com o ensaio TBARS.
    4. Remova a mídia contendo 10% de FBS e lave as células 2x com 5 mL de PBS frio e estéril.
    5. Adicione 1 mL de tampão de lise aos frascos T75 contendo as células e incuba-as por 10 minutos à temperatura ambiente (RT) com redemoinho constante para garantir que o buffer esteja bem distribuído.
    6. Colete lysates em tubos de polipropileno de 2 mL e incubar no gelo por 10 minutos.
    7. Gire os lises a 5.000 x g por 10 min no RT para coletar detritos celulares e aspire supernantes em um único tubo de 15 mL.
    8. Concentre-se em células supernasas de células 4 vezes usando um Vac de velocidade a 50 °C e 3 mbar e faça alíquotas de 94 μL cada em tubos de polipropileno de 2 mL. Armazene amostras a -80 °C até que sejam usadas para oxidação in vitro e/ou ensaio TBARS.
      NOTA: Para evitar concentrar o supernanato celular, as células também podem ser destacadas usando 3 mL de trippsina 1x, neutralizadas com 6 mL de mídia, e lavadas 2x com 5 mL de PBS frio. As pelotas celulares podem então ser reconstituídas em 250 μL de tampão de lise, e as etapas 1.1.6 e 1.1.7 podem então ser realizadas.
    9. Prepare uma solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4).
      1. Preparar solução de ácido acético (pH = 4): Diluir 1 μL de ácido acético glacial em 100 mL de água DI (pH deve ser aproximadamente 4, mas confirme isso com um medidor de pH). Adicione mais água ou ácido acético para ajustar o pH a 4.
      2. Peso cerca de 0,1936 g de cloreto de cobre II e dissolver-se em 10 mL da solução de ácido acético (pH = 4) para fazer um estoque de CuCl2 de 144 mM. Aliquot 490 μL desta solução e adicionar a 1.510 μL de ácido acético (pH = 4) para fazer uma solução cucl2 de 35 mM.
    10. Aliquot 6 μL da solução de estoque CuCl2 de 35 mM e adicioná-lo a seis amostras contendo 94 μL de lisato celular para fazer uma concentração final de CuCl2 de cerca de 2 mM. Adicione 6 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não tenha CuCl2 a seis amostras contendo 94 μL de lisatos celulares para usar como controles. O volume final de lise celular deve ser de 100 μL, que é o que será usado para o ensaio TBARS.
      NOTA: Fazer a solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4) é necessário para evitar a precipitação de hidróxido de cobre.
    11. Incubar amostras em um forno a 37 °C por 24 h e realizar um ensaio TBARS em cada amostra contendo um volume final de 100 μL.
    12. Repita as etapas 1.1.9 e 1.1.11 2x em dias separados para verificar a reprodutibilidade do ensaio TBARS para as células HepG2.
  2. Lipoproteínas de baixa densidade
    NOTA: Normalmente, a lipoproteína de baixa densidade pré-purificada (LDL) contém alguma quantidade de EDTA. As amostras de LDL aqui utilizadas contêm 0,01% de EDTA. EDTA pode inibir a oxidação in vitro cu(II) mediada de LDL. Portanto, pode ser necessário remover EDTA de amostras de LDL antes de experimentos ou análises. As etapas 1.2.1-1.2.5 descrevem esse processo.
    ATENÇÃO: Hidróxido de sódio é corrosivo e causa irritação na pele e nos olhos. Use equipamentos de proteção individual adequados.
    1. Aliquot 24 μL de um estoque LDL de 5,51 mg/mL (concentração de proteína determinada pelo método Lowry modificado usando BSA como padrão) em tubos de polipropileno de 1 mL apropriadamente rotulados. Faça quantas alíquotas forem necessárias e armazene a 4 °C até usar em ensaio de oxidação e/ou TBARS.
    2. Prepare um buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl ajustado ao pH = 7 com contas NaOH: dissolva 4,39 g de NaCl em 0,49 L de água e adicione 1,19 g de HEPES. Dissolva bem com uma barra de mexida. Adicione contas de hidróxido de sódio até que o pH seja 7. Diluir para 0,5 L com água. Armazene o buffer a 4 °C e use dentro de 3 meses.
    3. Adicione 476 μL do buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl (pH = 7) às amostras de LDL aliquoted para trazer volume final para 500 μL. Adicione a amostra diluída de LDL a um dispositivo de filtro de giro centrífugo de 0,5 mL com um corte de peso molecular de 100K.
    4. Gire amostras a 14.000 x g por 10 min na RT, deixando um volume final de retentato de cerca de 30 μL. Reconstituir amostras em 480 μL do buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl (pH = 7) e girar novamente a 14.000 x g por 10 min na RT. Execute esta etapa 2x para um total de quatro spin-throughs.
    5. Coloque o dispositivo do filtro de cabeça para baixo em um novo tubo de polipropileno de 2 mL e centrífugas a 1000 x g por 2 minutos para coletar amostra de LDL (volume final = cerca de 30 μL).
    6. Amostra de alíquota em tubo de 1 mL devidamente rotulado e adicionar 20 μL de água a cada amostra para alcançar um volume final de 50 μL.
    7. Preparação de 200 μM CuCl2 solução de estoque em ácido acético (pH = 4)
      1. Prepare a solução de ácido acético (pH = 4): veja o passo 1.1.9.1.
      2. Prepare uma solução de estoque CuCl2 de 144 mM (ver passo 1.1.9.2), depois aliquot 5,5 μL do estoque cucl2 de 144 mM e dissolva em um volume final de 4 mL de ácido acético (pH = 4) para fazer a solução de 200 μM.
    8. Aliquot 2,7 μL da solução de estoque CuCl2 de 200 μM e adicioná-la a seis amostras contendo 50 μL de LDL para obter uma concentração final de CuCl2 de ~10 μM. Adicione 2,7 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não contenha CuCl2 a seis amostras contendo 50 μL de LDL a serem utilizadas para os controles.
    9. Incubar amostras de LDL por 2 h em forno a 37 °C. Após 2h, leve o volume final para 100 μL para cada amostra com 10 mM de tampão HEPES em 0,15 M NaCl (pH = 7). Realize imediatamente um ensaio TBARS.
    10. Repetir as etapas 1.2.3-1.2.9 2x em dois dias diferentes para testar a reprodutividade do ensaio TBARS.
  3. Soro humano
    1. A partir de uma amostra de soro humano, faça alíquotas de 94 μL cada em tubos de polipropileno de 2 mL e armazene amostras a -80 °C.
    2. Prepare uma solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4): veja o passo 1.1.9.
    3. Aliquot 6 μL da solução de estoque CuCl2 e adicioná-lo a seis amostras contendo 94 μL de soro humano para fazer uma concentração final de CuCl2 de cerca de 2 mM. Adicione 6 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não tenha CuCl2 a seis amostras contendo 94 μL de soro humano para usar como controles.
    4. Incubar amostras de soro humano por 24 h em forno a 37 °C e determinar níveis de oxidação com ensaio TBARS (seção 4).
    5. Repetir as etapas 1.3.2-1.3.4 2x em dois dias separados para determinar a reprodutibilidade do ensaio TBARS.

2. Preparação do reagente

ATENÇÃO: O ácido thiobarbitúrico causa irritação na pele e nos olhos e talvez prejudicial por inalação ou absorção da pele. O ácido acético pode danificar órgãos internos se inalado. Prepare todas as soluções ácidas em um capô de fumaça.

  1. Preparação de solução de 8,1% (c/v) dodecylsulfate de sódio (SDS)
    1. Peso 32,4 g de SDS e dissolva em 350 mL de água DI em um béquer. Use uma barra de agitação magnética para dissolver suavemente os SDS e evitar fazer bolhas. Leve o volume final para 400 mL com água DI e armazene a solução SDS na RT.
      NOTA: Aqui, o excesso de 8,1% de solução SDS é preparado; no entanto, para 96 amostras, são necessários apenas cerca de 20 mL da solução SDS de 8,1%. Prepare esta solução de acordo com o número de amostras que estão sendo analisadas.
  2. Preparação de tampão de acetato de sódio de 3,5 M (pH = 4)
    1. Diluir 100 mL de ácido acético glacial em 350 mL de água DI em um béquer. Use uma barra de agitação magnética para dissolvê-la suavemente.
    2. Prepare uma solução NaOH de 6,5 M usando contas de hidróxido de sódio na água. Dissolva 13 g de contas NaOH em 40 mL de água DI e leve a um volume final de 50 mL com água DI.
    3. Adicione lentamente cerca de 46 mL da solução NaOH de 6,5 M à solução de ácido acético enquanto se mistura com a barra de agitação (isso deve elevar o pH para 4, mas confirmar adicionando lentamente a solução NaOH enquanto mede usando um medidor de pH).
    4. Leve o volume final para 500 mL com água DI e armazene o tampão de acetato de sódio na RT.
  3. Preparação de solução aquosa de 0,8% de ácido tiobarbitúrico (ajustado ao pH = 4)
    NOTA: Nesta etapa, a preparação do ácido tiobarbitúrico é otimizada para grandes volumes, uma vez que um grande número de amostras será analisada (108 amostras, sem incluir as normas). Prepare esta solução dependendo do número de amostras planejadas para análise.
    1. Prepare uma solução de hidróxido de sódio de 5 M usando contas de hidróxido de sódio e água: dissolva 4 g de contas de hidróxido de sódio em um volume final de 20 mL de água. Guarde em um recipiente de plástico. Esta solução deve ser preparada recentemente para cada lote.
    2. Peso 4 g de ácido tiobarbitúrico e adicione 450 mL de água DI. Use uma barra de agitação magnética para dissolvê-la suavemente.
      NOTA: Esta solução será eventualmente levada a um volume total de 500 mL.
    3. Ao dissolver o ácido tiobarbitúrico com uma barra de mexida, adicione (lentamente e de forma dropwise) cerca de 3 mL da solução 5 M NaOH em incrementos de 100 μL. Depois de adicionar a solução NaOH, as partículas de ácido thibarbitúrico começarão a se dissolver.
    4. Se as partículas de ácido thibarbitúrico ainda não tiverem totalmente dissolvido, adicione mais da solução 5 M NaOH em incrementos de 100 μL até que todas as partículas de ácido thiobarbitúrico sejam totalmente dissolvidas. Para este volume específico de solução, um total de 4 mL da solução 5 M NaOH é adicionado para dissolver totalmente as partículas de ácido thiobarbitúrico.
      NOTA: Nesta concentração, o ácido tiobarbitúrico não se dissolverá totalmente a menos que o pH seja de quase 4.
    5. Pare de adicionar NaOH depois de tudo o ácido tiobarbitúrico ter se dissolvido completamente. Evite exceder um pH de 4. O pH final pode ser verificado tomando 1 μL da solução de ácido thiobarbitúrico de mistura e colocando-o em papel pH.
    6. Leve o volume final para 500 mL com água DI e armazene solução aquosa de ácido thiobarbitúrico de 0,8% na RT.

3. Preparação padrão da amostra padrão malondialdeído bis (dimethyl acetal)

NOTA: O malondialdeído (MDA) é instável e não está disponível comercialmente. No entanto, existem diferentes formas químicas de MDA que estão disponíveis comercialmente, como o sal de tetrabutylammonium MDA, MDA bis (acetal de dimetila) e MDA bis (acetal de dietilo). Dessas três formas químicas, o MDA bis (acetal de dimetila) é usado aqui, pois a maioria dos estudos usa esse mesmo padrão21,22. Se optar por usar as outras duas formas químicas de MDA, deve ser realizada validação prévia de sua adequação.

  1. Prepare uma solução de estoque de 550 μM MDA bis (dimethyl acetal) diluindo 92 μL de mda bis puro (acetal de dimetila) em 1 L de água DI. Use uma barra de mexiça magnética para misturar bem a solução por 10 minutos. Armazene a solução a 4 °C e use dentro de 1 mês.
  2. Prepare um bi de 200 μM MDA bis (acetal de dimetila) diluindo 726 μL do estoque de 550 μM MDA bis (acetal de dimetila) em 1274 μL de água DI. Esta solução de 200 μM MDA bis (acetal de dimetila) deve ser preparada fresca toda vez que um ensaio TBARS é realizado.
  3. Preparação padrão da curva: pegue oito tubos de polipropileno de tampa de snap-cap de 2 mL e rotule-os com letras A através de H. Adicione MDA bis (acetal de dimetila) do estoque de 200 μM e diluir na água conforme descrito na Tabela 1.
  4. Pegue oito tubos de vidro (13 mm x 100 mm) e rotule-os A-H, em seguida, adicione 100 μL de padrão aos tubos correspondentes. Execute seis réplicas para o padrão em branco (amostra A) para calcular os limites de detecção do ensaio TBARS.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui por não mais do que 1 h.

4. Ensaio TBARS

NOTA: Uma vez iniciado o ensaio TBARS, ele deve ser terminado sem parar.

  1. Pegue o máximo de tubos de vidro necessários para que o número de amostras seja analisado e rotule-os com os nomes das amostras. Em seguida, adicione 100 μL de cada amostra preparada (conforme descrito acima) a cada tubo de vidro.
  2. Adicione 200 μL de 8,1% SDS a cada amostra e padrões e gire suavemente o tubo de vidro em um movimento circular para misturar a amostra.
  3. Adicione 1,5 mL do tampão de acetato de sódio de 3,5 M (pH = 4) a cada amostra e padrão.
  4. Adicione 1,5 mL da solução aquosa de ácido thiobarbitúrico de 0,8% (pH = 4) a cada amostra e padrão.
  5. Leve o volume final para 4 mL para cada amostra e padrão adicionando 700 μL de água DI.
  6. Tampa firmemente cada tubo de vidro e incuba em um bloco de aquecimento definido a 95 °C por 1 h. Cubra os tubos de vidro com papel alumínio para evitar a condensação nos topos dos tubos.
  7. Remova os tubos de vidro do bloco de aquecimento e incubar no gelo por 30 minutos.
  8. Centrifugar amostras e padrões a 1500 x g por 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, mantenha os tubos de vidro contendo as amostras e padrões na RT.
    NOTA: Manter as amostras no gelo ou a 4 °C fará com que toda a amostra ou padrão precipitar.
  9. Imediatamente após a centrifugação, aliquot 150 μL de supernante de cada tubo e coloque em um poço separado de uma placa de 96 poços.
  10. Remova todas as bolhas de cada poço usando uma ponta de pipeta.
    NOTA: A presença de bolhas produzirá leituras de absorção inconsistentes, levando a uma alta imprecisão do ensaio.
  11. Leia absorventes a 532 nm. Subtraia a leitura média de absorvência das amostras em branco de todas as outras leituras de absorvência.
  12. Crie uma curva padrão plotando as leituras de absorvância subtraídas em branco a 532 nm vs. a concentração conhecida de cada padrão. Encaixe os pontos de dados usando regressão linear. Calcular concentrações amostrais desconhecidas usando a equação da linha de regressão linear obtida da curva padrão.

Resultados

Em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C, o malondialdeído (MDA) bis (acetal de dimetila) produz MDA23. Os congêneres químicos relacionados com mDA e intimamente relacionados reagem com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) para produzir compostos chamados substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS), que dão uma cor vermelho-rosa e têm uma absorção λmax a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizando-s...

Discussão

Apesar de suas limitações1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e falta de adequação para comparação entre laboratórios, o ensaio do TBARS é um dos

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

A pesquisa aqui relatada foi apoiada em parte pelo Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio nº. R33 CA217702 e o programa Iniciativa de Maximização do Desenvolvimento Estudantil (IMSD). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 LVWR, PA101642--262cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tubeCorning, NYCLS430897General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterileThermo Fisher Scientific, MA280895To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter deviceFisher Scientific, NHUFC510024LDL purification
Caps for glass tubesThermo Fisher Scientific, MA14-930-15Dfor TBARS assay
Copper II ChlorideSIGMA, MO222011-250Gto induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)VWR, PA53283-800for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC, VAHB-8065HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLeppendorf, NY22363204General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLGenesee Sceitific, CA22363352General material
Fetal Bovine Serum US SourceOmega Scientific, CAFB-11for cell culture
Glacial Acetic AcidSIGMA, MO27225-1L-RTBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)Thermo Scientific, MA87786cell lysis reagent
HEPESSIGMA, MOH3375-250GLDL solvent
HepG2 CellsATCC, VAHB-8065Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)Fisher Scientific, NHA144-212cell lysis reagent
Legend Micro 17 CentrifugeThermo Scientific, MA75002431General material
Low Density Lipoprotein, Human PlasmaAthens Research & Technology, GA12-16-120412Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-AssortmentVWR, PA58948-025General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)SIGMA, MO8207560250TBARS Standard
Multiskan Go Microplate SpectrophotometerFisher Scientific, NH51119200To measure absorbance
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLcell lysis reagent
Sodium ChlorideSIGMA, MOS7653-1KGcell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)SIGMA, MO436143-100GTBARS Reagent
Sodium hydroxideSIGMA, MO367176-2.5KGTBARS Reagent
SpeedVac ConcentratorThermo Scientific, MASC250EXPFor concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter capUSA Scientific, FL658175cell culture
Thiobarbituric AcidSIGMA, MOT5500-100GTBARS Reagent
TRIS baseFluka, GA93362cell lysis reagent
Trypsin (1x)VWR, PA16777-166To detach HepG2 cells

Referências

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K., Armstrong, D. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Qu micaEdi o 159subst ncias reativas de cido tiobarbit ricoTBARSoxida operoxida o lip dicamalondialde doMDAcido tiobarbit ricoTBAestresse oxidativo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados