Estabelecendo um modelo de córnea porcina ex vivo para estudar tratamentos medicamentosos contra ceratite bacteriana

Resumo

Este artigo descreve um protocolo passo a passo para criar um modelo de ceratite porcina ex vivo de ceratite bacteriana. Pseudomonas aeruginosa é usado como organismo prototípico. Este modelo inovador imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea.

Resumo

Ao desenvolver novos antimicrobianos, o sucesso dos ensaios em animais depende da extrapolação precisa da eficácia antimicrobiana de testes in vitro a infecções em animais in vivo. Os testes in vitro existentes tipicamente superestimam a eficácia antimicrobiana, pois a presença de tecido hospedeiro como barreira de difusão não é contabilizada. Para superar esse gargalo, desenvolvemos um modelo de ceratite bacteriana ex vivo porcina usando Pseudomonas aeruginosa como organismo prototipado. Este artigo descreve a preparação da córnea suína e o protocolo para o estabelecimento da infecção. Moldes de vidro sob medida permitem a configuração direta da córnea para estudos de infecção. O modelo imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea. O estabelecimento da infecção é verificado como um aumento no número de unidades formadoras de colônias avaliadas por meio de placas viáveis. Os resultados demonstram que a infecção pode ser estabelecida de forma altamente reprodutível nas córneas ex vivo usando o método descrito aqui. O modelo pode ser estendido no futuro para imitar ceratite causada por microrganismos diferentes de P. aeruginosa. O objetivo final do modelo é investigar o efeito da quimioterapia antimicrobiana no progresso da infecção bacteriana em um cenário mais representativo de infecções in vivo. Ao fazê-lo, o modelo descrito aqui reduzirá o uso de animais para testes, melhorará as taxas de sucesso em ensaios clínicos e, finalmente, permitirá a tradução rápida de novos antimicrobianos para a clínica.

Introdução

As infecções corneais são importantes causas de cegueira e ocorrem em proporções epidêmicas em países de baixa e média renda. A etiologia da doença varia de região para região, mas as bactérias são responsáveis pela grande maioria desses casos. Pseudomonas aeruginosa é um patógeno importante que causa uma doença rapidamente progressiva. Em muitos casos, os pacientes ficam com cicatrizes estromais, astigmatismo irregular, necessitam de transplante ou, no pior dos casos, perdem um olho^1,2.

A ceratite bacteriana causada pela P. aeruginosa é uma infecção ocular difícil de tratar particularmente devido ao crescente surgimento de cepas resistentes antimicrobianas de P. aeruginosa. Na última década, tornou-se evidente que testar e desenvolver novos tratamentos para infecções córneas, em geral, e aqueles causados por Pseudomonas sp., em particular, são essenciais para combater a tendência atual de resistência a antibióticos³.

Para testar a eficácia de novos tratamentos para infecções córneas, os métodos microbiológicos in vitro convencionais são um substituto ruim devido à diferença na fisiologia bacteriana durante a cultura laboratorial e durante infecções in vivo, bem como devido à falta da interface hospedeira^4,5. Os modelos in vivo animal, no entanto, são caros, demorados, só podem entregar um pequeno número de réplicas e levantar preocupações sobre o bem-estar animal.

Neste artigo, demonstramos um modelo simples e reprodutível organotípico ex vivo porcina de ceratite que pode ser usado para testar vários tratamentos para infecções agudas e crônicas. Usamos P. aeruginosa para este experimento, mas o modelo também funciona bem com outras bactérias, e organismos como fungos e leveduras que causam ceratite.

Protocolo

Coelhos do laboratório albino foram sacrificados em laboratório por outros trabalhos experimentais planejados sob protocolos aprovados pelo home office. Os olhos não eram necessários para uso experimental nesses estudos, por isso foram utilizados para este protocolo.

1. Esterilização

1. PASSO CRÍTICO: Desinfete todos os fórceps e tesouras de molho por 1h em 5% (v/v) solução de Distel em água destilada, limpe com escova, enxágue com água da torneira e esterilize em forno a 185 °C por um mínimo de 2h.
2. Esterilize todos os outros vidros e reagentes autoclavando a 121 °C por 15 minutos ou prepare os reagentes de acordo com as instruções do fabricante. Realizar os seguintes procedimentos em um gabinete de segurança de microbiologia classe II.

2. Coleta de amostras

1. Coleção de olhos suínos
   1. Grandes porcas brancas, uma cruz com um javali hampshire foi usada. Os animais foram atordoados com uma corrente elétrica e os olhos foram enucleados 2h depois no matadouro.
   2. PASSO CRÍTICO: Uma vez enucleado, transfira os olhos para o laboratório em uma solução salina tamponada de fosfato estéril (PBS) para evitar que eles sequem e processem-nos imediatamente após a chegada.
2. Coleção de olhos de coelho
   1. Extireta as córneas e mande para o laboratório em PBS estéril.

3. Preparação do botão corneoscleral

1. Use fórceps estéreis para segurar o tecido ao redor do globo ocular e transferi-lo para uma placa de Petri. Remova o tecido conjuntivo e muscular ao redor do globo ocular em uma placa de Petri usando lâmina de bisturi nº 15 e fórceps.
2. Levante suavemente o globo ocular enquanto segura o nervo óptico com fórceps e transfira para um frasco de 0,5 L cheio de PBS estéril.
3. Uma vez que todos os olhos estejam limpos do tecido circundante, mova-os usando fórceps estéreis para outro frasco de 0,5 L preenchido com 3% (v/v) iodo de povidona na PBS e deixe por 1 min.
4. Transfira os globos oculares para outro frasco de 0,5 L com PBS estéril.
5. Use fórceps para segurar o olho ainda em uma placa de Petri e fazer um corte perto da córnea com uma lâmina de bisturi no 10A.
6. PASSO CRÍTICO: Segure a borda do corte e use a tesoura para extirar a córnea deixando cerca de 3 mm de esclera ao redor da córnea. Certifique-se de que a extremidade afiada da tesoura não perfura a íris ou o tecido coroidal e está no espaço supra-choroidal.
7. Segure o botão córneacleral com fórceps e use outro par de fórceps ponta pontiagudas para separar suavemente o tecido úveal.
8. Levante o botão corneoscleral do globo remanescente e enxágue-o brevemente em 1,5% (v/v) solução de iodo povidone em PBS em uma placa de 12 poços.
9. Coloque o botão corneoscleral em outra placa de 12 poços cheia de PBS estéril.
10. Depois de processar todos os olhos (recomendado máximo de 40 olhos em um lote), coloque cada botão corneoscleral em uma placa de Petri individual (34 mm de diâmetro) lado epitelial para cima e despeje em 3 mL de cultura média pré-aquecida a 37 °C.
    NOTA: A composição do meio de cultura é a seguinte: o meio modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco: Ham's [1:1] complementado com 5 μg∙mL^-1 insulina e 10 ng∙mL^-1 fator de crescimento epidérmico (EGF), 10 ng 10% (v/v) soro fetal da panturrilha (FCS), 100 U∙mL^-1 penicilina, 100 U∙mL^-1 estreptomicina e 2,5 μg∙mL^-1 anfotericina B. Como etapa opcional, o meio pode ser complementado com 50 g∙L^-1 dextran para evitar o inchaço da córnea excisada durante as etapas de incubação.
11. Incubar a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidificada.

4. Manutenção dos botões corneosclerais

1. Após 24 horas, use técnica asséptica para remover a mídia e substituir por 3 mL de mídia de cultura pré-aquecida fresca contendo antibióticos. Mantenha os botões corneosclerais na mídia com antibióticos por 48 horas para desinfetar as córneas. Incubar a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidificada.
2. PASSO CRÍTICO: Após 48 horas, remova a mídia e enxágue córneas com 2 mL de PBS. Em seguida, mantenha os botões corneosclerais em mídia livre de antibióticos por um mínimo de dois ou idealmente três dias antes da infecção experimental, para remover antibióticos residuais do tecido.
3. Incubar a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidificada. Mude a mídia pelo menos mais uma vez dentro desses três dias. Descarte córneas se alguma turbidez se desenvolver no meio livre de antibióticos.

5. Preparação de um inóculo

1. Despeje 10 mL de caldo LB em um frasco cônico de 50 mL com uma rolha de espuma.
2. Transfira uma colônia de P. aeruginosa cepa PAO1 ou coe PA14 de uma placa de ágar fresco e incubar a 37 °C por 3-4 h até que as bactérias estejam em fase de registro médio.
3. Transfira a cultura das bactérias para um tubo de 50 mL e centrífuga a 3.000 x g por 5 min. Remova o supernatante e suspenda a pelota da célula na PBS.
4. Repita o passo 5.3 mais duas vezes para lavar as células. Suspenda a pelota de célula em PBS e ajuste a densidade óptica em 600 nm para aproximadamente 0,6 usando PBS estéril como um branco.

6. Infectando o botão corneoscleral

1. Remova a mídia da placa de Petri e enxágue córneas duas vezes com 1 mL de PBS estéril.
2. Aperte suavemente as fórceps enquanto segura a córnea no meio. Use um bisturi de 10A para fazer quatro cortes – dois verticais, dois horizontais – na seção central do botão corneoscleral através da camada epitelial até o estroma subjacente.
3. Coloque um molde de vidro estéril em uma placa de 6 poços com a parte larga para cima e coloque a córnea no meio do molde de vidro, lado do epitélio voltado para baixo. Faça o corte bem no centro da parte inferior do molde de vidro.
4. PASSO CRÍTICO: Despeje 1 mL de 1% (w/v) ágar de ponto de fusão baixo dissolvido em DMEM para encher completamente o molde de vidro com córnea.
5. Deixe o ágar definir e, em seguida, inverter o molde de vidro para que o epitélio córnea esteja voltado para cima.
6. Pipeta 15 μL da cultura bacteriana com OD_600nm = 0,6 (para P. aeruginosa isso equivale a aproximadamente 1 x 10⁷ unidades de formação de colônias (CFU) em 15 μL) diretamente em uma área cortada e, em seguida, adicionar 85 μL de PBS ao topo para manter o moist epitélio da córnea. Diluir a cultura bacteriana restante e a placa no ágar para contar unidades de formação de colônias para o inóculo.
7. Adicione 1 mL de DMEM sem antibióticos no fundo de cada poço com o molde de vidro. Incubar a placa de 6 poços com os botões corneosclera infectados em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂ por até 24 h.
8. Configure córnea de controle não infectada ao lado de todos os experimentos. Para configurar o controle não infectado, substitua os 15 μL de cultura bacteriana na etapa 6.6 por PBS estéril.

7. Homogeneização da córnea para colher as bactérias

1. Descarte o meio DMEM da parte inferior da placa de 6 poços e adicione 1 mL de PBS estéril para enxaguar a parte inferior do poço.
2. Remova o PBS suavemente por pipetação sem tocar na parte central do botão corneoscleral. Remova o anel de vidro usando fórceps estéreis e coloque-o no Distel de 5%.
3. Enxágue suavemente a parte superior do botão corneoscleral com 1 mL de PBS duas vezes [opcional].
4. Segure a borda do botão corneoscleral com fórceps finos e desprende-o do ágar por baixo.
5. Transfira a córnea para um tubo de 50 mL cheio de gelo frio de 1-2 mL de PBS.
6. Use um homogeneizador de ponta fina para ver o topo da córnea infectada. O tecido não precisa ser completamente liquidizado. O homogeneizador ajuda a separar bactérias do epitélio córnea e da área de corte.
7. Vórtice a córnea em PBS por alguns segundos para misturar o conteúdo.
8. Adicione 20 μL do homogeneado a 180 μL de PBS e realize diluições seriais em uma placa de 96 poços.
9. Diluir a suspensão em 10^-4 e 10^-5 diluição e pipeta 10 μL do homogeneato diluído com bactérias em uma placa de ágar de sangue. Incubar a placa por 8 horas e contar o número de UFC. Ao testar o efeito de antimicrobianos, o fator de diluição apropriado deve ser chegado experimentalmente.

Resultados

O design dos moldes de vidro é uma ideia inovadora e original, sendo que o uso nos permitiu configurar o modelo de forma consistente com problemas mínimos/sem contaminação. Os moldes foram preparados por um soprador de vidro na Universidade de Sheffield com base em um design (Figura 1A). A configuração experimental mantém a forma convexa da córnea e mantém bactérias no topo do epitélio onde ocorre a infecção(Figura 1B).

C...

Discussão

O principal motor por trás do desenvolvimento deste modelo de ceratite usando córnea porcina ex vivo é fornecer aos pesquisadores que desenvolvem novos antimicrobianos com um modelo in vitro representativo para determinar com mais precisão a eficácia antimicrobiana nos estágios pré-clínicos. Isso fornecerá aos pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de novos antimicrobianos maior controle sobre o design e formulação de medicamentos nos estágios pré-clínicos, aumentará o sucesso em ensaios clínicos, re...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002