Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

Resumo

O presente protocolo gera tecidos cardíacos projetados em forma de malha contendo células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para permitir a investigação da terapia de implantação celular para doenças cardíacas.

Resumo

O protocolo atual descreve métodos para gerar tecidos cardíacos escaláveis em forma de malha (ECTs) compostos por células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), que são desenvolvidas para o objetivo do uso clínico. Cardiomiócitos derivados do HiPSC, células endoteliais e células mural vasculares são misturados com matriz de gel e, em seguida, despejados em um molde de tecido polidimetilsiloxano (PDMS) com postes retangulares e escalonados internos. No dia da cultura, 14 ECTs amadurecem em uma estrutura de malha de 1,5 cm x 1,5 cm com feixes de miofibra de 0,5 mm de diâmetro. Os cardiomiócitos alinham-se ao eixo longo de cada feixe e batem espontaneamente sincronizadamente. Essa abordagem pode ser dimensionada até uma malha ECT de malha maior (3,0 cm x 3,0 cm), preservando a maturação e a função do construto. Assim, os ECTs em forma de malha gerados a partir de células cardíacas derivadas do hiPSC podem ser viáveis para paradigmas de regeneração cardíaca.

Introdução

Inúmeros estudos pré-clínicos e ensaios clínicos confirmaram a eficiência das terapias regenerativas cardíacas baseadas em células para corações falhando^1,,2,3. Entre vários tipos de células, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) são fontes celulares promissoras em virtude de sua capacidade proliferativa, potencial para gerar várias linhagens cardiovasculares^4,,5e alergenicidade. Além disso, as tecnologias de engenharia de tecidos permitiram transferir milhões de células para um coração danificado^5,,6,,7,8.

Anteriormente, relatamos a geração de tecidos cardíacos tridimensionais (3D) de engenharia linear (ECTs) a partir de linhagens cardiovasculares derivadas do hiPSC usando um sistema de cultura comercialmente disponível para tecidos bioartíficos 3D^5,,7. Verificou-se que a coexistência de células endoteliais vasculares e células mural com cardiomiócitos dentro da ECT facilitou a maturação estrutural e eletrofisiológica do tecido. Além disso, validamos o potencial terapêutico de hiPSC-ECTs implantados em um modelo de infarto do miocárdio de rato tolerante imunológico para melhorar a função cardíaca, regenerar o miocárdio e melhorar a angiogênese⁵. No entanto, os ECTs lineares construídos por este método foram cilindros de 1 mm por 10 mm e, portanto, não são adequados para a implantação em estudos pré-clínicos com animais maiores ou uso clínico.

Com base no uso bem sucedido de moldes de tecido para gerar formação de tecido poroso projetado usando míbios esqueléticos de rato e cardiomiócitos^9,cardiomiócitos derivados do ESC humano¹⁰ e iPSCs^11,desenvolvemos um protocolo para gerar moldes implantáveis derivados de hiPSC escaláveis usando moldes polidimetiloxano (PDMS). Avaliamos uma série de geometrias de moldes para determinar as características mais eficazes do molde. Os ECTs em forma de malha com múltiplos feixes e junções apresentaram excelentes características na viabilidade celular, função tecidual e escalabilidade em comparação com formatos de folha simples ou lineares que não tinham poros ou junções. Implantamos o ECT em forma de malha em um modelo de infarto do miocárdio de rato e confirmamos seus efeitos terapêuticos semelhantes aos ECTs cilíndricos implantados¹². Aqui descrevemos o protocolo para gerar um ECT em forma de malha derivado do hiPSC.

Protocolo

1. Manutenção de hiPSCs e diferenciação cardiovascular

1. Expandir e manter hiPSCs na matriz de membrana de porão de camada fina (fator de crescimento reduzido, diluição de 1:60) em meio condicionado extraído de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF-CM) com fator de crescimento do fibroblasto básico humano (hbFGF)⁴.
   NOTA: Usamos uma linha hiPSCs (4 fatores (Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc): 201B6). Adicione hbFGF na concentração apropriada para cada linha celular. Fragmento laminin-511 também pode ser usado para o revestimento do prato de cultura em vez de matriz de membrana porão. O meio comercialmente disponível projetado para a cultura livre de alimentador de hiPSCs pode ser usado como um substituto para o MEF-CM.
2. Use versene (0,48 mM de ácido cinacético (EDTA) para desprender e dissociar células quando a confluência celular atingir 90\u2012100%.
   NOTA: Outros produtos disponíveis comercialmente para dissociação celular também podem ser usados.
3. Células de placa a uma densidade de 10.000 células/mm² em placas de cultura de células revestidas de matriz em MEF-CM com hbFGF e cultura por dois a três dias.
4. Quando a cultura se tornar totalmente confluente, cubra as células com matriz (diluição de 1:60 com MEF-CM) por um dia.
5. Substitua o MEF-CM pelo meio RPMI 1640 + B27. Adicione 100 ng/mL de Activin A e 100 ng/mL de Wnt3A ao meio por um dia.
   NOTA: Este é o dia 0 de diferenciação. Para aumentar a sinalização canônica Wnt, os inibidores GSK3β também podem ser usados em vez de Wnt3A.
6. No primeiro dia de diferenciação, mude o médio para o novo RPMI 1640 + B27 com 10 ng/mL de BMP4 e 10 ng/mL de hbFGF. Células de cultura para dois (protocolo MC) ou quatro (protocolo CM+CE) dias sem alteração média⁵.
   NOTA: O protocolo CM+CE é otimizado para induzir simultaneamente cardiomiócitos (CMs) e células endoteliais vasculares (CES). O protocolo MC é otimizado para induzir preferencialmente células mural vascular (MCs).
7. Protocolo CM+CE para indução de CMs e CEs (Figura 1A).
   1. Substitua o meio no dia 5 de diferenciação com RPMI 1640 + B27 complementado por 50 ng/mL de VEGF₁₆₅.
   2. Mude o meio de cultura a cada 48 h até o dia 13\u201215 de diferenciação.
8. Protocolo MC para a indução de células mural vascular (Figura 1B)
   1. Substitua o meio por RPMI1640 + 10% de soro bovino fetal (FBS) no dia 3 de diferenciação.
   2. Mude o meio de cultura a cada 48 h até o dia 13\u201215 de diferenciação.

2. Análise de colheita celular e linhagem no dia da diferenciação 13\u201215

1. Lave as células com salina tamponada de fosfato livre Ca²⁺ e Mg²⁺ (PBS).
2. Adicione a solução de dissociação celular (contendo proteases, colagens e DNAses) no prato de cultura celular para cobrir a placa. Incubar a placa por 5 min a 37 °C.
3. Coletar e dissociar as células com meio de cultura usando uma pipeta após a incubação.
4. Aloque 1 x 10⁶ células para análise de linhagem com citometria de fluxo. Para eliminar células mortas, colorir as células com corante de viabilidade fixável.
5. Manche as células com marcadores de superfície de membrana em PBS com 5% de FBS. Use as seguintes diluições de anticorpos na fluorescência ativado tampão de coloração celular (FACS): anti-PDGFRβ (1:100), cadherina anti-VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
6. Para proteínas intracelulares, resuspenque e fixe as células com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS.
7. Colorir as células com isoforme anti-cardíaca de Troponina T (cTnT) em PBS com 5% de FBS e 0,75% saponina, em seguida, rotular o anticorpo cTnT com 488 mouse IgG1 (diluição 1:50).
8. Resuspend as células manchadas em PBS com 5% de FBS e coloque-as em tubos FACS com coador celular.
9. Analise a composição celular das células manchadas de cada protocolo de diferenciação com citometria de fluxo para facilitar a geração de suspensões celulares com distribuições de linhagem definidas.
   NOTA: Durante a realização deste procedimento, a suspensão restante da célula para ECTs é preservada em um refrigerador de 4 °C.

3. Fabricação de molde de tecido PDMS

1. Lance uma camada de 0,5 mm de espessura e mais de 30 mm x 30 mm de polidimtilsiloxano (PDMS) misturando a solução prepolímero e transfronteiriça a uma proporção de 10:1 e depois curar a 80 °C por 3 h.
2. Corte a folha PDMS e uni-la com adesivo de silicone para fabricar uma bandeja retangular de 21 mm x 20,5 mm com 7 mm de comprimento, 0,5 mm de largura e 2,5 mm de altura em uma posição retangular escalonada. O espaçamento horizontal do poste entre duas linhas de postes é de 2,5 mm (Figura 2B).
3. Autoclave a bandeja a 120 °C por 20 min.
4. Cubra a bandeja com 1% de poloxamer 407 na PBS por 1h. Enxágüe o poloxamer 407 e enxágue o molde com PBS suficientemente antes de usar.

4. Construção da ECT

1. Após a análise da linhagem celular, combine as células dos protocolos CM+CE e MC para que a concentração final de MCs seja de 10 a 20% em um número celular total de seis milhões de células por construção⁵.
2. Suspender seis milhões de células em meio de cultura ECT (meio essencial mínimo alfa suplementado com 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoetanol e 100 U/mL Penicilina-Streptomycina).
3. Preparação da solução matricial
   1. Misture 133 μL de solução de colágeno de cauda de rato solúvel ácido (2 mg/mL, pH 3) com 17 μL de 10x mínimo essencial médio (MEM). Em seguida, misture a solução com 17 μL de tampão alcalino (0,2 M NaHCO₃, 0,2 M HEPES e 0,1 M NaOH).
      NOTA: O colágeno deve ser mantido no gelo (4 °C). Verifique a cor do tampão e se o meio não ficar rosado quando todas as soluções estiverem misturadas, adicione tampão de álcali adicional ao meio. Os passos de mistura devem ser misturar colágeno I + 10x MEM e, em seguida, adicionar tampão alcalino. NÃO mude esta ordem. NÃO gere bolhas na mistura.
   2. Adicione 67 μL de matriz de membrana de porão à solução neutralizada de colágeno.
      NOTA: A solução mista deve ser mantida no gelo (4 °C).
4. Centrifugar a suspensão celular preparada contendo seis milhões de células a 1.100 rpm (240 x g) por 5 min e resuspengar as células com 167 μL de DMEM de alta glicose + 20% FBS + 1% penicilina-estreptomicina (100x).
5. Misture a suspensão celular e a solução matricial. O volume total da mistura celular/matriz para uma construção é de 400 μL.
   NOTA: A mistura celular/matriz deve ser não viscosa e uma cor rosada nesta etapa. Mantenha-o no gelo, pois o gel se solidificará à temperatura ambiente. A concentração final do colágeno tipo I é de 0,67 mg/mL.
6. Despeje a mistura celular/matriz uniformemente sobre o poloxamer 407 revestido molde de tecido PDMS, que é colocado em uma placa de cultura de seis poços¹².
   NOTA: Despeje a mistura cuidadosamente para evitar a geração de bolhas, a fim de evitar defeitos de enchimento no gel derramado.
7. Incubar a mistura célula/matriz em uma incubadora padrão de CO₂ (37C, 5 % DE CO₂) por 60 min.
8. Depois que o tecido for formado, mergulhe o molde de tecido com 4 mL de meio de cultura ECT.
   NOTA: Embora a célula/matriz esteja interligada em 60 minutos, a construção ainda é muito frágil. Adicione o meio suavemente para evitar danificá-lo.
9. Cultura do tecido por 14 dias com mudança média todos os dias.
10. Antes da implantação da ECT, remova o ECT dos postes de carregamento suavemente usando fórceps finos esterilizados.
    NOTA: As dimensões finais da ECT após a remoção do molde são inferiores ao molde original. Um molde de 2,1 cm x 2,05 cm gera um ECT liberado de aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm. Um molde maior de 3,9 cm x 4,05 cm gera um ECT de aproximadamente 3 cm x 3 cm. ECT descarregado mostra espancamento espontâneo intrínseco em meio de cultura quente. Embora inicialmente mantenha uma estrutura de malha, uma ECT descarregada encolhe e condensa ao longo do tempo. É possível segurar o tecido suavemente com fórceps finos e, em seguida, usar sutura de seda 7-0 para anexar o ECT ao epicárdio.

Resultados

A Figura 1A,B mostra os esquemas do protocolo CM+CE e MC. Depois de induzir CMs e ECs do protocolo CM+EC e MCs do protocolo MC, as células são misturadas ajustando as concentrações finais de MC para representar de 10 a 20% do total de células. O molde de tecido de 2 cm de largura é fabricado de acordo com o desenho de 0,5 mm de espessura da folha PDMS de espessura(Figura 2A,B). Seis milhões de células CM+EC+MC são combi...

Discussão

Após a conclusão de nossa investigação de um formato linear, o ECT⁵derivado do hiPSC, adaptamos o protocolo para misturar CMs, CEs e MCs derivados de hiPSC para facilitar a expansão in vitro de células vasculares dentro dos ECTs e posterior acoplamento vascular in vivo entre ECTs e miocárdio receptor.

Para facilitar a geração de geometrias ECT de malha maiores e implantáveis, utilizamos folhas PDMS finas para projetar os moldes 3D com postes de carregamento di...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002