Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano

Resumo

Descrevemos um protocolo para microdisseção a laser de subsegmentos do rim humano, incluindo o glomerulus, túbulo proximal, membro ascendente espesso, coletor de duto e interstício. O RNA é então isolado dos compartimentos obtidos e o sequenciamento de RNA é realizado para determinar alterações na assinatura transcriômica dentro de cada subsegmento.

Resumo

A análise da expressão genética do tecido renal humano é uma ferramenta importante para entender a homeostase e a fisiopatologia da doença. Aumentar a resolução e a profundidade dessa tecnologia e estendê-la ao nível das células dentro do tecido é necessário. Embora o uso de sequenciamento de RNA uni nuclear e unicelular tenha se espalhado, as assinaturas de expressão das células obtidas a partir da dissociação tecidual não mantêm o contexto espacial. A microdisseção a laser (LMD) baseada em marcadores fluorescentes específicos permitiria o isolamento de estruturas específicas e grupos celulares de interesse com localização conhecida, permitindo assim a aquisição de assinaturas transcriômicas ancoradas espacialmente no tecido renal. Otimizamos uma metodologia de LMD, guiada por uma mancha rápida baseada em fluorescência, para isolar cinco compartimentos distintos dentro do rim humano e realizar sequenciamento subsequente de RNA de valiosos espécimes de tecido renal humano. Também apresentamos parâmetros de controle de qualidade para permitir a avaliação da adequação das amostras coletadas. O fluxo de trabalho descrito neste manuscrito mostra a viabilidade dessa abordagem para isolar assinaturas transcriômicas subsu segmentares com alta confiança. A abordagem metodológica aqui apresentada também pode ser aplicada a outros tipos de tecidos com substituição de marcadores de anticorpos relevantes.

Introdução

Os avanços tecnológicos no estudo dos espécimes teciduais melhoraram a compreensão do estado de saúde e da doença em diversos órgãos. Tais avanços têm sublinhado que a patologia pode começar em regiões limitadas ou em tipos celulares específicos, mas têm implicações importantes em todo o órgão. Portanto, na atual era da medicina personalizada, é importante compreender a biologia tanto no nível celular quanto regional e não apenas globalmente¹. Isso é particularmente verdadeiro no rim, que é composto por várias células e estruturas especializadas que iniciam diferencialmente e/ou respondem ao estresse patológico. A patogênese de vários tipos de doença renal humana ainda não é bem compreendida. Gerar uma metodologia para estudar mudanças na expressão genética em segmentos tubulares específicos, estruturas ou áreas do interstício no rim humano aumentará a capacidade de descobrir alterações específicas da região que poderiam informar sobre a patogênese da doença.

Biópsia de rim humano é um recurso limitado e precioso. Portanto, as tecnologias que interrogam a transcrição no tecido renal devem ser otimizadas para economizar tecido. Os métodos disponíveis para estudar transcrição em nível celular e regional incluem sequenciamento de RNA de célula única (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridização espacial in situ e microdissecção a laser (LMD). Este último é adequado para o isolamento preciso de regiões ou estruturas de interesse dentro de seções teciduais, para sequenciamento e análise de RNA a jusante^2,3,4,5. A LMD pode ser adotada para contar com a identificação de tipos ou estruturas celulares específicas baseadas em marcadores validados usando imagens baseadas em fluorescência durante a dissecção.

As características únicas da microdisseção a laser assistida transcrição regional incluem: 1) a preservação do contexto espacial das células e estruturas, que complementa tecnologias celulares únicas onde as células são identificadas pela expressão e não histologicamente; 2) a tecnologia informa e é informada por outras tecnologias de imagem porque um marcador de anticorpos define assinaturas de expressão; 3) a capacidade de identificar estruturas mesmo quando os marcadores mudam na doença; 4) detecção de transcrições humildemente expressas em aproximadamente 20.000 genes; e 5) notável economia tecidual. A tecnologia é escalável para uma biópsia renal com menos de 100 μm de espessura de um núcleo necessário para aquisição suficiente de RNA e permite o uso de tecido congelado arquivado, que são comumente disponíveis em grandes repositórios ou centros acadêmicos⁶.

No trabalho seguinte, descrevemos em detalhes a tecnologia de transcrição regional e em massa, otimizada com um novo protocolo de coloração rápida de fluorescência para uso com tecido renal humano. Essa abordagem melhora em explorações clássicas de LMD porque fornece dados de expressão separados para os subsegmentos interstitium e nefron em oposição à expressão tubulointerstícia agregada. Incluem-se as medidas de garantia e controle de qualidade implementadas para garantir rigor e reprodutibilidade. O protocolo permite a visualização de células e regiões de interesse, resultando na aquisição satisfatória de RNA dessas áreas isoladas para permitir o sequenciamento de RNA a jusante.

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Protocolo

O estudo foi aprovado para uso pelo Institutional Review Board (IRB) da Universidade de Indiana.

NOTA: Use este protocolo com tecido de nefrectomia renal (até 2 cm nas dimensões X e Y) preservado no composto de Temperatura de Corte Ideal (OCT) e armazenado a -80 °C. Realize todo o trabalho de forma que limite a contaminação do RNA, use luvas descartáveis limpas e uma máscara facial. Certifique-se da limpeza de todas as superfícies. O equipamento para o qual este protocolo foi otimizado é um sistema de microdissecção a laser com laser UV pulsado.

1. Criosectioning

1. Exponha slides de 1,2 μm LMD PPS-membrana (poli(p-fenileu sulfeto) à luz UV (em uma capa de fluxo laminar da cultura tecidual) por 30 minutos, imediatamente antes da criosecção. Armazene os slides à temperatura ambiente para a adesão ideal do tecido.
2. Esfrie o criostat para -20 °C. Limpe as superfícies de trabalho e instale uma nova lâmina de corte.
3. Coloque uma pequena caixa de slides (limpa com solução de descontaminação da superfície RNase) dentro da câmara criostat para armazenar lâminas com tecido recém-cortado.
4. Adere a amostra em OUTUBRO a um suporte de tecido e deixe-o equilibrar por alguns minutos para atingir a temperatura da câmara e fortalecer a adesão entre o bloco DECs e o suporte. Ajude o processo usando um extrator de calor.
5. Corte o espécime a uma espessura de 12 μm e afixe-o no slide LMD especializado, usando o adaptador de slides. Cada slide contém uma seção de nefrectomia por slide ou até duas seções de biópsia renal por slide. Armazene os slides a -80 °C com um cartucho dessecante e dentro de um saco plástico bem fechado para evitar que o excesso de umidade se acumule dentro da caixa de slides.
6. Rotule cada slide com um ID de espécime, data e número de slides.
7. Use os slides com espécimes dentro de 10 dias a partir da data inicial de criosectioning.

2. Microdisseção a laser

1. Imediatamente antes da coloração, prepare o Mix de Anticorpos (Ab-Mix) em 10% BSA no PBS livre de RNase adicionando o seguinte: 4 μL de FITC-Phalloidin, 1,5 μL de DAPI, 2 μL de anticorpo Tamm-Horsfall Protein (THP) diretamente conjugado ao Alexa Fluor 546, 3,3 μL de Inibidor de RNase e 89,2 μL de 10% BSA em PBS (para atingir um volume de 100 μL).
   NOTA: Podem ser utilizados anticorpos alternativos no lugar do anticorpo THP. Por exemplo, 2 μL de anticorpo megalin/LRP2, diretamente conjugado ao Alexa Fluor 568, pode ser usado para rotular o túbulo proximal. O Ab-Mix contém anticorpoS LRP2 ou THP (para visualizar túbulos proximais ou membros ascendentes espessos, respectivamente). Outros anticorpos podem ser validados de acordo com as necessidades do usuário.
2. Lave o slide no frio gelado (-20 °C) 100% acetona por 1 min e mova-o para a câmara de umidade.
3. Lave a parte superior do slide com PBS sem RNase por 30 s. Repita.
4. Lave a parte superior do slide com 10% de BSA no PBS livre de RNase por 30 s. Repita.
5. Aplique o Ab-Mix por 5 minutos.
6. Lave a parte superior do slide com 10% de BSA no PBS livre de RNase por 30 s. Repita.
7. Seque o escorregador por 5 minutos e carregue-o na plataforma de corte de microdisseção a laser.
8. Instale os tubos de coleta (tubos de microcentrifuuge de 0,5 mL) apropriados para o trabalho de PCR, contendo 50 μL de Buffer de Extração do kit de isolamento RNA.
9. Prossiga com LMD. Complete cada sessão de LMD dentro de no máximo 2 horas.
   1. Coletar imagens de imunofluorescência pré e pós-LMD, utilizando a câmera do microscópio para validar a dissecção para variabilidade entre operadores, bem como fins de arquivamento, treinamento e avaliação de qualidade do protocolo realizado. Para obter 0,5 – 1 ng de RNA, é necessário um mínimo de 500.000 μm² de área. Isso muitas vezes requer o uso de seções de até 8 x12 μm de espessura para obter uma quantidade suficiente de material para todos os subsegmentos de interesse.
   2. Identifique regiões de interesse por coloração, morfologia e localização e extirpa-as usando energia laser maior que 40.
      NOTA: Aqui estão os critérios de dissecção. O túbulo proximal é definido pela rotulagem FITC-Phalloidin e LRP2. O membro ascendente espesso é definido pela rotulagem THP. O ducto coletor é definido pela morfologia nuclear (DAPI) e ausência de outras manchas. O glomerulus é definido por FITC-Phalloidin e morfologia. O interstício é definido como a área entre túbulos manchados.
10. Obtenha uma assinatura de expressão transversal em massa, afixando duas seções de 12 μm em um slide LMD e dissecando as seções inteiras em buffer de extração.
11. Após a conclusão do processo LMD, feche os tubos de microcentrifuuagem de coleta e pise vigorosamente para garantir que o conteúdo tenha se movido da tampa para a parte inferior do tubo
12. Centrifugar os tubos a 3.000 x g para 30 s.
13. Incubar os tubos em banho de água de 42 °C por 30 min.
14. Centrifugar os tubos a 3.000 x g por 2 min.
15. Transfira o supernatante para um novo tubo de 0,5 mL e armazene-o em -80 °C.

3. Isolamento do RNA

NOTA: Para este protocolo de isolamento de RNA, adaptamos um protocolo de um kit comercial de isolamento de RNA. O protocolo do fabricante foi modificado para atender aos requisitos de controle de qualidade estabelecidos para o projeto.

1. Adicione 250 μL de Buffer Condicionado (CB) a cada coluna de purificação de RNA (PC) e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente.
2. Centrifugar todos os PCs por 1 min a 16.000 x g.
3. Adicione 50 μL de 70% de etanol (fornecido no Kit) nos tubos com amostras de tecido. Misture bem as amostras por pipetting para cima e para baixo. Não vórtice. Não centrifugar.
4. Transfira a mistura em PCs condicionados e centrífuga por 2 min a 100 x g (para ligar o RNA), siga rapidamente com centrifugação para 30 s a 16.000 x g (para remover o fluxo). Repita esta etapa se mais de 1 tubo com amostras de tecido estiverem disponíveis para qualquer subsegmento.
5. Adicione 100 μL de Wash Buffer 1 (WB1) nos PCs e centrífuga por 1 minuto a 8.000 x g.
6. Prepare 40 μL de DNase por cada amostra (Adicione 5 μL de DNase a 35 μL de buffer RDD). Em seguida, adicione 40 μL da mistura diretamente na membrana do PC e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
7. Adicione 40 μL de WB1 na membrana do PC e centrífuga por 15 s a 8.000 x g.
8. Adicione 100 μL de Wash Buffer 2 (WB2) na membrana do PC e centrífuga por 1 min a 8.000 x g.
9. Adicione 100 μL de WB2 na membrana do PC, centrífuga por 2 min a 16.000 x g,siga imediatamente por centrifugação por 1 min a 16.000 x g.
10. Transfira o PC para um novo tubo de 0,5 mL.
11. Adicione 12 μL de Amortecedor de Elução (EB) na membrana e incubar por 7 minutos à temperatura ambiente. Assim, o volume final de todas as amostras de tecido dissecado agrupadas é de 12 μL por subsegmento.
12. Centrifugar as amostras por 1 min a 1.000 x g e depois por 2 min a 16.000 x g.
13. Transfira 2 μL para um tubo fresco para análise bioanalílise (para evitar eventos de congelamento).
14. Armazene todos os tubos em -80 °C até ficar pronto para posterior processamento.

4. Sequenciamento de RNA

1. Avalie cada amostra, destinada ao sequenciamento, para qualidade utilizando um Bioanalyzer comercial e um chip dedicado à medição de pequenas quantidades de RNA.
2. Seguindo os parâmetros de controle de qualidade (QC) antes da preparação da biblioteca e sequenciamento: Quantidade de RNA maior que 4 ng para a granel e superior a 0,5 – 1 ng para cada subsegmento; O percentual de transcrições com mais de 200 nucleotídeos (DV200) é necessário para ser superior a 25% para amostras de LMD (ótimo > 75%).
3. Realize a preparação da biblioteca com um kit comercial de preparação da biblioteca cDNA destinado a pequenas quantidades de RNA degradado. Para o kit comercial listado no suplemento, sugerimos o uso da Opção 2, que requer um DV200 mínimo de 25% e nenhuma fragmentação. Algumas tecnologias de sequenciamento podem exigir limites mínimos de DV200 mais elevados, como 30%⁷.
4. Adicione adaptadores e índices cDNA.
5. Purifique as bibliotecas RNAseq usando tecnologia de contas magnéticas.
6. Despoque o cDNA ribossômico usando um kit comercial de remoção de rRNA antes da etapa de amplificação da biblioteca RNAseq.
7. Purifique a biblioteca rnaseq final usando tecnologia de contas magnéticas em uma concentração de biblioteca cDNA de 2ng/μL.
8. Realize o sequenciamento de RNA de 75 bp emparelhado em um sistema de sequenciamento comercial com 30 milhões de leituras/amostra para massa e 100 milhões de leituras/amostra para seções subsu segmentares.
9. Use um RNA de referência (25 μg) a cada execução de sequenciamento para permitir o controle do efeito em lote. A concentração inicial do nosso RNA de referência é de 1 μg/μL, enquanto a concentração final utilizada no sequenciamento é de 25 ng/μL. Execute o RNA de referência como uma amostra separada durante a preparação da biblioteca e execute com todos os espécimes de LMD cada vez.
10. Realize a análise de dados utilizando a aplicação FastQC para avaliar a qualidade do sequenciamento, leituras intergênicas e mitocondriais e determinar leituras atribuídas a um gene.
11. Use O Visualizador de Genômica Integrativa (IGV) para alinhamento e edgeR/rbamtools para medidas de expressão de transcrição.
12. Remova amostras com menos de 100.000 leituras. Quantile normalize as leituras brutas no conjunto de dados após filtrar genes humildemente expressos em um limiar definido pelo usuário.
13. Quantifique a expressão como uma razão do subsegmento de interesse para a média de todos os outros subsegmentos e log2-transform. A expressão relativa do mesmo gene pode ser comparada entre subsegmentos e amostras; no entanto, não é ideal comparar a expressão relativa entre dois genes diferentes devido a potenciais diferenças na degradação entre genes e espécies de RNA.
14. Realize uma análise de enriquecimento para comparar a expressão genética de um conjunto de fabricantes específicos para cada subsegmento de nephron, enquanto as amostras de RNA de referência são comparadas entre lotes. Um efeito em lote dentro de 1 desvio padrão de expressão média com valor de R > 0,9 é considerado aceitável. É necessária uma normalização adicional para uma pontuação de efeito em lote mais alta. Qualquer execução que se desvie do efeito de lote aceito pode ser sinalizada. O Q30 deve ser maior que >90% para cada sequência de sequenciamento.

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Resultados

Amostras

Apresentamos dados de nove nefrectomias de referência (3 espécimes obtidos na Universidade de Indiana e 6 espécimes obtidos através do Kidney Precision Medicine Project), utilizando o protocolo de coloração de fluorescência rápida para isolar segmentos de nefradeira renal e áreas intersticiais. As seções utilizadas neste processo foram obtidas de doadores renais falecidos ou nefrectomias tumorais não afetadas. Estas amostras não apresentaram evidência pa...

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Discussão

A transcriptômica baseada em LMD é uma tecnologia útil que ancora a expressão genética em áreas específicas dentro do tecido. A base dessa tecnologia e sua potencial aplicação no rim foram descritas anteriormente⁸. No entanto, a otimização, modernização e simplificação da dissecção baseada em fluorescência especificamente destinada à dissecção de alta precisão para sequenciamento de RNA a jusante é menos onipresente. Como essa metodologia é espacialmente fundamentada dentro...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Desiccant Cartridge	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody	Abcam	ab76969	Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	AB-0350
Microscope camera	Leica	DFC700T
PBS (RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membrane slides	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody	R&D Systems	AF5144	Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583