Identificação de Inibidores EGFR e RAS utilizando elegans caenorhabditis

Resumo

O nematode geneticamente tratável Caenorhabditis elegans pode ser usado como um modelo simples e barato para a descoberta de drogas. Descrito aqui é um protocolo para identificar terapêutica anticancerígenas que inibem a sinalização a jusante das proteínas RAS e EGFR.

Resumo

As alterações na localização da membrana plasmática do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e seu efeito a jusante RAS foram implicadas em várias doenças, incluindo o câncer. O nematode de vida livre C. elegans possui uma cascata de sinal map EGFR-RAS-ERK evolutiva e funcionalmente conservada que é central para o desenvolvimento da vulva. O ganho de mutações de função no homólogo RAS LET-60 e EGFR homólogo LET-23 induzem a geração de pseudovulva ectópica não-funcional visível ao longo da parede do corpo ventral desses vermes. Anteriormente, o fenótipo multivulval (Muv) nesses vermes tem se mostrado inibido por pequenas moléculas químicas. Aqui descrevemos um protocolo para o uso do worm em um ensaio à base de líquido para identificar inibidores que abolim as atividades das proteínas EGFR e RAS. Usando este ensaio, mostramos R-fendiline, um inibidor indireto de K-RAS, suprime o fenótipo Muv expresso nos vermes mutantes let-60(n1046) e let-23(sa62). O ensaio é simples, barato, não é demorado para a configuração, e pode ser usado como uma plataforma inicial para a descoberta de terapêutica anticancerígena.

Introdução

As vias celulares que regulam eventos de desenvolvimento dentro dos organismos são altamente conservadas entre todos os metazoanos. Um desses caminhos é a cascata de sinalização de proteína ativada por mitogênio EGFR-RAS-ERK (MAPK), que é um caminho crítico que rege a proliferação celular, diferenciação, migração e sobrevivência^1,2. Defeitos nessa via de sinalização podem levar a estados patológicos ou de doenças, como o câncer. O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) mostrou-se altamente expresso em tumores humanos, incluindo 50% dos carcinomas escamosos escamosos orais, e contribui para o desenvolvimento de tumores malignos^3,4,5. Considerando que as mutações nos três ISoformes RAS H-, K-e N-RAS são os principais impulsionadores da transformação maligna em múltiplos cânceres humanos. Entre esses três isoformes RAS, as mutações oncogênicas em K-RAS são as mais prevalentes^6,7,8. Para que o EGFR e o RAS funcionem, eles devem se localizar na membrana plasmática (PM). Prevenir a localização dessas moléculas para a PM pode revogar completamente a atividade biológica desta via de sinal^9,10. Daí a inibição da localização dessas proteínas para a PM é uma estratégia terapêutica para bloquear a sinalização a jusante e os desfechos adversos resultantes. Usando um ensaio de triagem de alto teor, fendiline, um bloqueador de canal de cálcio tipo L, foi identificado como um inibidor da atividade K-RAS¹¹. A nanoglomeragem de K-RAS ao folheto interno da PM é significativamente reduzida na presença de fendilina. Além disso, o K-RAS é redistribuído da membrana plasmática para o ânticulo endoplasmático (ER), aparelho golgi, endosários e citosol. Mais importante, a proliferação de linhas de células cancerígenas pancreáticas, cólons, pulmonares e endometrial expressando o mutante oncogênico K-RAS é bloqueada pela inibição da sinalização a jusante pela fendiline¹¹. Esses dados sugerem funções de fendilina como um terapêutico anticâncer K-RAS específico que causa a má localização da proteína RAS ao PM.

O nematode Caenorhabditis elegans tem sido extensivamente estudado no contexto do desenvolvimento. Muitas das vias de sinal que governam o desenvolvimento do verme são evolutivas e funcionalmente conservadas. Por exemplo, a ativação mediada pelo EGFR do RAS e a ativação subsequente da cascata de sinal ERK MAPK são conservadas no worm¹². A cascata é representada pelas seguintes proteínas: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. Let-60 é homólogo do RAS, enquanto o LET-23 é homólogo do EGFR. No verme, essa via regula o desenvolvimento da vulva¹³. A vulva é uma abertura epitelial na parede do corpo ventral do verme que permite que ovos fertilizados sejam colocados. A formação da vulva no verme depende da exposição das células precursoras vulval (VPC) a um gradiente de ativação da cascata de sinal EGFR-RAS-MAPK. Durante o desenvolvimento normal, os VPCs proximais recebem fortes sinais das células de ancoragem gonadal para se diferenciar em destinos de células 1° e 2° que dão origem a uma vulva^{funcional 12}. Considerando que os VPCs distal se diferenciam em destinos de células 3° que se fundem ao siníntécio hipodérmico e não formam vulva devido à sinalização esgotada. Na ausência de sinalização, todas as VPCs se diferenciam em destinos celulares 3° resultando na formação de nenhuma vulva. No entanto, a sinalização constitutiva leva à formação de uma ou mais vulva não funcionais devido à indução de todos os VPCs para assumir destinos celulares de 1° e 2°.

Mutações que causam indução vulval defeituosa ou excessiva foram identificadas para muitos dos genes que codificam proteínas que representam esse caminho. A indução vulval defeituosa resulta em um fenótipo vulvaless (Vul), enquanto a indução excessiva de vulval resulta em um fenótipo multivulva (Muv) que é representado pelo desenvolvimento de numerosos pseudovulvaos ectópicos não funcionais em toda a parede do corpo ventral. O fenótipo Muv expresso pela cepa let-60(n1046) é devido a um ganho de mutação de função no RAS, enquanto na cepa let-23(sa62) é devido a uma mutação ativadora no EGFR^14,15. O forte fenótipo Muv nestas cepas mutantes tem se mostrado perturbado por intervenções farmacológicas como demonstrado pelo tratamento de vermes let-60(n1046) com o inibidor MEK-1 U0126^16,17. Curiosamente, mostramos que r-fendilina e inibidores que afetam o metabolismo de sphingomyelin suprimem o fenótipo Muv no verme¹⁸. Para demonstrar esses inibidores bloqueiam a sinalização let-60 ao nível do RAS, utilizou-se a cepa nula lin-1 ¹⁷. Lin-1 é um fator de transcrição inibitória semelhante ao Ets que funciona como um repressor no desenvolvimento da vulva¹⁹. Forte reversão do fenótipo Muv em worms let-60(n1046) e nenhum efeito sobre vermes nulos lin-1 sugerem que essas inibições ocorrem ao nível de RAS.

Neste protocolo, demonstramos o uso de C. elegans como modelo para identificar inibidores de proteínas RAS e EGFR. Usando um ensaio à base de líquido, demonstramos os efeitos inibitórios da R-fendiline suprimindo os fenótipos Muv nas cepas mutantes let-60(n1046) e let-23(sa62) de C. elegans. Este ensaio valida o uso de C. elegans como uma ferramenta na fase inicial de descoberta de medicamentos para terapêutica anticancerígena.

Protocolo

1. Preparação da placa de crescimento de nematoides (GNM)

1. Adicione 2,5 g de peptone e 3 g de NaCl a 970 mL de água deionizada contida em um frasco de 2 L Erlenmeyer. Misture o conteúdo usando uma barra de agitação magnética. Depois disso, adicione 20 g de ágar ao frasco. Autoclave o conteúdo do frasco a 121 °C e uma pressão de 15 lb/in² por 30 min. Após a esterilização, coloque o frasco em uma placa de mexida e deixe o meio esfriar até que a temperatura atinja 50 °C.
2. Para preparar as placas de NGM adicione os seguintes reagentes ao meio resfriado: 25 mL de tampão fosfato de potássio de 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de colesterol (5 mg/mL em 95% de etanol), colesterol, 1 mL de (10% v/w no etanol) nystatin, e 1 mL de estreptomicina de 25 mg/mL.
3. Sob um fluxo laminar, despeje o meio resfriado em placas de Petri estéreis de 60 mm x 15 mm. Deixe as placas se solidificarem por 2h. Estas placas podem ser mantidas por 1 mês a 4 °C.

2. Propagação de C. elegans

1. Local 100 μL de E. coli OP50 durante a noite no centro de cada placa NGM e deixe as placas secarem por 24 h em um capô laminar. Posteriormente, as placas podem ser armazenadas em recipiente de poliestireno.
   NOTA: A cultura E. coli OP50 é cultivada em mídia Luria-Bertani (LB) a 37 °C de mídia antes da semeadura das placas. A cultura pode ser armazenada a 4 °C por 1 a 2 meses e utilizada para semeadura periódica de placas.
2. Usando uma picareta de vermes estéreis, reúna 10-12 vermes adultos gravid de uma placa previamente cultivada sob um microscópio dissecando. Transfira esses vermes para uma placa NGM fresca semeada com E. coli OP50 e incubar a placa por 24 h a 20 °C.
3. Depois de 24 horas, usando uma picareta de vermes estéril remova vermes adultos das placas. Incubar as placas a 20 °C por ~ 3 dias. Embriões se desenvolverão em vermes adultos gravid.

3. Preparação de uma cultura síncrona de C. elegans

1. Colete vermes adultos gravid em um tubo cônico de 15 mL lavando placas de 2 a 4 com M9W.
   1. Preparação de M9W: Dissolver 5 g de NaCl, 6 g de Na₂HPO₄, e 3 g de KH₂PO₄ em água deionizada para um volume final de 1 L. Autoclave a solução a 121 °C a uma pressão de 15 lb/in² por 30 min. Adicione 1 mL de 1 M MgSO₄ à solução resfriada.
2. Pelota os vermes centrifugando o tubo a 450 x g por 1 min. Decante o supernatante sem perturbar a pelota de verme.
3. Prepare a solução de lise míope combinando 400 μL de hipoclorito de sódio de 8,25% (alvejante doméstico) e 100 μL de 5 N NaOH. Adicione esta solução à pelota de minhoca e aperte o tubo para misturar o conteúdo do tubo. Evite o excesso de embriões no tubo observando a lise dos vermes sob um microscópio dissecando.
4. Adicione 10 mL de M9W ao tubo cônico para diluir a mistura de lise quando 70% dos vermes adultos tiverem lise.
5. Centrifugar o tubo a 450 x g por 1 min. Substitua o supernatante por 10 mL de M9W.
6. Repita o passo 3.5 duas vezes.
7. Depois de completar as etapas de lavagem, adicione 3-5 mL de M9W para resuspensar a pelota de ovo. Gire o tubo durante a noite a uma velocidade de 18 rpm em um rotador de tubo a temperatura ambiente (RT).
8. Após a incubação durante a noite, remova o tubo da rotadora, pelotar as larvas L1 centrifugando o tubo a 450 x g por 1 min. Aspire o M9W até que 250 μL seja deixado no tubo.
9. Agite o tubo para resuspensar as larvas. Adicione três gotas de 5 μL contendo as larvas em uma tampa de placa de Petri. Usando um microscópio dissecando, o número de vermes em cada gota e determina o número de vermes em 1 μL.

4. Preparação de ensaios medicamentosos

NOTA: As etapas deste ensaio são mostradas na Figura 1.

1. Cresça 30 mL de E. coli OP50 em um tubo cônico de 50 mL a 37 °C durante a noite em um agitador orbital a 150 rpm.
2. Gire durante a noite cultivada cultura E. coli OP50 a 4.000 x g por 10 minutos para pelotar as células. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 3 mL de M9W para concentrar a cultura.
3. Antes de preparar as soluções de trabalho para o ensaio da droga, adicione 0,1 mL de colesterol (5 mg/mL em 95% de etanol) em 100 mL de M9W.
4. Prepare soluções de trabalho de cada droga experimental diluindo cada medicamento mais veículo (sulfóxido de dimetil; DMSO) em 4,8 mL M9W complementado com colesterol para obter as concentrações apropriadas. Dissolver o DMSO em 4,8 mL de M9W suplementado com colesterol para preparar o controle do veículo.
5. Adicione 200 μL de cultura E. coli OP50 concentrada a cada tubo contendo o controle do veículo ou drogas e tubos de vórtice para garantir que eles sejam misturados.
6. Para realizar o experimento, adicione 2 mL de cada solução de droga de trabalho ou controle de veículo a cada poço em uma placa de cultura tecidual de 12 poços. Teste cada concentração de droga e controle do veículo em duplicata.
7. Adicione ~100 larvas L1 por poço (ver passos síncronas da cultura C. elegans) usando uma micropipette estéril. Limitar o volume de vermes a 10 μL.
8. Incubar as placas a 20 °C.
9. Suplemento de poços com 50 μL de 10x concentrado E. coli OP50 no dia 3 do ensaio, se necessário.

5. Preparação da almofada de agarose para microscopia

1. Prepare uma solução de 2% c/v de agarose dissolvendo 0,1 g de agarose em 5 mL de água deionizada. Aqueça o conteúdo em um micro-ondas para dissolver a ágarose. 20 slides podem ser preparados a partir de 5 mL de solução agarose.
2. Coloque tiras de fita de laboratório ao longo de dois slides de vidro. A fita funcionará como espaçadores limitando a espessura das almofadas agarose. Depois disso, coloque um terceiro deslizamento de vidro limpo entre os slides colados.
3. Para fazer uma almofada de agarose, local 100 μL de agarose derretida surgiu no centro do slide limpo. Coloque outro deslizamento de vidro limpo através e em cima da agarose e pressione suavemente para baixo para formar uma almofada. Remova o slide superior quando a almofada tiver se solidificado.

6. Observação do fenótipo Muv nas cepas let-60, let-23 e lin-1

NOTA: Somente as drogas candidatas que suprimem os fenótipos Muv nas cepas let-23 e let-60 serão avaliadas usando a cepa lin-1 para determinar se a inibição ocorre no nível de RAS ou EGFR.

1. Quando o estágio apropriado do ciclo de vida for atingido (3 dias para as cepas let-60 e let-23, 5 dias para a cepa lin-1), remova as placas da incubadora. e coletar os vermes em tubos cônicos de 15 mL usando uma pipeta.
2. Centrifugar os tubos a 450 x g por 1 min. Remova M9W sem perturbar a pelota de worm e adicione 5 mL de M9W fresco.
3. Repita o passo 6.2 duas vezes.
4. Sem perturbar a pelota de verme, remova todos os M9W restantes por aspiração. Depois disso, adicione 500 μL de azida de sódio de 2 mM ou cloridrato de tetramisole de 2 mM. Permitir que os tubos incubam na RT por 15 min. 2 mM de azida de sódio ou cloridrato de tetramisole de 2 mM anestesiará os vermes para a imagem.
   ATENÇÃO: Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual (EPI) ao manusear azida de sódio. A solução deve ser preparada sob um capuz químico.
5. Adicione 10 μL da suspensão anesthetizada do verme no centro de uma almofada de agarose. Coloque uma #1,5 de cobertura suavemente sobre a suspensão do worm. Se necessário, fixar a mancha com um pouco de esmalte para evitar a secagem.
6. Use um microscópio DIC para observar as cepas let-60(n1046), let-23(sa62) e lin-1(sy254). Imagem dos vermes nas ampliações de 10x e 20x.
7. Para let-60(n1046) e let-23(sa62), marque os vermes adultos com base na presença ou ausência do fenótipo Muv. Enquanto para a cepa lin-1, conte o número de VPCs que adotaram destinos celulares de 1° ou 2° no lado ventral das larvas L4 usando um microscópio DIC de alta resolução.
8. Após a pontuação dos micrografos para cada cepa e tratamento medicamentoso, realize o teste t-testdo aluno para determinar as diferenças estatísticas entre os tratamentos.

Resultados

Primeiro demonstramos que a R-fendilina é capaz de suprimir o fenótipo Muv na cepa mutante let-60(n1046) em comparação com os vermes tratados com DMSO. Nossos dados mostram que a R-fendilina é capaz de bloquear o fenótipo Muv no let-60(n1046) de forma dependente de dose(Figura 2A,B). No entanto, a não reversão do fenótipo Muv foi observada na cepa mutante nula lin-1 em resposta ao aumento das concentrações de R-fendiline

Discussão

Os ensaios que descrevemos usando o worm são simples e baratos para identificar inibidores da função EGFR e RAS. C. elegans é um modelo atraente para a descoberta de drogas porque é fácil crescer em laboratório devido ao ciclo de vida curto (3 dias a 20 °C) e à capacidade de gerar um grande número de larvas. Mais importante, a via MAPK EGFR-RAS-ERK é evolutiva e funcionalmente conservada com mamíferos fornecendo um sistema geneticamente tratável para analisar os efeitos dos inibidores EGFR e RAS. Al...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide	Millipore Sigma	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite			Bleach
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride	Millipore Sigma	L9756
UO126 (MEK inhibitor)	Millipore Sigma	19-147
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC