Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

Resumo

Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expressão genética.

Resumo

O cerebelo desempenha um papel importante em várias funções-chave, incluindo controle de movimento, equilíbrio, cognição, recompensa e afeto. Estudos de imagem indicam que regiões cerebelares distintas contribuem para essas diferentes funções. Estudos moleculares que examinam as diferenças cerebelares regionais estão defasando, pois são feitos principalmente em extratos cerebelares inteiros, mascarando assim quaisquer distinções em regiões cerebelares específicas. Aqui descrevemos uma técnica para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida quatro regiões cerebelares diferentes: os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar vermal anterior e posterior, e o córtex cerebelar dos hemisférios. Dissecar essas regiões distintas permite a exploração de mecanismos moleculares que possam fundamentar suas contribuições únicas para o equilíbrio, o movimento, o afeto e a cognição. Esta técnica também pode ser usada para explorar diferenças na suscetibilidade patológica dessas regiões específicas em vários modelos de doenças de camundongos.

Introdução

O cerebelo contém mais da metade dos neurônios do cérebro e tem sido historicamente referido como um centro de controle e equilíbrio motor no cérebro¹. Mais recentemente, estudos demonstraram que o cerebelo desempenha um papel fundamental em várias outras funções, incluindo cognição, processamento de recompensas e afeto^2,3,4,5.

O cerebelo tem anatomia bem descrita: a região do córtex é composta de granulo, Purkinje e camadas moleculares. As células de grânulo formam a camada celular do grânulo e enviam entrada através de fibras paralelas aos dendritos celulares Purkinje da camada molecular que também recebem entrada de fibras de escalada que se originaram na azeitona inferior. As células purkinje enviam projeções inibitórias para as células nos núcleos cerebelares profundos (DCN), que serve como a principal saída do cerebelo. A saída deste circuito cerebelar é ainda mais modulada pela atividade dos interneurônios inibitórios no córtex cerebelar, incluindo Golgi, stellate e células cesta⁴. Esta unidade funcional cerebelar é distribuída por todos os lobules do córtex cerebelar. Apesar deste circuito relativamente uniforme em todo o cerebelo, evidências da literatura de neuroimagem humana e estudos de pacientes indicam heterogeneidade funcional do cerebelo^6,7.

O córtex cerebelar pode ser dividido em duas regiões principais: os vermis definidos pela linha média e os hemisférios laterais. Os vermis podem ser ainda divididos em lobulos anteriores e posteriores. Essas regiões distintas do cerebelo foram implicadas em contribuir para diferentes comportamentos. Padrões de atividade evocados por tarefas ou sem tarefas implicaram que as regiões anteriores dos vermis contribuem mais para a função motora, enquanto vermis posteriores contribuem mais para a cognição^6,7. Os vermis também estão ligados ao afeto e às emoções, enquanto os hemisférios cerebelares contribuem para funções executivas, visuais-espaciais, linguísticas e outras funções mnemônicas⁸. Além disso, estudos anatômicos forneceram evidências de que regiões cerebelares funcionalmente distintas estão conectadas com diferentes regiões corticais⁹. O mapeamento de lesões-sintomas revelou que pacientes com derrames que afetam os lobulos anteriores (estendendo-se ao lobule VI) apresentaram pior desempenho em tarefas motoras finas, enquanto pacientes com danos em regiões posteriores do lobo e hemisférios apresentaram déficits cognitivos na ausência da síndrome motor cerebelar¹⁰. Por fim, a patologia cerebelar regional em doença indica que as regiões cerebelares funcionalmente distintas também são diferentemente suscetíveis à doença^11,12.

Embora muito menos exploradas, evidências preliminares demonstram distintas assinaturas de expressão genética em regiões corticais cerebelares. A expressão celular purkinje de Zebrin II mostra a padronização específica da região nos vermímis de tal forma que há mais células positivas zebrin II nos lobulos posteriores e menos nos lobulos anteriores¹³. Isso também se correlaciona com a função fisiológica regionalmente distinta, pois as células Purkinje negativas zebrin II apresentam maior frequência de disparo tônico do que as células Purkinje que são Zebrin II positiva¹⁴.

Além do córtex cerebelar, o cerebelo inclui os núcleos cerebelares profundos (DCN) que servem como a saída primária para o cerebelo. Os núcleos são compostos pelos núcleos medial (MN), interposto (IN) e núcleos laterais (LN). Imagens funcionais e estudos de pacientes demonstraram que o DCN também participa de vários comportamentos¹⁵, mas pouquíssimos estudos examinam a mudança da expressão genética no DCN.

Os avanços nas técnicas moleculares permitiram avaliar a expressão genética regional no cérebro e descobriram a heterogeneidade em diferentes regiões cerebrais nos estados fisiológicos e de^{doenças 16}. Tais estudos implicam que o cerebelo é diferente de outras regiões cerebrais. Por exemplo, a proporção de neurônios para células gliais é invertida no cerebelo em comparação com outras regiões cerebrais¹. Mesmo em condições fisiológicas normais, a expressão de genes proinflamatórios é regulada no cerebelo em comparação com as outras regiões cerebrais¹⁷. Técnicas moleculares também têm sido muito úteis na identificação dos caminhos que contribuem para a patogênese das doenças cerebelares. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de todos os extratos cerebelares identificou genes alterados em um modelo de rato transgênico específico da célula Purkinje de ataxia spinocerebellar tipo 1 (SCA1) em comparação com seus controles de tipo selvagem. Tais evidências revelaram as principais vias moleculares subjacentes à patogênese nas células cerebelares Purkinje e ajudaram a identificar potenciais alvos terapêuticos¹⁸. No entanto, estudos recentes sugerem que há diferenças na vulnerabilidade às doenças nas regiões cerebelares^11,12,19. Isso pode indicar que há mudanças-chave ocorrendo em regiões cerebelares distintas, que podem ser mascaradas ou não detectadas com extratos cerebelares inteiros. Assim, é necessário desenvolver técnicas que permitam aos pesquisadores examinar perfis moleculares em diferentes regiões cerebelares.

A técnica aqui proposta descreve um método reprodutível para dissecar quatro regiões distintas do cerebelo do camundongo, a fim de isolar o RNA dessas regiões e explorar diferenças regionais na expressão genética. O esquema do cerebelo do rato na Figura 1A destaca os vermísis em azul, e hemisférios em amarelo. Especificamente, esta técnica permite isolar quatro regiões: núcleos cerebelares profundos (DCN) (caixas pontilhadas vermelhas na Figura 1A), o córtex cerebelar de vermis anterior (CCaV) (azul escuro em Figura 1A), o córtex cerebelar dos vermis posteriores (CCpV) (azul claro na Figura 1A), e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH) (amarelo na Figura 1A). Ao avaliar a expressão genética dessas regiões separadamente, será possível investigar mecanismos moleculares subjacentes a funções discretas dessas diferentes regiões, bem como potenciais diferenças em sua vulnerabilidade na doença.

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Protocolo

1. Configuração

1. Reúna os equipamentos necessários, incluindo tesouras de decapitação, fórceps contundentes, tesoura de dissecção, tesoura vascular, microspatula, matriz cerebral do rato sagitário, lâminas de barbear, 200 pontas de tubulação de μL, placa de petri de vidro, lâmina de vidro e balde de gelo. Coloque todos os equipamentos em uma almofada absorvente.
2. Coloque placa de petri, placa de vidro e matriz cerebral no gelo.
3. Usando uma lâmina de barbear em um ângulo perpendicular, corte cerca de 5 mm da ponta de uma ponta de tubulação de 200 μL. Isso faz com que o tamanho da abertura no final da ponta de cerca de 1 mm de largura. Isso deve ser suficiente para socar o DCN. Mas isso também pode ser ajustado conforme necessário, dependendo da dissecção. Tenha muitas dicas prontas para fácil substituição e ajuste.
4. Rotular tubos de microfuça de 1,5 mL com identificação animal e região cerebelar (quatro tubos por animal).
5. Encha o recipiente de cryosafe com nitrogênio líquido para congelar o tecido após a extração.

2. Extração e dissecção cerebral

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Comitês de Cuidados Com Animais da Universidade de Minnesota.

1. Eutanize o mouse usando 5% de exposição ao CO_2. Uma vez que a respiração tenha cessado, realize a luxação cervical. Decapite o rato com a tesoura de decapitação e descarte a carcaça no recipiente apropriado.
2. Faça uma incisão com uma lâmina de barbear ao longo da linha sagital medial da cabeça começando pelo nariz e continuando todo o caminho de volta. Separe a pele, separando-se para ambos os lados da linha média. Use a lâmina de barbear para cortar o músculo de cada lado, cortando os canais auditivos.
3. Usando uma tesoura dissecando, corte todas as regiões da medula espinhal, até onde o tronco cerebral encontra o cerebelo, cuidado para não danificar o cerebelo.
4. Insira uma das lâminas vasculares da tesoura no espaço entre o tronco cerebral e a coluna vertebral e corte em direção ao canal auditivo, levantando-se sobre a tesoura para cortar o osso limpamente, mas limitar danos ao tecido.
5. Continue cortando ao longo da borda do crânio em direção às lâmpadas olfativas, continuando a levantar-se enquanto corta para limitar danos ao tecido cerebral.
6. Usando os fórceps contundentes, retire suavemente a parte de trás do crânio descobrindo a região posterior do cérebro e do cerebelo.
7. Usando os fórceps contundentes ao longo da borda do crânio que foi apenas cortado, descasque o resto do crânio para cima e sobre o cérebro. Esta etapa deve remover a maior parte da tampa do crânio, revelando o cérebro.
8. Corte o resto do crânio com a tesoura vascular e fórceps contundentes, limpando a maior parte do crânio do topo do cérebro.
9. Usando a microspatula, levante o cérebro ligeiramente e colher para baixo e deslize para cima para remover as lâmpadas olfativas do crânio restante e desconectar fibras do trato óptico. O cérebro deve sair livre facilmente neste momento.
10. Coloque o cérebro na placa de petri sentada no gelo e remova qualquer crânio restante ou outros detritos.
11. Usando a microspatula, coloque suavemente o cérebro na matriz cerebral com o lado dorsal para cima. Leve tempo para ter certeza de que está definido nível na matriz, especialmente que a linha média cai no centro da matriz. Esta matriz é projetada para tecido cerebral de camundongos adultos, tecido de animais mais jovens ou doentes pode ficar mais baixo na matriz, mas ainda deve ser possível alcançar resultados reprodutíveis entre as amostras.
12. Coloque uma lâmina de barbear ao longo da linha média sagital, certificando-se de que a lâmina empurra todo o caminho até a parte inferior da matriz(Figura 1B).
13. Coloque outra lâmina de barbear 1 mm ao lado da primeira lâmina(Figura 1B). Coloque mais duas lâminas 1 mm de distância uma da outra. O resultado final deve ser três lâminas colocadas em um lado do cérebro, todas com 1mm de distância. Faça o mesmo com o outro lado. No total, 7 lâminas serão colocadas 1mm de distância(Figura 1C).
14. Com cuidado, pegue as extremidades dianteira e traseira das lâminas de barbear e levante para fora da matriz. O tecido do lado de fora das lâminas de barbear pode ser descartado.
15. Lentamente, separe uma lâmina de barbear de cada vez das outras, tomando cuidado para não danificar as seções teciduais.
16. Deslize cuidadosamente a seção de tecido para fora da lâmina de barbear e sobre a lâmina de vidro com a microspatula. No total, haverá seis seções cerebrais sagiais(Figura 1D).
17. As 4 seções mais laterais terão DCN visível (caixa roxa, Figura 1D). Para isolar o DCN, segure a ponta de tubulação de 200 μL aparada perpendicularmente sobre o DCN e empurre para baixo através do tecido firmemente, balançando em todas as direções para dissecar totalmente o DCN do tecido circundante. Levante-se para cima para remover o DCN de forma limpa e confirme visualmente a presença do tecido na ponta.
18. Coloque um dedo na parte superior da ponta e empurre para baixo, fazendo com que o tecido se avolua. Coloque a ponta no tubo de microfuça corretamente rotulado e certifique-se de que o ponche de tecido seja colocado na parte inferior do tubo. Repita 2.17 para as três seções restantes, colocando os socos DCN no mesmo tubo. Coloque o tubo em nitrogênio líquido para congelar. Representação do tamanho de cada soco na Figura 1E.
19. Seções que tiveram DCN extraída se qualificam como hemisfério cerebelar. Afaste o resto do tecido cerebral ao redor do cerebelo nestas seções. Use fórceps contundentes e pegue suavemente essas seções de córtex cerebelares do hemisfério e coloque em seu respectivo tubo de microfuge. Congelamento de flash.
20. Para as duas últimas seções vermais (caixa azul claro, Figure1D), afaste o tecido cerebral circundante deixando apenas o cerebelo. Usando uma lâmina de barbear, faça um corte separando os lobulos anteriores dos lobos posteriores. O corte deve ser logo após a formação do lobule 6 e não deve incluir lobule 10 (Figura 1F).
21. Usando fórceps contundentes, coloque cuidadosamente as seções anteriores do córtex cerebelar e as seções posteriores do córtex cerebelar em seus respectivos tubos de microfuge e congele os flashes deixando os tubos em nitrogênio líquido por 5 minutos. Daqui vá para a extração do RNA, ou pode armazenar os tubos a -80 °C.

3. Extração de RNA

NOTA: Este protocolo é modificado a partir do Protocolo cold spring harbor para extração de RNA com TRIzol²⁰. TRIzol solubiliza material biológico, possibilitando a extração de RNA.

1. Coloque os tubos de microfuge no gelo para evitar que o tecido descongele muito rapidamente, aplique 150 μL de TRIzol frio no tubo de microfuge. Homogeneize-se com um pilão esterilizado. Uma vez homogeneizado o tecido, encotime a solução para cima e para baixo para garantir que não haja tecido restante intacto. Cada vez mais quebre qualquer pequeno pedaço de tecido puxando-o para cima em uma seringa de insulina algumas vezes.
2. Adicione mais 350 μL de TRIzol e pipet para cima e para baixo para misturar bem. Deixe descansar na temperatura da sala por 5 minutos.
3. Adicione 150 μL de clorofórmio ao tubo e agite vigorosamente e deixe descansar por 2-3 minutos. O clorofórmio separa a solução de tecido homogeneizado em fases (RNA, DNA e proteína).
4. Centrifugar a 12.000 x g, a 15°C, por 10 minutos. Certifique-se de que todos os tubos estão na mesma orientação.
5. Remova cuidadosamente os tubos e coloque a temperatura da centrífuga para 4°C. Remova apenas a fase aquosa clara em um novo tubo (este é o RNA), cuidado para não interromper a interfase opaca (o DNA).  A fase mais baixa será vermelha e contém proteína. A solução restante nos tubos pode ser salva ou descartada.
6. Adicione 100% de álcool isopropílico a uma proporção de 1:2 (se removido 200 ul de fase aquosa, adicione 100 μL de álcool isopropílico). Misture bem por pipetting para cima e para baixo. Deixe descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. O álcool isopropílico precipita o RNA fora de solução.
7. Centrifugar a 12.000 x g, a 4°C, por 10 minutos. Certifique-se de colocar todos os tubos na mesma orientação para facilitar a visualização da pelota. A pelota resultante será o RNA extraído.
8. Remova cuidadosamente os tubos, remova o sobrenante com uma pipeta tomando cuidado para não interromper a pelota. A pelota é um pouco parecida com gel e será difícil de ver, mas deve ser capaz de estimar onde ela é baseada na orientação dos tubos na centrífuga.
9. Depois de remover todo o supernascido, adicione 500 μL de 75% de etanol, vórtice brevemente, e centrífuga a 7500 x g, a 4°C, por 5 minutos. O etanol lava ainda mais a pelota.
10. Remova o supernatante cuidadosamente, sem interromper a pelota. Deixe as tampas abertas para secar a amostra. Isso geralmente leva de 5 a 10 minutos, mas pode variar dependendo de quanto etanol foi deixado na pelota. Não seque demais.
11. Uma vez seco, resuspenque a pelota em dNase água livre. Adicione 20 μL às amostras para DCN e 30 μL para todas as outras.
12. Uma vez resuspended, as amostras podem ser armazenadas a -80 °C ou proceder para novos testes.

4. Reação quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real (RTqPCR)

1. Antes desta etapa será necessário dNase tratar o RNA para remover qualquer DNA genômico, e gerar cDNA utilizando iScript da BioRad. Certifique-se de normalizar a concentração de RNA antes de fazer o cDNA. Além disso, é importante otimizar primers para qPCR. Siga os métodos descritos aqui para completar esta etapa²¹. Breve descrição do qPCR abaixo.
2. Os primers são todos comprados do IDT. As sequências dianteiras e inversas estão no mesmo tubo de amostra e armazenadas na concentração de 20x.
   Rps18 (gene de controle):
   Avanço – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
   Reverso – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
   Parvalbumina (proteína de ligação de cálcio, células inibitórias):
   Atacante – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
   Reverso – '5-AGCGTCTTTTTCTTTAGCAG-3'
   KCNG4 (subunidade do canal de potássio):
   Atacante – 5'-CTGTCTCTCTCTGGTCAGTGA-3'
   Reverso – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
   Aldolase C (Zebrin II, expressa diferencialmente através do córtex cerebelar):
   Atacante – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
   Reverso – 5'-TCAGTAGGGGTTGGC-3'
3. qPCR condições foram as seguintes. Período de pré-incubação, 5 minutos, a 95°C. Período de amplificação, 50 ciclos: 10 minutos a 95°C, 10 minutos a 62°C e 10 minutos a 72°C. Período de curva de fusão, 5 segundos a 95°C, um minuto a 65°C, e definir a taxa de rampa para 0,07°C/segundo até a temperatura-alvo de 97°C. Em seguida, período de resfriamento por 10 minutos a 40°C.  Todas as reações qPCR foram realizadas em triplicado e a expressão genética foi analisada utilizando-se 2^{- ΔΔCt} com Rps18 como um controle de carga para normalizar a expressão genética. Extrato cerebelar a granel foi usado como referência.

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Resultados

Para esses experimentos, foram utilizados quatro camundongos fêmeas de onze semanas de idade, tipo C57/Black6. Um rato foi usado para realizar uma dissecção cerebelar completa que é referida como "cerebelo a granel" e permitiu a comparação dos níveis de RNA em regiões dissecadas a uma dissecção completa. Os outros três camundongos foram usados para conduzir a dissecção cerebelar descrita neste protocolo. O uso de três camundongos torna possível garantir que as tendências d...

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Discussão

O método descrito aqui permite avaliar a expressão genética subjacente e os mecanismos moleculares dentro de quatro regiões cerebelares distintas – os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar anterior dos vermis (CCaV), o córtex cerebelar posterior dos vermis (CCPV) e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH). A capacidade de avaliar essas regiões separadamente ampliará nosso conhecimento da heterogeneidade de regiões cerebelares específicas e possivelmente lançará luz sobre sua contribuiç...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors