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Resumo

Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

Resumo

O processamento de mRNA envolve múltiplas etapas simultâneas para preparar o mRNA para tradução, como 5'capping, adição poli-A e emenda. Além do emendamento constitutivo, o emendamento alternativo de mRNA permite a expressão de proteínas multifuncionais de um gene. Como os estudos interactome são geralmente a primeira análise para proteínas novas ou desconhecidas, a associação da proteína isca com fatores de emenda é uma indicação de que ela pode participar do processo de emenda mRNA, mas determinar em que contexto ou quais genes são regulados é um processo empírico. Um bom ponto de partida para avaliar esta função é usar a ferramenta minigene clássica. Aqui apresentamos o uso de minigene Adenoviral E1A para avaliar as mudanças alternativas de emenda após diferentes estímulos de estresse celular. Avaliamos o splicing de minigene E1A em HEK293 exprimidamente superexpressando proteína Nek4 após diferentes tratamentos de estresse. O protocolo inclui transfecção de minigene E1A, tratamento celular, extração de RNA e síntese de CDNA, seguido de análise de PCR e gel e quantificação das variantes emendadas E1A. O uso deste método simples e bem estabelecido combinado com tratamentos específicos é um ponto de partida confiável para lançar luz sobre processos celulares ou quais genes podem ser regulados por emendas mRNA.

Introdução

O splicing está entre os passos mais importantes no processamento de mRNA eucariótico que ocorre simultaneamente ao capping de 5'mRNA e à poliadenilação de 3'mRNA, compreendendo a remoção de intron seguido de junção exon. O reconhecimento dos locais de emenda (SS) pelo emendatório, um complexo ribonucleoproteíno contendo pequenas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 e U6), pequenas RNAs (snRNAs) e várias proteínas regulatórias1 é necessário para emendas.

Além da remoção intron (emendas constitutivas), em eucariotes, os introns podem ser retidos e os exons podem ser excluídos, configurando o processo chamado emenda alternativa mRNA (AS). A emenda pré-mRNA alternativa expande a capacidade de codificação de genomas eucarióticos permitindo a produção de um grande e diversificado número de proteínas de um número relativamente pequeno de genes. Estima-se que 95-100% dos mRNAs humanos que contêm mais de um exon podem passar por emendas alternativas2,3. Isso é fundamental para processos biológicos como desenvolvimento neuronal, ativação da apoptose e resposta ao estresse celular4,fornecendo ao organismo alternativas para regular o funcionamento celular usando o mesmo repertório de genes.

O maquinário necessário para emendas alternativas é o mesmo utilizado para emendas constitutivas e o uso da SS é o principal determinante para a ocorrência alternativa de emendas. O splicing constitutivo está relacionado ao uso de locais de emenda forte, que geralmente são mais semelhantes aos motivos de consenso para o reconhecimento deemendas 5.

Exons alternativos são tipicamente reconhecidos de forma menos eficiente do que os exons constitutivos uma vez que seus elementos cis-regulatórios,as sequências em 5'SS e 3'SS flanqueando esses exons, mostram uma capacidade de ligação inferior ao emendatório. O mRNA também contém regiões denominadas enhancers ou silenciadores localizados em exons (aprimoramentos de emendas exônicas (ESEs) e silenciadores de emenda exônica (ESSs)) e introns (aprimoramentos de emendas intrônicas (ISEs) e silenciadores de emenda intrônica (ISSs)) que melhoram ou reprimem o uso de exon,respectivamente 5. Essas sequências são reconhecidas por elementos trans-regulatórios, ou fatores de emenda (SF). As SFs são representadas principalmente por duas famílias de proteínas, os fatores de emenda rico em serina/arginina (SRSFs) que se ligam aos ESEs e à família de ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas (hnRNPs) que se ligam às sequências de ESSs5.

O splicing alternativo pode ser modulado por fosforilação/desfosforilação de trans-fatores que modificam os parceiros de interações e localização celular dos fatores de emenda6,7,8. Identificar novos reguladores de fatores de emenda podem fornecer novas ferramentas para regular o splicing e, consequentemente, alguns tratamentos contra o câncer.

Anufrieva et al.9, em um perfil de expressão genética de microarray mRNA, observaram mudanças consistentes nos níveis de componentes spliceossômicos em 101 linhas celulares e após diferentes condições de estresse (drogas à base de platina, irradiação gama, inibidores de topoisomerase, inibidores de quinase tyrosina e impostos). A relação entre padrão de emenda e eficácia da quimioterapia já foi demonstrada em células cancerígenas de pulmão, que são resistentes à quimioterapia, mostrando alterações na taxa de variantes caspase-910. As células HEK293 tratadas com o painel de quimioterapia mostram mudanças no splicing com um aumento nas variantes pró-apoptóticas. Gabriel et al.11 observaram alterações em pelo menos 700 eventos de emenda após o tratamento de cisplatina em diferentes linhas celulares, apontando que as vias de emenda são afetadas pela cisplatina. Moduladores de emenda já demonstraram atividade anti-tumoral, mostrando que o splicing é importante para o desenvolvimento tumoral e, principalmente, a resposta à quimioterapia12. Por isso, caracterizar novas proteínas que regulam o splicing após agentes estressores celulares, como a quimioterapia, é muito importante para descobrir novas estratégias de tratamento.

As pistas de regulação alternativa de emendas a partir de estudos interactome, particularmente importantes para caracterizar funções de proteínas novas ou não caracterizadas, podem exigir uma abordagem mais geral e simples para verificar o real papel da proteína em AS. Minigenes são ferramentas importantes para a análise do papel geral de uma proteína que afeta a regulação do splicing. Eles contêm segmentos de um gene de interesse contendo regiões genômicas emendadas e flanqueadas13. O uso de uma ferramenta minigene permite a análise do splicing in vivo com diversas vantagens, como o comprimento do minigene que é menor e, portanto, não é uma limitação à reação de amplificação; o mesmo minigene pode ser avaliado em diferentes linhas celulares; todos os componentes celulares, principalmente sua regulação da modificação pós-translacional (fosforilação e alterações nos compartimentos celulares) estão presentes e podem ser abordados13,14. Além disso, mudanças no padrão alternativo de emenda podem ser observadas após o estresse celular e, o uso de um sistema minigene, permitem identificar a via que está sendo modulada por diferentes estímulos.

Existem vários sistemas de minigene já descritos que são específicos para diferentes tipos de eventos de emenda13,14, no entanto, como um ensaio preliminar, o minigene E1A15 é um sistema de repórteres alternativo muito bem estabelecido para o estudo da seleção de 5 SS in vivo. De apenas um gene, E1A, cinco mRNAs são produzidos por emenda alternativa com base na seleção de três diferentes locais de emenda de 5′ e de um local de emenda maior ou um menor de 3′16,17,18. A expressão das variantes E1A muda de acordo com o período de infecção adenoviral19,20.

Já mostramos anteriormente que tanto os isoformes nek4 interagem com fatores de emenda como SRSF1 e hnRNPA1 e, embora a isoforme 2 mude o emendamento alternativo minigene E1A, o isoforme 1 não tem efeito nesse21. Como o isoforme 1 é a isóforme mais abundante e altera a resistência à quimioterapia e a resposta a danos no DNA, avaliamos se ele poderia mudar a emenda alternativa minigene E1A em uma condição de estresse.

O ensaio minigene é um método simples, de baixo custo e rápido, uma vez que só precisa de extração de RNA, síntese de CDNA, amplificação e análises de gel de agarose, e pode ser uma ferramenta útil para avaliar, uma vez que um possível efeito sobre a emenda alternativa por uma proteína de interesses até o efeito de diferentes tratamentos no padrão de emenda alternativa celular.

Protocolo

1. Células de chapeamento

NOTA: Neste protocolo descrito, foram utilizadas linhas de células estáveis HEK293, anteriormente geradas para expressão indutível estável de Nek421, porém, o mesmo protocolo é adequado para muitas outras linhas celulares, tais como HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. O padrão de expressão dos isoformes minigene E1A em condições basais varia entre essas células e deve ser caracterizado para cada condição. Este protocolo não se limita a linhas de células estáveis. A abordagem mais comum na avaliação da proteína candidata é pela co-transfecção transitória de aumentar sua quantidade com quantidade fixa do minigene. O mesmo protocolo é adequado para células eliminatórias.

  1. Células de placa considerando controles de veículos, não transtraídos e GFP.
  2. Cultura HEK293 células com expressão estável do gene de interesse no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 4,5 g/L de glicose, 4 mM L-Glutamina e manter com 100 μg/mL de higimicincina B, em placas tratadas com cultura tecidual a 37 °C em 5% DE CO2 e atmosfera umidificada.
  3. Células divididas usando 0,25% de trippsina-EDTA. Placa 3 x 105 células em placas de 6 poços e incuba-las por 24 h a 37 °C em 5% DE CO2.
    NOTA: Para a transfecção, as células devem ser 70-80% confluentes para diminuir a morte celular após a transfecção.

2. Transfecção celular

NOTA: 1-2 μg de pMTE1A minigene plasmid foi usado aqui, porém a quantidade de DNA, bem como o tempo de expressão, deve ser mantida no mínimo para evitar a toxicidade. Por exemplo, alta toxicidade foi observada em células HeLa após 30h de transfecção com 1 μg de DNA pMTE1A. Para a transfecção aqui descrita, foi usado um reagente de transfecção à base de lipídio

  1. Verifique a confluência celular 24 h após o revestimento e transfecte células estáveis HEK293 somente quando 70-80% confluentes.
  2. Remova o meio de cultura celular cuidadosamente com uma pipeta, em vez de usar um sistema de bomba de vácuo. Em seguida, adicione cuidadosamente 2 mL de meio DMEM completo sem antibióticos e coloque a placa de volta na incubadora.
  3. Prepare um tubo com o tampão de transfecção (200 μL/well), adicione 2 μg de DNA pMTE1A, vórtice e adicione 2 μL de reagente de transfecção. Vórtice novamente e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
  4. Retire as placas da incubadora e adicione cuidadosamente a mistura de transfecção dropwise.
  5. Às células estáveis HEK293, adicione tetraciclina (0,5 μg/mL) para indução de expressão de Nek4 6 h após a transfecção. Mudanças médias não são necessárias.
    NOTA: Os volumes/quantidades descritos nesta seção são para um bem. Prepare a mistura para todos os poços utilizados no experimento no mesmo tubo.
  6. Prepare um poço para transfectar com eGFP, ou outro fluorforeiro expressando plasmídeo para estimar a eficiência de transfecção. Melhores resultados podem ser observados com eficiência de transfecção de pelo menos 40%, mas foram observados bons desempenhos com menor eficiência de transfecção.
  7. Ao usar a co-transfecção (proteína de interesse e minigene) mantenha um poço com células não transfectadas para evitar obter resultados de mRNA endógeno. No caso do E1A, as células HEK293 já expressam o gene E1A30.

3. Preparando as drogas

NOTA: O tempo e a concentração do tratamento foram escolhidos com base nos resultados da literatura, que apontam mudanças no splicing alternativo para alguns genes.

  1. Realize uma curva dose-resposta antes de iniciar o ensaio para determinar a concentração mínima para indução alternativa de emenda sem efeito na viabilidade celular.
  2. Prepare uma solução de estoque paclitaxel a 5 mM de concentração de etanol. A concentração final é de 1 μM. Mantenha-se a -20 °C. Use 0,02% de etanol como controle de veículos.
  3. Prepare uma solução de cisplatina diluindo em 0,9% NaCl em torno de 0,5 mg/mL (1,66 mM). Proteja contra luz, vórtice e incubar em um banho térmico, 37 °C por 30 min. A concentração final é de 30 μM. Prepare fresco ou armazene a 2-10 °C por até um mês.
    NOTA: Todas as drogas devem ser protegidas da luz.

4. Tratamento e coleta celular

NOTA: As células estáveis HEK293 foram coletadas 48 h após a transfecção e para isso foram tratadas 24h após a transfecção porque o maior nível de expressão nek4 é alcançado dentro de 48 h. No entanto, foram observados níveis elevados de expressão isoforme 13S (até 90%) neste momento. Para diminuir a proporção de isoforme 13S, tente tratar e coletar células 30 h após o máximo de transfecção.

  1. Use dicas e tubos gratuitos RNA/DNase. Realize a extração total de RNA com reagente fenol-clorofórmio seguindo a recomendação do fabricante.
  2. 24 h após a transfecção, verifique a morfologia celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio fluorescente.
  3. Remova o meio de cultura celular, usando preferencialmente uma pipeta em vez de um sistema de bomba de vácuo. Em seguida, adicione o meio de cultura celular com a quimioterápico na concentração final descrita anteriormente.
  4. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 para 18 - 24 h.
  5. Colete RNA descartando o meio de cultura celular em um recipiente e adicionando 0,5 - 1 mL de reagente de extração de RNA diretamente ao poço. Se os poços forem muito confluentes, use 1 mL de reagente de extração de RNA para melhorar a qualidade do RNA.
  6. Homogeneize-se com a pipeta e transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado armazenando amostras a -80 °C ou prosseguir imediatamente para a extração de RNA.
    ATENÇÃO: O reagente de extração de RNA à base de fenol é tóxico e todos os procedimentos devem ser realizados em uma capa de fumaça química e os resíduos descartados corretamente.

5. Extração de RNA e síntese de CDNA

  1. Em um capô de fumaça descongele as amostras e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Adicione 0,1 -0,2 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente.
  2. Incubar por 3 minutos em temperatura ambiente.
  3. Centrifugar por 15 min a 12.000 x g e 4 °C.
  4. Colete a fase aquosa superior e transfira para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL. Coletar cerca de 60% do volume total; no entanto, não coletar o DNA ou a fase orgânica (inferior).
  5. Adicione 0,25 - 0,5 mL de isopropanol e agitar pela inversão 4 vezes. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
  6. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min, a 4 °C e descartar o supernaspe.
  7. Lave a pelota de RNA duas vezes com etanol (75% em água tratada com dietilpirato (DEPC). Centrifugar a 7.500 x g por 5 min e descartar o etanol.
  8. Remova o excesso de etanol invertendo o tubo em um papel toalha e deixe o tubo aberto dentro de um capô de fumaça para secar parcialmente a pelota por 5 - 10 min.
  9. Resuspend a pelota de RNA em 15 μL de água tratada com DEPC.
  10. Quantifique o RNA total usando absorvância em 230 nm, 260 nm e 280 nm para verificar a qualidade do RNA.
  11. Para verificar a qualidade total do RNA, execute um gel de 1% de agarose pré-tratado com 1,2% (v/v) de uma solução de hipoclorito de sódio de 2,5% por 30 min31.
  12. Realize a síntese de CDNA usando 1-2 μg de RNA total.
    1. Pipeta RNA, 1 μL de oligo-dT (50 μM), 1 μL de dNTP (10 mM) e compõem o volume a 12 μL com água livre de nuclease. Incubar no termociclador por 5 min a 65 °C.
    2. Remova amostras do termocicl para esfriar e prepare a mistura de reação: 4 μL de tampão de transcriptase reversa, 2 μL de dithiothreitol (DTT) e 1 μL de inibidor de ribonuclease. Incubar a 37 °C por 2 min.
    3. Adicione 1 μL de transcriptase reversa termoestabilidade. Incubar a 37 °C por 50 min e inativar a enzima a 70 °C por 15 min.
      NOTA: O cDNA pode ser armazenado a -20 °C por várias semanas. Realize um controle de transcriptase não reversa (NRT) para contaminação genômica por discriminação de eventos putativos de retenção de intron.

6. pMTE1A minigene PCR

  1. Execute o PCR com a composição de reação (1,5 mM de MgCl2, 0,3 mM de mix dNTP, 0,5 μM de cada primer, 2,5 U de uma polimerase Taq de partida quente e 150 ng de cDNA) com as seguintes condições:
    94 °C por 2 min, 29 ciclos de: 94 °C para 1 min, 50 °C para 2 min, 72 °C para 2 min, 72 °C para 10 min.
  2. Carregar 20-25 μL do produto PCR em um gel de 3% de agarose contendo mancha de ácido nucleico e funcionar a 100 V por aproximadamente 1 h.

7. Análise do gel utilizando um software de processamento e análise de imagem32

  1. Após a execução, fotografe o gel (usando um sistema de aquisição de imagens de gel) evitando qualquer saturação de banda e quantifique as bandas usando um software de processamento de imagem.
  2. Para quantificação considere as bandas em ~631 bp, ~493 bp, e ~156 bp para corresponder aos isoforms 13S, 12S e 9S, respectivamente.
  3. No menu Arquivo do software, abra o arquivo de imagem obtido do sistema de aquisição de imagens. Converta-se em escala de cinza, ajuste o brilho e o contraste e remova o ruído mais estranho, se necessário.
  4. Desenhe um retângulo ao redor da primeira faixa com a ferramenta Seleção de Retângulo e selecione-o através da | Géis | Selecione o comando First Lane ou pressionando o atalho do teclado para ele.
  5. Use o mouse para clicar e segurar no meio do retângulo na primeira pista e arrastá-lo para a próxima pista. Vá para Analisar | Géis | Selecione Next Laneou pressione o atalho disponível. Repita este passo para todas as faixas restantes.
  6. Depois de todas as faixas serem destacadas e numeradas, vá para Analisar | Géis | Plot Lanes para desenhar um enredo de perfil de cada pista.
  7. Com a ferramenta de seleção de linha reta, desenhe uma linha através da base de cada pico correspondente a cada banda, deixando de fora o ruído de fundo. Depois de todos os picos, de todas as pistas, foi fechado, selecione a ferramenta Varinha e clique dentro de cada pico. Para cada pico que destacou, as medidas devem aparecer na janela Resultados que aparece.
  8. Soma a intensidade de todas as 3 bandas para cada amostra e calcule a porcentagem de cada isoforme em relação ao total.
  9. Plote as porcentagens de cada isoforme ou as diferenças na porcentagem em relação às amostras não tratadas.
    NOTA: Certifique-se de que a soma das três variantes E1A deve ser igual a 100%.

Resultados

Um ensaio de 5' locais de emenda utilizando minigene E1A foi realizado para avaliar mudanças no perfil de emenda nas células após a exposição da quimioterapia. O papel de Nek4 - isoform 1 na regulação AS em células estáveis HEK293 após o tratamento paclitaxel ou cisplatina foi avaliado.

A região Adenoviral E1A é responsável pela produção de três mRNAs principais de um precursor de RNA devido ao uso de diferentes ...

Discussão

Minigenes são ferramentas importantes para determinar os efeitos no splicing alternativo global in vivo. O minigene adenoviral E1A tem sido usado com sucesso há décadas para avaliar o papel das proteínas, aumentando a quantidade delas na célula13,14. Aqui, propomos o uso de minigene E1A para avaliar emendas alternativas após exposição quimioterápica. Uma linha de célula estável expressando isoforme Nek4 1 foi usada, evitando os artefatos de superexpres...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por meio do Grant Temático 2017/03489-1 ao JK e à bolsa da FLB 2018/05350-3) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) para financiar essa pesquisa. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Adrian Krainer por fornecer o plasmídeo pMTE1A e Zerler e colegas por seu trabalho na clonagem E1A. Agradecemos também ao Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti e Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller para permitir que usem seu espaço de laboratório e equipamentos.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 pb DNA LadderInvitrogen15628-050
6 wells plateSarstedt833920
AgaroseSigmaA9539-250G
CisplatinSigmaP4394
DEPC waterThermoFisherAM9920
DMEMThermoFisher11965118
dNTP mixThermoFisher10297-018
Fetal Bovine Serum - FBSThermoFisher12657029
Fluorescent MicroscopeLeicaDMIL LED FLUO
Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin SystemBio-Rad
GFP - pEGFPC3Clontech
HEK293 stable cells - HEK293 Flp-InGenerated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21
Hygromycin BThermoFisher10687010Used for Flp-In cells maintenemant
Image processing and analysis software - FIJI softwareref. 32
Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus ReagentPolyplus117-07
Oligo DTThermoFisher18418020
PaclitxelInvitrogenP3456
Plate Reader/ UV absorbanceBiotechEpoch Biotek/ Take3 adapter
pMTE1A plasmidProvided by Dr. Adrian Krainer
pMTE1A FInvitrogen 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A RInvitrogen5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’
Refrigerated centrifugeEppendorfF5810R
Reverse Transcriptase - M-MLVThermoFisher28025013
Reverse transcriptase - Superscript IVThermoFisher18090050
Ribunuclease inhibitor RNAse OUTThermoFisher10777-019
RNA extraction phenol-chloroform based reagent - TrizolThermoFisher15596018
SybrSafe DNA gel stainThermoFisherS33102
Taq PlatinumThermo10966026
TetracyclinSigmaT3383Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction
Thermocycler Bio-RadBio-RadT100
TrypsinSigmaT4799

Referências

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