Quadruplicar-Checkerboard: Uma modificação do tabuleiro de xadrez tridimensional para estudar combinações de medicamentos

Resumo

Este protocolo descreve como estudar todas as combinações possíveis que podem ser obtidas entre quatro drogas em um único experimento. Este método baseia-se no ensaio padrão de micro diluição de placas de 96 poços e no cálculo de concentrações inibitórias fracionárias (FICs) para avaliar os resultados.

Resumo

O conceito de terapia de combinação de drogas está se tornando muito importante principalmente com o aumento drástico da resistência às drogas. O tabuleiro de xadrez Quádruplo, também chamado de Q-checkerboard, visa maximizar o número de combinações possíveis que podem ser obtidas entre quatro drogas em um experimento para minimizar o tempo e o trabalho necessários para alcançar os mesmos resultados com outros protocolos. Este protocolo baseia-se na simples técnica de micro diluição onde as drogas são diluídas e combinadas em várias placas de 96 poços.

No primeiro conjunto de placas de 96 poços, o caldo Muller-Hinton é adicionado seguido pela primeira droga necessária (por exemplo, Cefotaxime aqui) para diluí-lo em série. Após o primeiro passo, outro conjunto de placas de 96 poços é usado para diluir a segunda droga (por exemplo, Amikaci), que será transferida removendo um volume específico de droga 2 e colocada nos poços correspondentes no primeiro conjunto de placas de 96 poços que contém uma droga. O terceiro passo é feito adicionando as concentrações necessárias da terceira droga (por exemplo, Levofloxacin), às placas apropriadas no conjunto inicial contendo combinação de droga 1 e 2. O quarto passo é feito adicionando as concentrações necessárias da quarta droga (por exemplo, Trimethoprim-sulfamethoxazol) nas placas apropriadas no primeiro conjunto. Em seguida, o inóculo bacteriano E. coli ESBL será preparado e adicionado.

Este método é importante para avaliar todas as combinações possíveis e tem uma gama mais ampla de possibilidades a serem testadas além para testes in vivo. Apesar de ser uma técnica cansativa que requer muito foco, os resultados são notáveis e economizam tempo onde muitas combinações podem ser testadas em um único experimento.

Introdução

Com o aumento da resistência devido ao uso excessivo e uso indevido de antibióticos^1,2, a necessidade de desenvolver novos medicamentos e agentes para tratar infecções bacterianas tornou-se crucial. Novas abordagens como o desenvolvimento de novas drogas são muito importantes para superar a crise de resistência. No entanto, a indústria farmacêutica não está interessada em desenvolver novos agentes antimicrobianos. Além disso, se novas drogas forem desenvolvidas, as bactérias continuarão evoluindo e desenvolvendo resistência contra essas novas drogas^3,4. Assim, o problema de resistência não será resolvido, tornando a necessidade de outra abordagem uma obrigação que deve ser considerada e estudada para superar a resistência bacteriana.

A combinação de medicamentos é um conceito muito importante para o tratamento de infecções bacterianas principalmente aquelas causadas por patógenos resistentes a multidroga^5,6. Diminui o curso do tratamento, diminui a dose dada; assim, a diminuição da toxicidade da determinada droga, ajuda a diminuir a taxa de desenvolvimento de resistência e, de certa forma, sensibiliza a bactéria aos medicamentos fornecidos como descrito no conceito de sensibilidade colateral^5,7,8,9.

O desenvolvimento da resistência a uma droga requer uma única mutação; no entanto, o desenvolvimento da resistência a uma combinação de drogas que visam múltiplas vias requer várias mutações independentes que são por essa combinação. Um exemplo para a diminuição da resistência ao usar a terapia combinada é a diminuição da taxa de resistência ao Rifampin no Mycobacterium Tuberculosis¹⁰. Outro exemplo é um estudo feito por Gribble et al. que mostrou que a taxa de surgimento de cepas resistentes em pacientes que tomam Piperacillin sozinha para ser maior do que naquelas que tomam uma combinação de carboxipenicilina e aminoglycoside¹⁰. Estudos têm demonstrado que o desenvolvimento da resistência aos aminoglicosídeos em bactérias em evolução tornou essas cepas sensíveis a várias outras drogas⁵. A combinação entre a amoxicilina da droga classe beta-lactam e o ácido clavulanic inibidor de lactamase mostrou sucesso no tratamento de cepas bacterianas resistentes⁸.

Diminuir o tempo de tratamento é uma boa vantagem resultante de combinações de medicamentos. Por exemplo, uma terapia de penicilina combinada ou ceftriaxona com gentamicina por 2 semanas dará a mesma eficácia dada apenas por penicilina ou ceftriaxona quando dada apenas por 4 semanas¹¹. A combinação de medicamentos permite o uso de doses mais baixas de drogas que não são eficazes quando dadas sozinhas, como os Sub-MICs. O exemplo de sulfonamidas pode ser dado quando o uso de sulfonamidas triplas minimiza, em doses mais baixas, a toxicidade produzida que é a formação de cristais ou cristalizatória ao usar sulfonamidas insolúveis em doses completas¹².

Assim, a diminuição da dosagem dada e o tempo de tratamento acabarão por diminuir a toxicidade das drogas no corpo. A ideia de desenvolver métodos para avaliar a interação entre drogas combinadas é muito importante. Em um estudo, os resultados mostraram que a terapia combinada é mais eficaz para o tratamento de espécies resistentes de Acinetobacter e P. aeruginosa⁸.

Dando drogas em combinação
Existem diferentes métodos pelos quais podemos estudar combinações de medicamentos, como o método de tabuleiro de xadrez, o método de curva de morte de tempo e o método de teste E¹³. O método de checkerboard pode estudar todas as combinações possíveis entre as duas drogas em questão em um experimento em si. Além disso, foi desenvolvido para estudar uma combinação de três fármacos¹⁴. Agora, estendemos isso para estudar uma combinação de quatro drogas principalmente para o tratamento de patógenos multidroga resistentes.

O ensaio da curva de morte de tempo é geralmente realizado para testar o efeito bactericida de uma determinada droga. Também foi usado para testar o efeito de combinações de drogas onde várias drogas são combinadas em concentrações específicas. Este protocolo requer a preparação de vários tubos ou copos estéreis onde em cada xícara adicionamos o caldo, a combinação de drogas e a cepa bacteriana necessária. Após a incubação e registro da densidade óptica em vários pontos de tempo, os resultados são comparados com a taxa de crescimento normal da cepa utilizada para ver se a taxa de crescimento aumentou, diminuiu ou não mudou¹³.

O método de teste eletrônico é geralmente feito para testar a concentração inibitória mínima (MIC) onde uma tira contendo uma concentração gradiente da droga em questão é colocada em uma placa inoculada. Também foi usado para testar a combinação entre duas drogas onde duas tiras são adicionadas à placa de forma perpendicular cruzando seus MICs¹³.

Segundo a literatura, não há padrão-ouro para definir e estudar sinergia; assim, é difícil avaliar qual dos métodos utilizados para estudar a combinação é melhor e qual produz resultados melhores e mais confiáveis principalmente¹³. No entanto, o ensaio de morte por tempo é intensivo em trabalho, demorado e caro^15,16, enquanto o método de teste eletrônico é desenvolvido para estudar uma combinação entre apenas duas drogas. O Checkerboard pode estudar todas as combinações possíveis entre as duas drogas testadas e é por isso que esta técnica foi escolhida para ser desenvolvida.

Protocolo

1. Etapas de preparação

1. Prepare o caldo Muller-Hinton (MHB) adicionando 25 g de caldo MH a 1 L de água destilada e misture. Autoclave a 121 °C por 2,5 h. Em seguida, armazene a mídia autoclaved em temperatura ambiente ou na geladeira.
2. Subcultura as bactérias em questão (E. coli ESBL) na mídia ágar usando o método de listras de quatro quadrantes e incubar durante a noite a 37 °C.
   1. Usando um laço estéril, pegue uma colônia e espalhe-a na primeira metade da placa de ágar MacConkey fazendo listras paralelas próximas.
   2. Usando o laço, espalhe a bactéria no segundo quadrante, listrando-a do primeiro quadrante.
   3. A partir do segundo quadrante, estenda as raias no terceiro quadrante usando faixas paralelas próximas.
   4. Espalhe a bactéria no centro do quarto quadrante, espalhando-a do terceiro quadrante.

2. Preparação do painel

1. Coloque quatro placas de 96 poços um ao lado do outro para formar um quadrado. Usando uma fita, grave a bunda deles juntos.
2. Repita esta etapa para obter quatro painéis cada um contendo 4 placas e nomeie-os A1, A2, A3 e A4.
3. Adicione 50 μL de caldo MH aos poços entre a coluna 2 e a coluna 11 nas 16 placas de 96 poços dos quatro painéis.
4. Adicione 200 μL de caldo MH ao poço H12 servindo como o bem de controle negativo nas 16 placas de 96 poços dos quatro painéis.
5. Adicione 150 μL de caldo MH aos poços A1 e H1 servindo como poços de controle positivos nas 16 placas de 96 poços dos quatro painéis.

3. Droga 1, Cefotaxime, diluição em série

1. A um tubo cônico, adicione 15 mL de dH₂O estéril.
   1. Calcule o volume a ser removido da solução de estoque da droga seguindo a fórmula C₁V₁ = C₂V₂. Assim, V₁ = (C₂ x 15 mL) / C₁.
      NOTA: No nosso caso, a solução de estoque cefotaxime é de 10⁵ μg/mL e C₂ é de 256 μg/mL; assim, V₁ = 38,4 μL.
2. Remova o volume calculado dos 15 mL de dH₂O estéril e adicione a droga.
3. Pipeta 50 μL da solução de droga preparada em cada poço na coluna 11 e coluna 12 exceto H12.
4. Inicie a diluição seriada removendo 50 μL da coluna 11 e colocando-a nos poços correspondentes na coluna 10 e, em seguida, de 10 até chegar à coluna 2, onde os 50 μL retirados da coluna 2 serão descartados.
5. Repita as etapas 3.4 e 3.5 para todas as 16 placas de 96 poços dos quatro painéis.

4. Droga 2, Amkacina, diluição em série

1. A um tubo cônico, adicione 10 mL de dH₂O estéril.
2. Calcule o volume a ser removido da solução de estoque da droga seguindo a fórmula C₁V₁ = C₂V₂. Assim, V₁ = (C₂ x 10 mL) / C₁.
   NOTA: No nosso caso, a solução de estoque amikacin é de 10³ μg/mL e C₂ é de 64 μg/mL; assim, V₁ = 64 μL.
3. Remova o volume calculado dos 10 mL de dH₂O estéril e adicione a droga.
4. Pegue oito placas separadas de 96 poços.
5. A cada placa, adicione 100 μL de MHB aos poços entre as linhas G e B.
6. Adicione 100 μL da solução de droga 2 previamente preparada aos poços da linha G.
7. Diluir serialmente da linha G para a linha B, tomando 100 μL de cada poço e finalmente descartar os 100 μL dos poços da linha B.
8. Repita as etapas 4.5, 4.6 e 4.7 para preparar oito placas.

5. Transferência da droga 2 para os quatro painéis

1. Pipeta 50 μL de droga 2 dos poços entre as linhas G e B para os poços correspondentes em cada placa nos quatro painéis. Uma placa preparada de 96 poços contém 100 μL de droga 2 que é suficiente para duas placas em um painel.

6. Droga 3, Levofloxacina, adição

1. A quatro tubos cônicos diferentes, adicione 14 mL de dH₂O estéril.
2. Calcule o volume a ser removido da solução de estoque da droga seguindo a fórmula C₁V₁ = C₂V₂. Assim, V₁ = (C₂ x 14 mL) / C₁.
   NOTA: No nosso caso, levofloxacina é preparada em quatro concentrações diferentes de uma solução de estoque de 5 x 10³ μg/mL.
   C₁ = 2 μg/mL, V₁ = 5,6 μL
   C₂ = 4 μg/mL, V₁ = 11,2 μL
   C₃ = 8 μg/mL, V₁ = 22,4 μL
   C₄ = 16 μg/mL, V₁ = 44,8 μL
3. Remova o volume calculado dos 14 mL de dH₂O estéril de cada tubo e, em seguida, adicione a droga.
4. Após preparar as concentrações necessárias da terceira droga, tome 50 μL e adicione-a aos poços correspondentes entre as linhas B e G e as colunas 2 e 12 na placa correspondente em cada painel onde C1 corresponde às quatro placas P1 nos quatro painéis, C2 corresponde às quatro placas P2 nos quatro painéis , C3 corresponde às quatro placas P3 nos quatro painéis, e C4 corresponde às quatro placas P4 nos quatro painéis.

7. Droga 4, Trimethoprim-sulfametoxazol, adição

1. A um tubo cônico, adicione 14 mL de dH₂O estéril.
2. Calcule o volume a ser removido da solução de estoque da droga seguindo a fórmula C₁V₁ = C₂V₂. Assim, V₁ = (C₂ x 14 mL) / C₁.
   NOTA: No nosso caso, trimethoprim-sulfametoxazol é preparado em quatro concentrações diferentes de uma solução de estoque de 48 x 10³ μg/mL.
   C₁ = 512 μg/mL, V₁ = 149,33 μL
   C₂ = 1024 μg/mL, V₁ = 298,66 μL
   C₃ = 2048 μg/mL, V₁ = 597,33 μL
   C₄ = 4096 μg/mL, V₁ = 1 194,66 μL
3. Remova o volume calculado dos 14 mL de dH₂O estéril de cada tubo e, em seguida, adicione a droga.
4. Após preparar as concentrações necessárias da quarta droga, tome 50 μL e adicione-a aos poços correspondentes entre as linhas B e G e as colunas 2 e 12 nas quatro placas no painel correspondente onde C1 corresponde ao painel 1, C2 corresponde ao painel 2, C3 corresponde ao painel 3, e C4 corresponde ao painel 4.

8. Preparação e adição de inóculo bacteriano E. coli ESBL

1. Usando um laço estéril, transfira uma colônia do isolado bacteriano E. coli ESBL previamente cultivado em uma placa em 2 mL de MHB e vórtice e vórtice.
2. Verifique se há turbidez onde deve ser 0,5 McFarland usando um densitômetro.
3. Adicione 80 mL de caldo MH estéril a um copo de urina estéril.
4. Adicione o inóculo bacteriano do 0,5 McFarland inóculo ao copo de urina seguindo C₁V₁ = C₂V₂, onde V₁ = (10⁶ x 80 mL) / 10⁸ = 800 μL.
5. Pipeta 50 μL da solução inóculo 10⁶ UFC/mL em cada poço, exceto H12, que é o bem de controle de esterilidade.
6. Incubar os painéis a 37 °C durante a noite.
7. Após a incubação, adicione 50 μL de Iodotetrazolium para registrar o crescimento dos poços.

9. Protocolo para o modelo FIC (Arquivo Suplementar)

1. Escreva a maior concentração de droga 1 (Cefotaxime) na célula amarela no painel A.
2. Escreva a maior concentração de droga 2 (Amikacina) na célula amarela no painel B.
3. Escreva a maior concentração de droga 3 (Levofloxacina) na célula amarela no painel C.
4. Escreva a maior concentração de droga 4 (Trimethoprim-sulfametoxazol) no painel D.
5. Trace a Linha Vermelha (interface Growth/no Growth) destacando os poços com crescimento em vermelho.
6. Escreva o MIC da droga 1 na tabela da droga 1 (ATB1).
7. Escreva o MIC da droga 2 na tabela da droga 2 (ATB2).
8. Escreva o MIC da droga 3 na tabela da droga 3 (ATB3).
9. Escreva o MIC da droga 4 na tabela da droga 4 (ATB4).
10. Para calcular FIC para ATB1
    1. Determine os poços na interface Crescimento/sem Crescimento.
    2. Na tabela ATB1, clique duas vezes na célula ao lado do FIC1 e arraste a célula amarela à esquerda do painel A para o primeiro bem selecionado.
    3. Repita o passo 9.10.2 para cada poço selecionado onde bem 1 corresponde ao FIC1, bem 2 corresponde ao FIC2, e assim por diante.
11. Para calcular o FIC para ATB2
    1. Na tabela ATB2, clique duas vezes na célula ao lado do FIC1 e arraste a célula amarela à esquerda do painel B para o primeiro poço pré-selecionado.
    2. Repita o passo 9.11.1 para cada poço pré-selecionado.
12. Para calcular o FIC para ATB3
    1. Na tabela ATB3, clique duas vezes na célula ao lado do FIC1 e arraste a célula amarela à esquerda do painel C para o primeiro poço pré-selecionado.
    2. Repita o passo 9.12.1 para cada poço pré-selecionado.
13. Para calcular o FIC para ATB4
    1. Na tabela ATB4, clique duas vezes na célula ao lado do FIC1 e arraste a célula amarela à esquerda do painel D para o primeiro poço pré-selecionado.
    2. Repita o passo 9.13.1 para cada poço pré-selecionado.
14. Na tabela rotulada ATB1+2+3+4, soma automaticamente o FIC1 de cada ATB. O mesmo ocorrerá para as outras FICs (FIC2, FIC3, e assim por diante).
    1. Na célula que contém FIC e destacada em amarelo, clique duas vezes nele e selecione os ΣFICs somados da tabela ATB1+2+3+4.
15. Repita estes passos para cada uma das nove folhas representando as nove placas.
    NOTA: Na folha FIC tudo, a tabela mostrará o FIC somado final com a interpretação do valor obtido.

10. Determinação mic usando o ensaio de microdiluição para as quatro drogas

1. Rotule quatro linhas diferentes com a abreviação de cada droga testada. Por exemplo, CTX para Cefotaxime, AMK para Amikacin, LEVO para Levofloxacin e SXT para Trimethoprim-sulfametoxazol.
2. Pipeta 200 μL de caldo Muller Hinton estéril em bem número 1 e bem número 12 em cada linha usada. Bem, o número 12 servirá como o controle negativo bem.
3. Pipeta 100 μL de caldo Muller Hinton estéril para os poços 2 a 11 em cada linha usada.
4. Calcule o volume de cada droga a ser adicionada usando a fórmula C₁V₁ = C₂V₂. Assim, V₁ = (C₂ x 4 x V₂) / C₁. V₂ é o volume final nos poços que é de 200 μL, C₁ é a concentração da solução de estoque, e C₂ é a concentração inicial que precisamos ter no primeiro poço.
   NOTA: Aqui, usamos o seguinte:
   Cefotaxime: C₁ = 10⁵ μg/mL, onde o diluímos para 10⁴ μg/mL, C₂ = 256 μg/mL; assim, V₁ = 20,48 μL
   Amikacina: C₁ = 10³ μg/mL, C₂ = 64 μg/mL; assim, V₁ = 51,2 μL
   Levofloxacina: C₁ = 5 x 10³ μg/mL, onde o diluímos para 5 x 10² μg/mL, C₂ = 16 μg/mL; assim, V₁ = 25,6 μL
   Trimetópa-Sulfametoxazol: C₁ = 48 x 10³ μg/mL, C₂ = 4096 μg/mL; assim, V₁ = 68,26 μL
5. Pipeta o volume necessário para cada droga no primeiro poço da linha correspondente depois de remover o mesmo volume do caldo de 200 μL para obter um volume total de 200 μL após a adição da droga.
6. Diluir serialmente removendo 100 μL do poço 1 para o poço 2 e assim por diante até chegar bem 10 onde os 100 μL removidos do poço 10 serão descartados. Note que bem 11 serve como o controle positivo bem.
7. Pipeta 100 μL de 10⁶ inóculo bacteriano preparado em cada poço em cada linha usada, exceto para o bem número 12 servindo como o controle negativo.
8. Incubar a 37 °C durante a noite.

Resultados

A Figura 2A representa os resultados obtidos pela combinação de Cefotaxime e Amikacin com concentrações específicas de Levofloxacina e Trimetoprim-sulfametoxazol. Podemos ver na parte esquerda da figura as quatro placas que são esquemáticamente apresentadas com as concentrações das drogas na parte direita da figura. As setas representam os poços na interface Crescimento/sem Crescimento. Os poços coloridos são os poços que contêm crescimento. Notamos que a quarta placa não cont...

Discussão

O método De checkerboard quádruplo se assemelha ao tabuleiro de xadrez e ao tabuleiro de damas tridimensional em seu protocolo. No entanto, certas medidas cruciais devem ser tomadas em consideração para evitar erros durante o experimento.

Certifique-se de testar para o MIC de cada droga contra o isolado testado antes de iniciar o protocolo para saber quais são as concentrações necessárias para iniciar as diluições com a droga 1 e a droga 2 que precisam ser diluídas em série nas pla...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL tips	Citotest	4330000402
200 µL tips	Citotest	4330-0013-17
50 mL centrifuge tube	corning	430828	For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube	Falcon	352058	For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes	JRZ Plastilab		As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates	corning	3596	For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole	By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France	10177403	Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain	Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon		Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar	BIO-RAD	64169508	For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Muller-Hinton Broth	BIO-RAD	69444	For making bacterial media
Multichannel Pipette	Thermo Scientific	GJ54761	For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)	sanofi aventis	221937/2009	Drug 3