Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

Resumo

O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Resumo

À medida que a pandemia COVID-19 causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) continua a evoluir, tornou-se evidente que a presença de anticorpos neutralizantes contra o vírus pode fornecer proteção contra infecções futuras. Assim, à medida que a criação e tradução de vacinas eficazes COVID-19 continua em uma velocidade sem precedentes, o desenvolvimento de métodos rápidos e eficazes para medir anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 se tornará cada vez mais importante para determinar a proteção a longo prazo contra infecções para indivíduos previamente infectados e imunizados. Este artigo descreve um protocolo de alto rendimento usando o vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipado com a proteína de pico SARS-CoV-2 para medir a presença de anticorpos neutralizantes em soro convalescente de pacientes que se recuperaram recentemente do COVID-19. O uso de um vírus pseudotipado replicante elimina a necessidade de uma instalação de nível 3 de contenção necessária para o manuseio sars-cov-2, tornando este protocolo acessível a praticamente qualquer laboratório nível de contenção 2. O uso de um formato de 96 poços permite que muitas amostras sejam executadas ao mesmo tempo com um curto tempo de retorno de 24 horas.

Introdução

Em dezembro de 2019, foi identificado um novo coronavírus, que hoje conhecemos como SARS-CoV-2, o agente causador da doença coronavírus 2019 (COVID-19)¹. SARS-CoV-2 é um betacoronavírus pertencente à família Coronaviridae. Esses vírus envoltos compreendem um genoma de RNA de grande senso positivo e são responsáveis por infecções respiratórias e intestinais em humanos e animais². Até maio de 2021, foram registrados mais de 157 milhões de casos notificados de COVID-19 globalmente e mais de 3,2 milhões de mortes³. O desenvolvimento de uma vacina eficaz tornou-se o objetivo principal de pesqu....

Protocolo

1. Células de chapeamento (Dia 1) para a produção e quantificação do pseudovírus SARS-CoV-2

1. Preparação para a cultura tecidual
   1. Salina Fosfato-Tampão-Tampão de Dulbecco (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (opcional); e 0,25% de ácido tetraáctico de tripca-etilenodiamina (EDTA) a 37 °C em banho-maria por aproximadamente 15 minutos.
   2. Desinfete uma capa de cultura tecidual com 70% de etanol, e coloque pratos de cultura tecidual, pipetas pasteur e pipetas sorológicas na capa da cultura tecidual conforme necessário. Remova PBS, DMEM e trypsin do banho de água, e de....

Resultados

Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para detectar anticorpos neutralizantes contra a proteína SARS-CoV-2 S através da inibição da infecção por pseudovírus VSV-S-eGFP (quantificável pela perda de focos eGFP detectados). Uma representação esquemática do protocolo é retratada na Figura 1. Recomenda-se que um anticorpo comercialmente disponível seja usado como um controle positivo cada vez que o ensaio é executado para garantir a consistência do ensaio. Aqui, demon.......

Discussão

O método aqui descrito pode ser adaptado para atender a diferentes ambientes e recursos de laboratório, conforme necessário. É importante ressaltar que a principal limitação deste protocolo é a necessidade de um espaço de contenção nível 2 e uma capa de cultura tecidual. A aplicação de um vírus RNA replicante pseudotipado com o pico SARS-CoV-2, como VSV-S-eGFP, é uma alternativa formidável ao vírus SARS-CoV-2, que requer uma área de trabalho nível 3 de contenção, mas pode permanecer uma limitação p.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco)	Fisher scientific	LS25200114
ArrayScan VTI HCS	Thermo Fisher Scientific		Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose	Sigma	C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV
HEPES	Fisher scientific	BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse)	Thermo Fisher Scientific	31903
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab	SinoBiological	40592-MM57
Vero E6 cells	ATCC	CRL-1586