Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

Resumo

Vesículos extracelulares (EVs) contribuem para a biologia celular e comunicações intercelulares. Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de EVs pelas células. O protocolo atual propõe o ensaio de absorção de EV utilizando imagens de fluorescência tridimensional através de microscopia confocal, após o isolamento do EV por um dispositivo microfluido baseado em nanofilição.

Resumo

Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de vesícula extracelular (EV) das células. A captação de EV desempenha um papel na comunicação intercelular em diversas áreas de pesquisa; biologia do câncer, neurociência e entrega de drogas. Muitos ensaios de absorção de EV foram relatados na literatura; no entanto, há uma falta de metodologia experimental prática e detalhada. A absorção de EV pode ser avaliada rotulando fluorescentemente EVs para detectar sua localização dentro das células. A distinção entre EVs internalizados nas células e os EVs superficiais nas células é difícil, mas crítica, determinar com precisão a absorção de EV. Portanto, um ensaio que quantifica eficientemente a absorção de EV através de microscopia de fluorescência tridimensional (3D) é proposto neste trabalho. Os EVs fluorescentes foram preparados usando um dispositivo microfluido baseado em nanofiliação, visualizado por microscopia confocal 3D e, em seguida, analisados através de software avançado de processamento de imagem. O protocolo fornece uma metodologia robusta para a análise de EVs em nível celular e uma abordagem prática para uma análise eficiente.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs) são partículas nano-dimensionadas e ligadas à membrana lipídica que são categorizadas por seus tamanhos: ectosomos (100-500 nm) e exosósmos (50-150 nm)¹. Os EVs contêm várias biomoléculas, como proteínas, ácidos nucleicos e lipídios. Essas biomoléculas originam-se das células antes de serem encapsuladas como carga e liberadas no espaço extracelular via EVs1,2,3.

Devido à variedade de sua carga, acredita-se que os EVs desempenham um papel ativo na comunicação intercelular. A liberação e absorção de EVs por células permitem a transferência de biomoléculas entre as ^células4,5. A introdução da carga EV em uma célula pode alterar as funções da célula receptora e o estado homeostático4,5,6. Os EVs são internalizados através de múltiplas vias; no entanto, os mecanismos exatos não foram demonstrados com precisão.

A maioria dos ensaios de absorção de EV, como a marcação genética, rotulam fluorescentemente ^EVs7 individuais. O sinal resultante pode ser medido por fotômetro de microplatograma, citometria de fluxo ou microscopia, com cada tecnologia tendo limitações substanciais. Os fotômetros de microplape, a citometria de fluxo ou a microscopia bidimensional padrão (2D) não podem distinguir entre ^EVs8,9 internalizados e superficialmente ligados. Além disso, a preparação necessária da amostra para cada uma dessas técnicas pode introduzir problemas adicionais à avaliação de absorção de EV. Por exemplo, o levantamento de células aderidas com trippsina antes da análise de absorção do EV pode cortar alguns EVs superficialmente ligados na superfície da ^célula10,11. A trippsina também pode interagir com a superfície celular, afetando o fenótipo celular e EV. Além disso, a trippsina pode não desaprender eVs superficiais inteiramente, distorcendo populações isoladas.

Para rotular com precisão os EVs com corantes fluorescentes, são necessárias etapas adicionais de lavagem para remover o corante ^residual7. Técnicas de isolamento aceitas também podem contribuir para sinais falso-positivos devido à coagulação que ocorre durante o isolamento do EV. Por exemplo, a ultracentrifugação serial (UC) é amplamente usada para isolar EVs e remover o corante imobilizado. No entanto, a UC pode co-precipitar EVs, e o corante residual pode levar a um sinal ^{falso-positivo12,13}. Outros métodos de nano-filtração, como filtração baseada em coluna, também são amplamente utilizados para a remoção de corantes não imobilizados. A natureza complexa dos EVs e da interação de corantes dentro da matriz da coluna pode levar à remoção incompleta do corante residual devido ao corte molecular da coluna ser alterado pelo complexo insumo14,15,16.

O protocolo atual propõe um dispositivo microfluido à base de nano-filtração para isolar e lavar EVs isolados fluorescentes. O dispositivo microfluido baseado em nano-filtração pode fornecer filtração eficiente através da tecnologia de separação assistida por fluidos (FAST)^17,18. O FAST reduz a queda de pressão através do filtro, reduzindo assim a agregação potencial entre EVs e corantes. Ao remover eficientemente o corante residual, é possível melhorar a qualidade dos EVs rotulados fluorescentes e a especificidade do ensaio.

A microscopia confocal pode distinguir entre EVs internalizados e superficialmente ligados na superfície celular e investigar de forma abrangente os mecanismos celulares de absorção de EV em uma resolução espacial19,20,21,22,23,24,25. Por exemplo, Sung et al. descreveram a visualização do ciclo de vida exossomo usando seu repórter desenvolvido ao vivo. A localização dos EVs internalizados foi detectada e analisada utilizando um microscópio confocal em ferramentas de processamento de três dimensões (3D) e ^{pós-imagem20}. Embora o tamanho dos pequenos EVs (40-200 nm) esteja abaixo do limite de resolução do microscópio óptico, os EVs rotulados fluorescentemente podem ser detectados por microscopia confocal, uma vez que o fotodetetor pode detectar a emissão de fluorescência aprimorada. Portanto, a localização subcelular dos EVs fluorescentes rotulados dentro de uma célula pode ser precisamente determinada adquirindo múltiplas imagens empilhadas de z dos EVs e das organelas celulares circundantes.

Além disso, a reconstrução 3D e o processamento pós-dados podem fornecer mais informações sobre o posicionamento dos EVs internalizados, superficiais e flutuantes. Ao utilizar esses processos em conjunto com as imagens de células vivas de lapso de tempo oferecidas pela microscopia confocal, o nível de absorção de EV pode ser avaliado com precisão, e o rastreamento em tempo real da captação de EV também é possível. Além disso, a análise do tráfico de EV pode ser realizada por meio de microscopia confocal, avaliando a co-localização de EVs com organelas, um primeiro passo para determinar como os EVs internalizados estão envolvidos na função intracelular. Este protocolo descreve a metodologia para a realização de um ensaio de absorção de EV usando o dispositivo microfluido baseado em ^{nanofiliação17,26}, microscopia confocal e análise pós-imagem.

Protocolo

1. Isolamento de EV e rotulagem EV imuno-fluorescente on-chip

1. Coleta de mídia de cultura celular (CCM) e pré-processamento de CCM para isolamento de EV
   1. Células de semente PC3 a 30% de confluência em um frasco de cultura celular de 75 ^cm2 . Permitir que as células de controle cresçam até 90% de confluência (~48 h) em mídia padrão e suplementos específicos de linha celular.
      NOTA: Para evitar que os componentes contendo EV afetem a captação celular (ou seja, soro bovino fetal), use mídia e suplementos exososome-esgotados.
   2. Colhe o CCM.
   3. Centrifugar o CCM a 1000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente (RT) para pelotar quaisquer células nãoectadas e grandes detritos colhidos com a mídia. Transfira o supernatante para um novo tubo cônico.
   4. No novo tubo, centrifugar o supernante a 10.000 x g por 20 min a 4 °C para pelotar detritos menores e corpos apoptóticos permanecendo na mídia. Alguns EVs maiores vão de pelotas. Transfira o supernatante para um novo tubo.
   5. Filtre o supernascer através de um filtro de seringa de membrana polivinylidene hidrofílica de 0,45 μm (PVDF).
      NOTA: Se não processar imediatamente o CCM para isolamento EV, armazene o CCM pré-processado a -80 °C até que o isolamento seja realizado. Se congelado, limite os ciclos de congelamento a um.
2. Isolamento eV do CCM usando um dispositivo microfluido baseado em nano-filtração
   1. Se congelado, descongele completamente o CCM e o vórtice por 30 s antes do passo 1.2.2.
   2. Injete 1 mL de CCM pré-processado (etapa 1.1) na câmara amostral do dispositivo microfluido baseado em nano-filtração (ver Tabela de Materiais)^17,26.
      NOTA: Siga o procedimento operacional padrão para o dispositivo microfluido baseado em nano-filtração17,26.
   3. Gire a 3000 rpm por 10 min na máquina giratória de bancada (ver Tabela de Materiais) para operar o dispositivo microfluido.
      NOTA: Se o CCM permanecer na câmara de amostra após a execução inicial, realize giros adicionais até que todos os CCM sejam esvaziados da câmara de amostra.
   4. Retire o fluido da câmara de resíduos por pipetação e repita as etapas 1.2.1, 1.2.2 e 1.2.3 duas vezes.
      NOTA: No total, 3 mL de CCM serão processados para isolamento de EV.
   5. Injete 1 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) na câmara de amostra para lavar os EVs isolados. Gire na máquina de fiação de bancada para operar o dispositivo microfluido, conforme mencionado na etapa 1.2.3. Localize os EVs puros na membrana do dispositivo.
      NOTA: A qualidade dos EVs isolados do dispositivo microfluido baseado em nano-filtração, especificamente, foi confirmada e comparada ao método convencional de UC por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscópio eletrônico de varredura (SEM), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), microscopia de iluminação estruturada, ensaio imunossorbente ligado à enzima e PCR em tempo real na pesquisa ^{anterior17,26}.
3. Rotulagem imunofluorescente de EV usando dispositivo microfluido baseado em nano-filtração (Figura 1)
   1. Selecione um anticorpo específico do EV de acordo com a finalidade do ensaio (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Certos anticorpos podem interferir em locais de ligação de ligantes específicos para vias de absorção de EV (ou seja, endocitose).
   2. Injete 1 μg/mL do anticorpo específico do EV no orifício de eluição do dispositivo contendo 100 μL de EVs isolados.
   3. Incubar por 1h no escuro em RT em um agitador de placa para garantir a distribuição uniforme do anticorpo através da amostra.
   4. Conecte uma fita adesiva ao orifício de eluição. Injete 1 mL PBS na câmara de amostra para lavar qualquer anticorpo residual.
   5. Gire o dispositivo a 3000 rpm até que a câmara de amostra esteja vazia. Remova qualquer fluido da câmara de resíduos por pipetação. Injete 1 mL PBS na câmara de amostra.
      NOTA: Os EVs fluorescentes rotulados estarão localizados na câmara de membrana.
   6. Pipeta os EVs fluorescentes rotulados (Figura 2) da câmara de membrana para um tubo âmbar. Bloqueie a luz até usar.

2. Incubação das células com EVs fluorescentes rotulados para o ensaio de absorção de EV

1. Semeadura de células-alvo e cultura nos pratos compatíveis com cultura celular.
   1. Semente 1 x ¹⁰⁴ células PC3 na placa de microslide 8-well (9,4 x 10,7 mm para cada poço) com 0,2 mL de mídia ou 4 x ¹⁰⁴ células PC3 em um prato de 35 mm com 1 mL de mídia. Coloque as células em um prato compatível com a cultura celular que consiste em uma fina mancha de cobertura (espessura: 0,18 mm).
      NOTA: O deslizamento fino minimiza a dispersão adversa da luz.
   2. Permitir que as células aderam durante a noite em condições ideais de cultura celular (37 °C, 5% de concentração de _CO2 , 90% de umidade).
   3. Lavar células aderidas duas vezes com mídia exossome-esgotado (descrita na etapa 1.1.1).
2. Incubação celular com EVs fluorescentes rotulados.
   1. Meça a concentração de EVs fluorescentes (etapa 1.3.5) por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA, Figura Suplementar 1). Determine a concentração ideal de EVs fluorescentes rotulados a serem adicionados às células cultivadas (passo 2.1.2.).
   2. Diluir os EVs fluorescentes com mídia exosome-esgotada para corresponder à concentração desejada medida na etapa 2.2.1. (i.e., 7,80 x ¹⁰⁹ EVs (no valor NTA) em 200 μL de mídia exossome-despoada.)
   3. Adicione os EVs diluídos (Passo 2.2.2) às células-alvo aderidas preparadas em 2.1.2. Incubar para o tempo experimental (ou seja, 4, 8 ou 12 h).
   4. Lave as células três vezes com mídia livre de exosomos para remover quaisquer EVs não internalizados.
      NOTA: Opcional: As células podem ser fixadas após a lavagem.
   5. Rotule o citoplasma das células aderidas com 1 μg/mL de CMTMR ((5-(e-6)-((((4-clororomilo)benzoilo)amino) tetrametilrhodamina) (ver Tabela de Materiais) e incubar em condições ideais de cultura celular (37 °C, 5% de concentração de _CO2 , 90% de umidade).
      NOTA: Os corantes da área celular devem fluorescer separadamente dos EVs rotulados para ajudar na determinação da localização espacial (internalizada ou superficial) dos EVs cravados durante o ensaio de absorção de EV.
   6. Lave as células rotuladas duas vezes com mídia exososome-esgotada para remover o corante residual. Adicione novas mídias exossomee esgotadas às células em preparação para imagens confocal de células vivas.

3. Microscopia confocal

1. Para realizar imagens de células vivas, utilize uma incubadora no palco para manter as condições ideais de cultura celular (37 °C, 5% de concentração de _CO2 , 90% de umidade).
2. Coloque as células preparadas na incubadora do palco.
3. Defina os parâmetros de imagem baseados em amostras de controle.
   NOTA: As amostras de controle sugeridas incluem: Somente EVs rotulados fluorescentes, células fluorescentes rotuladas, EVs sem rótulo e células sem rótulo.
4. Determine a profundidade das células-alvo e a faixa de tamanho de empilhamento na direção z para adquirir imagens confocal 3D.
   NOTA: A espessura de uma pilha Z é de 1 μm. A aquisição de imagens 3D confocal durou 2 min 34 s (cada aquisição de imagem de plano Z levou aproximadamente 8 s; um total de vinte imagens de pilha Z).
5. Defina a aquisição de imagens empilhadas por múltiplos z de corante específico para células (ou seja, vermelho) e corante específico de EV (ou seja, verde) simultaneamente (Figura 3 e Figura 4A).

4. Processamento de imagens

1. Utilize o software automático de processamento de imagens para analisar as imagens confocal empilhadas em Z e determinar a absorção de EV por células (ver Tabela de Materiais).
2. Defina parâmetros de limiar para o sinal fluorescente das células e corantes específicos do EV. Construir as superfícies virtuais das células (Figura 4A,B).
   1. Para construir as superfícies virtuais das células, clique no botão Adicionar novas superfícies.
   2. Selecione o cálculo de distância mais curta como "Configurações de algoritmo" para usar o algoritmo fornecido pelo software e clique em Next: Source Channel.
   3. Selecione o Canal 2 - CMTMR como "Canal de Origem" neste experimento.
   4. Selecione Smooth e coloque o valor apropriado em "Superfícies Detalhadas" para suavização da superfície.
      NOTA: 0,57 μm neste experimento, uma vez que 1 pixel representa 0,57 μm em dados de imagem bruta.
   5. Selecione Intensidade Absoluta como "Limiar".
   6. Para limiar automaticamente da imagem fluorescente pelo algoritmo fornecido, clique em Limiar (Intensidade Absoluta): O valor é definido automaticamente.
   7. Selecione Habilitar como "Dividir objetos de toque (Região crescente)" e colocar o valor do tamanho estimado da célula em "Diâmetro de pontos de semente", 10,0 μm neste experimento. Em seguida, clique em Seguinte: Filtrar pontos de sementes.
   8. Para configurar as superfícies de células virtuais, clique em + Adicionar botão e selecione Qualidade como "Tipo de filtro". Limite o valor apropriado (210 neste experimento) para o limite baixo por uma inspeção visual e o valor máximo (1485) para o limite superior e clique no botão Concluir .
      NOTA: Uma inspeção visual significa que um pesquisador pode discriminar a área celular a partir de uma imagem fluorescente crua.
   9. Em seguida, para construir os pontos virtuais dos EVs, clique no botão Adicionar novos pontos.
   10. Selecione Diferentes tamanhos de ponto (crescimento da região) e cálculo de distância mais curta como "Configurações de algoritmo", em seguida, clique em Seguinte: Canal de origem.
   11. Selecione o Canal 1 - Alexa Fluor 488 como "Canal fonte" neste experimento.
   12. Coloque o valor apropriado em "Diâmetro XY Estimado" para a detecção de manchas, 1 μm neste experimento. Em seguida, clique em Seguinte: Filtrar pontos.
   13. Para configurar os pontos EV virtuais, clique + Adicionar botão, selecione Qualidade como "Tipo de Filtro" e defina "Limite Inferior" por uma inspeção visual, 100 neste experimento. Em seguida, clique no botão Seguinte: Localizar o tipo de região .
   14. Selecione Intensidade Absoluta como "Tipo de Regiões Spot", em seguida, clique em Seguinte: Regiões spot.
   15. Para limiar, a região de pontos EV, colocou o valor apropriado em "Limiar de Região" por uma inspeção visual, 100 como "Limiar da Região" neste experimento.
       NOTA: Uma inspeção visual significa que um pesquisador pode discriminar a área de EVs a partir de uma imagem fluorescente crua.
   16. Selecione o volume da região como "Diâmetro de", em seguida, clique em Concluir.
3. Use os algoritmos fornecidos pelo software para dividir os pontos agrupados dentro da superfície construída na etapa 4.2 (Figura 4C, i-iv).
   1. Clique nos Pontos construídos e entre em Filtros.
   2. Clique em + Adicionar botão e selecione A distância mais curta para superfícies de superfícies = Superfície 1 como Tipo de Filtro e clique em Seleção Duplicada para novo botão Pontos . O menor limiar (-7,0 neste experimento) para o limite baixo e o valor apropriado (-0,5) para o limite superior.
      NOTA: Defina o limite superior com o raio estimado de Manchas. Neste experimento, o diâmetro estimado das manchas, ou seja, pontos EV, foi definido para 1 μm na etapa 4.2.11.; assim, o limite superior pode ser de 0,5.
4. Contagem automática de EVs dentro das células
   NOTA: O software contará automaticamente o número de EVs dentro das células, indicando o número internalizado pelas células-alvo.
   1. Clique na seleção de Pontos 1 construídas [Menor Distância para Superfícies de Superfícies = Superfícies 1 entre -7,00 e -0,500].
   2. Vá para as Estatísticas e exporte o valor de "Número Total de Pontos"
      NOTA: Os algoritmos fornecidos pelo software calcularão automaticamente o número e o volume das células.
5. Determine o rendimento da absorção de EV por período de incubação com base nos valores acima calculados (Figura 5).
   1. Para obter o número de células, clique nas Superfícies construídas 1, depois vá para as Estatísticas e exporte o valor de "Número Total de Superfícies" da Global.
   2. Vá para o Detalhado em Estatísticas para exportar o Volume de Detalhado.

Resultados

Utilizando um dispositivo microfluido à base de nano-filtração, os EVs foram isolados do PC3 CCM e rotulados com um anticorpo ev específico (CD63) conjugado por fluoroforeiro (Figura 1). Os EVs rotulados foram visualizados com sucesso pela microscopia confocal 3D (Figura 2). Os EVs rotulados foram incubados com células por várias horas em mídia exosome-esgotada. Após a incubação, as células foram lavadas com mídia exósia esgotada. Os EVs restantes f...

Discussão

Um ensaio de absorção de EV baseado em imagens de fluorescência 3D via microscopia confocal fornece uma metodologia eficiente e uma análise sensível. Esta rotulagem fluorescente de EV facilita a visualização de EVs e executa com sucesso um ensaio preciso de absorção de EV. Métodos anteriores para rotular EVs e remover o corante residual foram relatados removendo a precipitação usando ultracentrifugação (UC); no entanto, a UC pode co-precipitar EVs, e o corante imobilizado pode levar a um sinal

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody	Biolegend	353038	Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objective for confocal imaging, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objective for confocal imaging, NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Operation device for Exodisc
Exosome-depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection
Fetal bovine serum (FBS)	VWR	1500-500	Nutrient for cell cultivation
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	Culture dish for confocal imaging
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	Post-image processing software
Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer	Live Cell Instrument	TU-O-20	Incubator system for live cell imaging
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera	Nikon	NA	Camera for confocal imaging
Nikon Eclipse Ti microscope	Nikon	NA	Inverted microscope for confocal imaging
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Image processing software for Nikon microscope
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Measurement device for EV concentration
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	Graphing software
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotics for cell cultivation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Cell culture media for PC3 cell line cultivation
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S32703	RNA staining fluorescent dye for the EV labeling