Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Resumo

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Resumo

Diversas espécies bacterianas secretam ~20-300 nm de vesículas extracelulares (EVs), compostas de lipídios, proteínas, ácidos nucleicos, glicanos e outras moléculas derivadas das células parentais. Os EVs funcionam como vetores de comunicação intra e interespécies, ao mesmo tempo em que contribuem para a interação entre bactérias e organismos hospedeiros no contexto de infecção e colonização. Dada a multiplicidade de funções atribuídas aos EVs na saúde e na doença, há um interesse crescente em isolar EVs para estudos in vitro e in vivo. Hipotetizou-se que a separação dos EVs com base em propriedades físicas, ou seja, tamanho, facilitaria o isolamento de vesículas de diversas culturas bacterianas.

O fluxo de trabalho de isolamento consiste em centrifugação, filtração, ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para o isolamento de EVs de culturas bacterianas. Uma etapa de filtragem de fluxo tangencial (TFF) acionada por bomba foi incorporada para melhorar a escalabilidade, permitindo o isolamento do material de litros de cultura de células iniciais. Escherichia coli foi utilizada como um sistema modelo que expressa nanoluciferase associada a EV e mCherry não associada a EV como proteínas repórteres. A nanoluciferase foi direcionada aos EVs pela fusão de seu N-terminal com a citolisina A. Frações de cromatografia inicial contendo EVs de 20-100 nm com citolisina A associada - nanoLuc foram distintas das frações posteriores contendo as proteínas livres. A presença de nanoluciferase associada à EV foi confirmada por marcação imunodourada e microscopia eletrônica de transmissão. Este fluxo de trabalho de isolamento EV é aplicável a outras espécies bacterianas gram-negativas e gram-positivas associadas ao intestino humano. Em conclusão, a combinação de centrifugação, filtração, ultrafiltração/TFF e SEC permite o isolamento escalável de EVs de diversas espécies bacterianas. Empregar um fluxo de trabalho de isolamento padronizado facilitará estudos comparativos de EVs microbianos entre espécies.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são estruturas do tamanho nanométrico, semelhantes a lipossomas, compostas por lipídios, proteínas, glicanos e ácidos nucleicos, secretadas por células procarióticas e eucarióticas¹. Desde os primeiros estudos que visualizaram a liberação de EVs de bactérias gram-negativas², o número de funções biológicas atribuídas a EVs bacterianas (20-300 nm de diâmetro) tem crescido constantemente nas últimas décadas. Suas funções incluem transferência de resistência a antibióticos³, formação de biofilme⁴, detecção de quórum⁵ e entrega de toxinas⁶. Há também um interesse crescente no uso de EVs bacterianos como terapêutica, especialmente em vacinologia⁷ e terapia do câncer⁸.

Apesar do crescente interesse na pesquisa de VE, ainda existem desafios técnicos em relação aos métodos de isolamento. Especificamente, há uma necessidade de métodos de isolamento que sejam reprodutíveis, escaláveis e compatíveis com diversos organismos produtores de EV. Para criar um conjunto unificado de princípios para o planejamento e relato de isolamento de EV e métodos de pesquisa, a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares publica e atualiza o documento de posição MISEV⁹. Além disso, o consórcio EV-TRACK fornece uma plataforma aberta para relatar metodologias detalhadas para o isolamento de EV usadas em manuscritos publicados para aumentar a transparência¹⁰.

Neste protocolo, metodologias anteriores utilizadas para o isolamento de EVs da cultura de células de mamíferos foram adaptadas^11,12 para permitir o isolamento de EVs da cultura de células bacterianas. Procuramos empregar métodos que permitam o isolamento de EV de uma variedade de micróbios, que podem ser escaláveis, e equilibrar a pureza e o rendimento do EV (conforme discutido no documento^{de posição MISEV 9}). Após a remoção de células bacterianas e detritos por centrifugação e filtração, o meio de cultura é concentrado por ultrafiltração por dispositivo centrífugo (para um volume de até ~100 mL) ou TFF acionado por bomba (para volumes maiores). Os EVs são então isolados pela SEC usando colunas otimizadas para a purificação de pequenos EVs.

Figura 1: Visão geral esquemática do fluxo de trabalho de isolamento de EV bacteriano. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TFF = filtração de fluxo tangencial; SEC = cromatografia de exclusão de tamanho; MWCO = ponto de corte do peso molecular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma cepa comensal de camundongo de Escherichia coli (isto é, E. coli MP1¹³) foi utilizada como organismo modelo e modificada para expressar nanoluciferase associada a EV por fusão com citolisina A, conforme relatado anteriormente¹⁴. Os métodos utilizados aqui podem processar pelo menos até vários litros de culturas bacterianas e efetivamente separar as proteínas associadas ao EV das proteínas não associadas ao EV. Finalmente, este método também pode ser usado para outras espécies bacterianas gram-positivas e gram-negativas. Todos os dados relevantes dos experimentos relatados foram submetidos à base de conhecimento EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)¹⁰.

Protocolo

NOTA: Garantir que todo o trabalho que envolva bactérias e ADN recombinante siga as melhores práticas de contenção de biossegurança adequadas ao nível de risco de biossegurança de cada estirpe. O trabalho deve ser feito de acordo com os regulamentos de biossegurança locais, nacionais e internacionais.

1. Estirpes bacterianas e condições de cultura

NOTA: As cepas bacterianas utilizadas neste estudo foram Escherichia coli MP1¹³, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve e Bifidobacterium dentium.

1. Para E. coli, usar uma alça estéril para inocular colônias individuais em 250 a 1.000 mL de caldo de Luria-Bertani (LB) e incubar aerobicamente em uma incubadora de agitação a 300 rpm e 37 °C por 48 h antes de processar a cultura. Para a cepa recombinante de E. coli MP1 que abriga p114-mCherry-Clyluc (Método Suplementar e Figura Suplementar S1), adicionar cloranfenicol ao ágar LB e caldo a uma concentração final de 17 μg/mL.
2. Para A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve e B. dentium, listrar em placas de ágar de infusão cardíaca cerebral (BHI) e incubar anaerobicamente dentro de uma câmara anaeróbia de vinil. Inocular colônias individuais em 100 mL de caldo de BHI pré-reduzido e incubar por 48 h anaerobicamente.

2. Isolamento do EV

1. Meio de cultura bacteriana clarificante por centrifugação e filtração
   1. Transfira as culturas de células bacterianas inoculadas na etapa 1 para limpar frascos de centrífuga de polipropileno de 250 mL ou 500 mL derramando. Centrifugar as garrafas em um rotor de grande capacidade e ângulo fixo a 4 °C e 5.000 × g por 15 min. Transfira o sobrenadante para limpar frascos de centrífuga por meio de um derramamento cuidadoso e centrifugar novamente a 10.000 × g por 15 min.
      NOTA: Reutilize os frascos após limpeza e descontaminação adequadas à biossegurança.
      1. Se grandes pellets de células bacterianas estiverem presentes após a segunda centrifugação, repita a centrifugação em um frasco limpo para remover ainda mais as células.
   2. Transfira o sobrenadante para um dispositivo de filtro acionado a vácuo de polietersulfona de 0,22 μm de tamanho apropriado derramando. Filtre conectando o dispositivo de filtragem a uma fonte de parede de vácuo. Se a taxa de filtragem cair significativamente, basta mover qualquer material não filtrado para um novo dispositivo. Armazene o meio filtrado a 4 °C durante a noite e continue o protocolo no dia seguinte, se desejar.
      NOTA: As centrifugações acima normalmente permitem o processamento de ~2x o volume indicado de cultura celular através de cada dispositivo. Por exemplo, um único dispositivo de filtro de 500 mL poderia filtrar ~1.000 mL de cultura pré-centrifugada. Esses dispositivos normalmente não são reutilizados. O uso de filtros de seringa nesta etapa não é recomendado sem otimização, pois perdas significativas foram observadas com os modelos testados. Este é um potencial ponto de parada.
   3. Verificar a remoção completa das células viáveis neste ponto, espalhando uma alíquota do sobrenadante filtrado em placas de ágar adequadas e garantir a ausência de quaisquer colónias após a incubação em condições óptimas para a estirpe bacteriana. Se forem detectadas bactérias, otimize ainda mais o procedimento acima, realizando centrifugações e/ou filtrações adicionais.
2. Concentração do meio filtrado
   1. Se trabalhar com volumes significativamente >100 ml, avance para o passo 2.2.2. Se trabalhar com volumes de ~100 mL, carregue 90 mL de meio de cultura filtrado no reservatório de um respectivo dispositivo de ultrafiltração centrífuga de corte de peso molecular (MWCO) de capacidade 100 kDa usando pipetas sorológicas. Sempre equilibre com um dispositivo de ultrafiltração correspondente e centrifugar no rotor da caçamba oscilante a 4 °C e 2.000 × g por intervalos de 15 a 30 minutos, até que o volume do meio no reservatório superior tenha sido concentrado em <0,5 mL.
      1. Encha o reservatório com qualquer meio de cultura filtrado restante. Se "recarregar", remova o fluxo na parte inferior do dispositivo e reequilibre todos os dispositivos.
         NOTA: Observou-se que o volume máximo de meio de cultura filtrado que pode ser concentrado utilizando esses dispositivos é <2 vezes o volume recomendado.
      2. Se a viscosidade do meio concentrado no reservatório estiver visivelmente aumentada (material escuro e viscoso), diluir com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e reconcentrar por centrifugação para diluir quaisquer proteínas não-EV menores que o MWCO de 100 kDa.
         Observação : este é um ponto de parada potencial.
      3. Transfira o meio concentrado para um tubo de baixa ligação a proteínas, armazene a 4 °C durante a noite e continue o protocolo no dia seguinte, se desejar.
   2. Se estiver trabalhando com volumes significativamente >100 mL, selecione um dispositivo TFF de tamanho apropriado (100 kDa MWCO) para acomodar o volume a ser processado.
      NOTA: Dispositivos de filtração para processamento de 100 mL a >1.000 mL estão disponíveis comercialmente. A disponibilidade, o custo e a compatibilidade locais com a bomba e a tubulação/conexões determinarão quais modelos específicos serão mais úteis. Até 2 L de meio de cultura foram processados com o dispositivo indicado na Tabela de Materiais antes de se precisar limpar o filtro (ver passo 2.3 abaixo para o protocolo de limpeza).
      1. Monte um circuito de filtração com tubulação #16 de baixa ligação/baixa lixiviação, 1/8 de polegada de mangueira-barba para adaptadores Luer, o dispositivo TFF e uma bomba peristáltica, conforme indicado na Figura Suplementar S2.
         NOTA: Realize TFF dentro de um gabinete de biossegurança para minimizar o risco de contaminação da preparação do EV com bactérias ambientais.
      2. À temperatura ambiente, comece a circular o meio filtrado e condicionado a aproximadamente 200 mL/min (mínimo de 100 mL/min). Determinar o RPM apropriado correspondente à vazão desejada bombeando 200 mL de PBS para um recipiente graduado. Ao circular um meio filtrado e condicionado, recolher as moléculas <100 kDa que atravessam a membrana de ultrafiltração como resíduos num recipiente separado.
         NOTA: O exemplo abaixo assumirá um volume inicial de 2 L de cultura.
      3. Continue a circular o meio condicionado até que seu volume tenha sido reduzido para ~ 100-200 mL. Mude-se para embarcações menores, conforme necessário. Dilua 2 vezes com PBS e continue a circular com a bomba, concentrando-se até 75-100 mL. Diluir 2 vezes com PBS e continuar a circular até um volume final de 25 ml. Diluir 2 vezes com PBS e continuar a circular até <10 ml.
      4. Levante a tubulação de alimentação para fora do reservatório de amostra e continue a bombear para purgar o filtro e recuperar a quantidade máxima de amostra.
         Observação : este é um ponto de parada potencial.
      5. Transferir a amostra concentrada para um tubo cónico e conservar durante a noite a 4 °C, se assim o desejar. Como alternativa, continue com o protocolo.
      6. Mover a amostra concentrada para um dispositivo de ultrafiltração centrífuga MWCO de 15 mL com capacidade de 100 kDa. Centrífuga em um rotor de caçamba oscilante a 4 °C e 2.000 × g por intervalos de 15-30 min até que o volume do meio no reservatório superior tenha sido concentrado em <2 mL.
         Observação : este é um ponto de parada potencial.
      7. Transfira o meio concentrado para um tubo de baixa ligação a proteínas e armazene a 4 °C durante a noite, continuando o protocolo no dia seguinte, se desejado.
3. Limpeza do dispositivo TFF (opcional)
   NOTA: A taxa de filtração diminui à medida que o dispositivo TFF começa a "entupir" durante o processo (incrustação). Se necessário, o dispositivo de filtro pode ser limpo para facilitar a filtração de amostras adicionais na mesma operação de purificação. Embora teoricamente possível, um filtro TFF limpo não foi usado para uma execução de purificação diferente para evitar a contaminação cruzada.
   1. Para limpar, remova todos os tubos e tampas do dispositivo TFF e drene qualquer líquido residual.
   2. Use a bomba peristáltica e a tubulação para inundar os compartimentos interno e externo do dispositivo TFF (ou seja, através das portas paralelas e perpendiculares no modelo listado na Tabela de Materiais) com ~100 mL de água destilada. Remova todas as tubulações/tampas e drene o dispositivo TFF.
   3. Tampar as portas externas (perpendicular, filtrado) e circular 250 mL de etanol a 20% em água destilada a >200 mL/min por 10 min através do compartimento interno. Drene, inunde com água destilada e escorra novamente como acima.
   4. Circular 250 ml de solução fresca de NaOH 0,5 N durante 30 minutos através do compartimento interior e escorrar novamente.
   5. Reconecte todas as tubulações e tampas às portas de entrada, saída e filtrado, como na Figura Suplementar S2, e circule novamente a solução de NaOH 0,5 N até que um volume de NaOH > área de superfície do filtro de 1 mL/cm² permeie através da membrana do filtro e seja coletado como filtrado/resíduo.
   6. Lave o dispositivo TFF com água destilada como acima. Use o dispositivo TFF imediatamente ou inunde o dispositivo com ~100 mL de etanol a 20% e armazene durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Se armazenado em etanol, certifique-se de drenar, enxaguar com água, drenar e circular 250 mL de PBS através do dispositivo até que um volume de >1 mL/^cm2 de área de superfície do filtro permeie através da membrana do filtro e seja coletado como filtrado/resíduo para remover o etanol residual antes do processamento da amostra.
4. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)
   NOTA: SEC é usado para aumentar a pureza dos EVs e remover proteínas não vesiculares.
   1. Use uma pequena coluna SEC (volume de leito de 10 mL) para o isolamento de EVs de <100 mL de matéria-prima e uma coluna maior (volume de leito de 47 mL) para o isolamento de EVs de >100 mL de material de partida.
      Observação : O exemplo abaixo listará volumes para a coluna maior, com volumes para a coluna menor entre parênteses.
   2. Traga a coluna SEC e PBS à temperatura ambiente durante várias horas. Estabilize a coluna SEC em uma posição vertical usando um suporte e suporte de laboratório padrão. Alternativamente, use suportes de coluna de cromatografia comercial.
   3. Antes de se conectar à coluna SEC, hidrate o reservatório da amostra permitindo que 5 mL de PBS fluam através da frita e para um recipiente de resíduos. Desparafuse a tampa de entrada da coluna SEC, adicione 2 mL de PBS ao reservatório da amostra e conecte cuidadosamente o reservatório à coluna à medida que o PBS estiver escorrendo pela frita (não aplicável a pequenas colunas SEC).
      NOTA: Esta etapa anterior evita que quaisquer bolhas de ar fiquem presas na parte superior da coluna SEC. Se o ar estiver preso, remova o reservatório, toque na coluna para retirar a bolha de ar e repita o procedimento de conexão. Para a coluna menor, basta destampar a parte superior da coluna SEC e anexar o funil de amostra.
   4. Adicione 47 mL (10 mL) de PBS ao reservatório da amostra e destampe o fundo da coluna SEC. Permita que todo o buffer de amostra carregado flua através da coluna para equilíbrio. Descarte o fluxo.
   5. Carregue um máximo de 2 mL (0,5 mL) de amostra no reservatório da amostra, descarte o fluxo e permita que a amostra entre completamente na coluna.
   6. Adicionar imediatamente PBS ao reservatório ou funil da amostra a um volume de 14,25 ml menos o volume da amostra (3 ml menos o volume da amostra, para a coluna pequena). Deixe a solução fluir através da coluna e descarte essa quantidade igual ao volume vazio da coluna.
      NOTA: Para uma amostra típica de 2 mL, a quantidade de PBS a ser adicionada ao reservatório ou funil da amostra será de 12,25 mL.
   7. Posicione um microtubo de baixa ligação de 2 mL diretamente abaixo da coluna SEC. Adicione imediatamente 2 mL (0,5 mL) de PBS ao reservatório da amostra e deixe-o entrar na coluna. Rotule estes primeiros 2 mL (0,5 mL) de fluxo como Fração 1. Continue a adicionar 2 mL (0,5 mL) de cada vez ao reservatório da amostra para coletar cada fração subsequente.
      NOTA: A maioria dos EVs bacterianos eluem nas primeiras 5 frações. Durante a otimização, as primeiras 12 frações foram coletadas.
   8. Armazenar as fracções a 4 °C para armazenagem a curto prazo (dias) ou -80 °C para armazenagem a longo prazo.
   9. Limpeza e armazenamento das colunas SEC reutilizáveis
      NOTA: As colunas SEC descritas neste protocolo podem ser reutilizadas até 5 vezes de acordo com o fabricante. Se a taxa de fluxo das colunas SEC diminuir após os usos de <5, o fabricante recomenda centrifugar as amostras concentradas a 10.000 x g por 10 minutos para limpar quaisquer agregados antes da SEC. Em seguida, carregue o sobrenadante dessa centrifugação na coluna SEC para isolamento de EV.
      1. Para limpar e armazenar a coluna SEC após cada uso, adicione 2 mL (0,5 mL) de NaOH 0,5 M e deixe que ela entre completamente na coluna. Passe 100 mL (20 mL) de etanol a 20% pela coluna e armazene-o a 4 °C até o próximo uso. Antes do próximo uso, equilibre o etanol à temperatura ambiente como acima e troque-o pelo tampão PBS passando mais 150 mL (30 mL) de PBS através da coluna.
      2. Para limpar e reutilizar imediatamente a coluna SEC após cada uso, adicione 2 mL (0,5 mL) de NaOH 0,5 M e permita que ela entre completamente na coluna. Execute aproximadamente 150 mL (30 mL) de tampão PBS para lavar o NaOH. Quando o pH do eluato é igual ao PBS (~7), uma nova amostra pode ser carregada.

3. Controle de qualidade da preparação do EV

1. Teste de esterilidade
   NOTA: Como esses EVs vêm de culturas bacterianas, é fundamental garantir a esterilidade antes do uso a jusante.
   1. Obter 100 μL (20 μL) das frações a serem utilizadas nos ensaios e inocular 3 mL do meio utilizado para o cultivo das bactérias de origem. Cultivar sob as respectivas condições ótimas por pelo menos 3 dias e observar a turbidez. Alternativamente, aplique as amostras de fração em placas de ágar contendo o meio usado para cultivar as bactérias produtoras e procure a formação de colônias.
      NOTA: Se a contaminação bacteriana for detectada, não é recomendado o uso da preparação EV para experimentação. Em vez disso, repita o isolamento, tomando cuidado para minimizar o risco de contaminação bacteriana (a) realizando centrifugação/filtração suficiente do meio de cultura de células bacterianas condicionadas, (b) usando frascos limpos, tubos, filtros e colunas de cromatografia e (c) empregando técnicas assépticas apropriadas.
2. Quantificação de proteínas
   NOTA: Foi utilizado um kit de quantificação de proteínas à base de fluorescência de alta sensibilidade (ver Tabela de Materiais). O kit funciona com um fluorímetro proprietário correspondente em comprimentos de onda de excitação/emissão de 485/590 nm.
   1. Leve todos os reagentes, padrões e amostras à temperatura ambiente.
   2. Preparar uma mistura mestra de reagente proteico e tampão adicionando 1 μL do reagente a 199 μL de tampão para cada amostra e padrão a ser ensaiado. Usando tubos de PCR de 0,5 mL de paredes finas, adicione 10 μL padrão + 190 μL de mistura mestra a cada tubo padrão.
      NOTA: Para estar dentro do intervalo do ensaio, a quantidade de cada fracção a adicionar a cada tubo de amostra depende do rendimento proteico esperado da purificação. Tipicamente, foram utilizados 5 μL de cada fração + 195 μL de master mix. O volume final de amostra + mistura principal deve ser de 200 μL.
   3. Vórtice os tubos de ensaio e incube por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
   4. Meça os padrões no fluorímetro proprietário apropriado (consulte a Tabela de Materiais) selecionando a opção Ensaio de proteína usando os botões de seta e pressionando o botão GO para confirmar. Siga as instruções na tela, inserindo cada tubo padrão e pressionando GO.
   5. Inserir o tubo de amostra experimental; pressione GO para ler; e observe o resultado exibido, que é a concentração real de proteína na mistura tampão de ensaio/amostra. Para obter a concentração de proteína na amostra, use as teclas de seta para selecionar a opção Calcular concentração da amostra, pressione GO e use as teclas de seta para selecionar o volume da amostra adicionado ao buffer de ensaio para a amostra fornecida. Pressione GO e registre a concentração de proteína da amostra. Repita esta etapa para cada amostra a ser analisada.
3. Contagem de partículas e distribuição de tamanho
   NOTA: O sensor de pulso resistivo microfluídico (MRPS) foi utilizado para quantificar a concentração de EV e a distribuição de tamanho.
   1. Diluir as amostras em PBS suplementado com Tween-20 a 1% que tenha sido filtrado através de um filtro de seringa de 0,02 μm até uma concentração de proteína de aproximadamente 0,1 μg/mL.
      NOTA: O objetivo da diluição é atingir uma concentração de partículas esperada na faixa de 10^{a 10} partículas/mL em frações contendo EV. A diluição ideal pode precisar ser determinada empiricamente. Poucos EVs são esperados para frações posteriores (além da Fração 6). Assim, a concentração de partículas provavelmente será de <10^{a 10} partículas/mL, apesar de analisar em baixas diluições.
   2. Carregue 3 μL de cada amostra no cartucho microfluídico descartável com uma micropipeta, insira o cartucho no instrumento MRPS e pressione o botão de metal com um aro azul iluminado.
   3. Clique em Go! no software de aquisição e aguarde que a amostra seja analisada pelo instrumento. Adquira de 1.000 a 10.000 eventos de partículas para minimizar o erro estatístico técnico de análise. Neste ponto, clique em Parar e Terminar Execução para concluir a aquisição de exemplo.
      NOTA: Juntamente com os arquivos de dados brutos, o instrumento produz uma planilha de resumo listando a concentração de partículas na amostra. Correctar este valor de acordo com a diluição da amostra efectuada.
   4. Usando software de análise, carregue os dados brutos e gere gráficos personalizados de distribuição de tamanho.

4. Armazenamento EV

1. Aliquotar fracções individuais ou agrupadas a 25-50% do tamanho da fracção individual (dependendo do tamanho da coluna utilizada) em tubos de baixa ligação às proteínas e conservar a -80 °C para evitar ciclos de congelamento-descongelamento.
   NOTA: Aplicações diferentes podem exigir alíquotas menores ou maiores, dependendo da quantidade esperada utilizada em cada experimento. Isso precisará ser determinado empiricamente. As frações não contendo EV podem ser descartadas se não forem aplicáveis aos objetivos da pesquisa.

5. Microscopia eletrônica de transmissão

1. Coloração negativa
   1. Adicionar 5 μL da amostra EV à grelha de malha de cobre revestida de carbono 400 e incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar o lado do provete com 5 gotas de tampão Tris de 5 mM (pH 7,1) e, em seguida, com 5 gotas de água destilada.
   2. Lado da mancha do espécime com 5 gotas de acetato de uranila a 2%. Limpe qualquer quantidade extra de mancha com papel de filtro e permita que a grade seque completamente por várias horas ou durante a noite. Visualize os espécimes com um microscópio eletrônico operado a 80 kV.
2. Rotulagem Immunogold
   1. Aplicar 10 μL da suspensão EV numa grelha de malha formvar/carbono 400 e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Lave a grade em PBS três vezes e, em seguida, aplique 4% de paraformaldeído por 10 min para fixar a amostra. Lave as grades cinco vezes com PBS.
   2. Bloquear a grade com três lavagens de PBS contendo albumina sérica bovina (BSA) a 0,1%. Em seguida, aplique 10 μL de um anticorpo primário por 40 min à temperatura ambiente (aqui, 1 μg/mL de anticorpo nluc). Lave novamente três vezes com PBS contendo 0,1% de BSA.
   3. Adicione 10 μL de anticorpo secundário marcado com ouro à grelha e incube durante 40 minutos à temperatura ambiente. Lave as grades três vezes com PBS.
      NOTA: Aqui, um anticorpo anti-rato de cabra conjugado com nanopartículas de ouro de 10 nm foi utilizado após diluição de 1:10 em tampão de bloqueio. Se a marcação de ouro obscurecer a visualização de EV, anticorpos secundários com nanopartículas de ouro menores (por exemplo, 5 nm) podem ser usados.
   4. Pós-fixe a grade com 10 μL de glutaraldeído a 2,5% por 10 min à temperatura ambiente. Lave três vezes em PBS. Realizar coloração negativa com acetato de uranila a 2% (10 μL) por 15 min. Incorporar as amostras em 10 μL de acetato de uranilo a 0,5% e solução de metilcelulose a 0,13% por 10 min.
   5. Permita que as grades da amostra sequem durante a noite à temperatura ambiente antes da imagem no microscópio eletrônico.
   6. No software de aquisição do microscópio, determine a exposição empiricamente para obter a qualidade ideal da imagem (por exemplo, 0,80851 s nesta configuração específica) e ajuste-a digitando esse valor na caixa de opção de tempo de exposição . Selecione a opção de 80 kV e clique em Iniciar aquisição para capturar a imagem.

Resultados

Para avaliar quais frações de cromatografia SEC foram enriquecidas para EVs, a coluna SEC foi carregada com 2 mL de meio de cultura condicionado por E. coli MP1 que havia sido concentrado 1.000 vezes por TFF, e frações sequenciais foram coletadas. Utilizando MRPS, verificou-se que as frações 1-6 continham a maioria dos EVs (Figura 2A). As frações subsequentes continham muito poucos EVs, compreendendo em vez de proteínas livres de EV (Figura 2B)...

Discussão

No protocolo acima, é descrito um método que é escalável e isola de forma confiável os EVs de várias bactérias gram-negativas/positivas e aeróbicas/anaeróbias. Tem vários pontos de parada potenciais ao longo do procedimento, embora seja melhor evitar levar mais de 48 h para isolar os EVs dos meios de cultura bacteriana condicionados.

Primeiro, consiste em cultivar bactérias para gerar meio de cultura bacteriana condicionado. Verificou-se que aumentar o tempo de cultura para pelo men...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	3430	it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron microscopy sciences	15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter	Beckman Coulter	392077	Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge	Beckman Coulter		No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Brain Heart infusion (BHI) broth	Himedia	M2101	After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge	Spectradyne
Chloramphenicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Electron microscope	FEI company	Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (gift)		commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter	ThermoFisher	010-0151-05	used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper	Electron microscopy sciences	FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)	Electron microscopy sciences	16100
Hematin	ChemCruz	207729B	Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader	Tecan		This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus	Takara	638909	For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller	Difco	244620
L-Cysteine Hydrochloride	J.T. Baker	2071-05	It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-08	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-24	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft	Cole Palmer	EW-06435-16	low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3)	MP	102259	Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System	Promega	N1110	This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer	NEB	M0482	DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes	Eppendorf	30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack	Izon		for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer	ThermoFisher		Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit	ThermoFisher	Q33211	Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x Microplate reader	Molecular Devices		This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate	Electron microscopy sciences	22400
Vinyl anaerobic chamber	Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES	Sartorius	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)	MilliporeSigma	WHA68093002	to filter MRPS diluent