Preparação Biológica e Técnica Mecânica para Determinar Propriedades Viscoelásticas de Fibras Zonulares

Resumo

O protocolo descreve um método para o estudo da viscoelasticidade da matriz extracelular e sua dependência da composição proteica ou fatores ambientais. O sistema de matriz alvo é o zonule do rato. O desempenho do método é demonstrado comparando o comportamento viscoelástico das fibraszonulares do tipo selvagem com as que não possuem glicoproteína associada a microfibril-1.

Resumo

A elasticidade é essencial para a função de tecidos como vasos sanguíneos, músculos e pulmões. Esta propriedade é derivada principalmente da matriz extracelular (ECM), a malha proteica que une células e tecidos. Como as propriedades elásticas de uma rede ECM se relacionam com sua composição, e se as propriedades de relaxamento do ECM desempenham um papel fisiológico, são questões que ainda não foram totalmente abordadas. Parte do desafio está na arquitetura complexa da maioria dos sistemas ECM e na dificuldade em isolar componentes ECM sem comprometer sua estrutura. Uma exceção é o zonule, um sistema ECM encontrado no olho de vertebrados. O zonule compreende fibras de centenas a milhares de micrômetros de comprimento que abrangem o espaço livre de células entre a lente e a parede do olho. Neste relatório, descrevemos uma técnica mecânica que aproveita a estrutura altamente organizada do zonule para quantificar suas propriedades viscoelásticas e determinar a contribuição de componentes proteicos individuais. O método envolve dissecção de um olho fixo para expor a lente e o zonule e emprega uma técnica de puxar para cima que estica as fibras zonulares igualmente enquanto sua tensão é monitorada. A técnica é relativamente barata, mas sensível o suficiente para detectar alterações nas propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos sem proteínas zonulares específicas ou com envelhecimento. Embora o método aqui apresentado seja projetado principalmente para estudar o desenvolvimento ocular e doenças, também poderia servir como um modelo experimental para explorar questões mais amplas sobre as propriedades viscoelásticas dos ECM elásticos e o papel de fatores externos como concentração iônica, temperatura e interações com moléculas de sinalização.

Introdução

O olho de um vertebrado contém uma lente óptica viva que ajuda a focar imagens na ^retina1. A lente é suspensa no eixo óptico por um sistema de fibras delicadas e radialmente orientadas, conforme ilustrado na Figura 1A. Em uma extremidade, as fibras se prendem ao equador da lente e, na outra, à superfície do corpo ciliar. Seus comprimentos abrangem distâncias que variam de 150 μm em camundongos a 1 mm em humanos. Coletivamente, essas fibras são conhecidas como o zonule de ^Zinn2, o zonule ciliar, ou simplesmente o zonule. Traumas oculares, doenças e certos distúrbios genéticos podem afetar a integridade das fibras ^zonulares3, resultando em sua eventual falha e perda de visão. Em camundongos, as fibras possuem um núcleo composto principalmente pela fibrillina-2 proteica, cercada por um manto rico em fibrillin-14. Embora as fibraszonulares sejam únicas aos olhos, elas possuem muitas semelhanças com as fibras ECM baseadas em elastina encontradas em outros lugares do corpo. Estes últimos são cobertos por um manto de fibrillina-15 e têm dimensões semelhantes às fibraszonulares6. Outras proteínas, como o fator de crescimento transformador latente β proteínas de ligação (LTBPs) e a glicoproteína associada à microfibril-1 (MAGP-1), são encontradas em associação com ambos os tipos de fibras7,8,9,10,11. O módulo elástico das fibraszonulares está na faixa de 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, comparável ao das fibras à base de elastina (0,3-1,2 MPa)¹⁷. Essas semelhanças arquitetônicas e mecânicas nos levam a acreditar que qualquer visão sobre os papéis das proteínas associadas ao zonule pode ajudar a elucidar seus papéis em outras fibras elásticas ECM.

O principal objetivo do desenvolvimento do método descrito aqui é obter insights sobre o papel de proteínaszonulares específicas na progressão da doença ocular hereditária. A abordagem geral é comparar as propriedades viscoelásticas das fibraszonulares em camundongos do tipo selvagem com as de camundongos portadores de mutações direcionadas em genes que codificam proteínaszonulares. Embora vários métodos tenham sido utilizados anteriormente para medir as propriedades elasto-mecânicas das fibraszonulares, todos foram projetados para os olhos de animais muito maiores12,13,14,15,16. Como tais modelos não são geneticamente tratáveis; buscamos desenvolver um método experimental mais adequado aos pequenos e delicados olhos dos ratos.

O método que desenvolvemos para avaliar a viscoelasticidade das fibraszonulares do camundongo é uma técnica a que chamamos de ensaio de puxar para ^cima4,18, que é resumido visualmente na Figura 1. Uma descrição detalhada do método pull-up e a análise dos resultados são fornecidas abaixo. Começamos descrevendo a construção do aparelho, incluindo as peças tridimensionais (3D) impressas usadas no projeto. Em seguida, detalhamos o protocolo usado para a obtenção e preparação dos olhos para o experimento. Por fim, fornecemos instruções passo a passo sobre como obter dados para a determinação das propriedades viscoelásticas das fibras zonulares. Na seção Resultados Representativos, compartilhamos dados inéditos obtidos com nosso método sobre as propriedades viscoelásticas de fibras zonulares de camundongos sem ^MAGP-119, bem como um conjunto de controle obtido a partir de animais do tipo selvagem com correspondência etária. Por fim, concluímos com observações gerais sobre as vantagens e limitações do método, e sugestões de potenciais experimentos que possam elucidar como fatores ambientais e bioquímicos afetam as propriedades viscoelásticas das fibras ECM.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Universidade de Washington e aderiram à Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.

1. Fabricação de peças especializadas e construção de aparelhos

1. Fabricação de peças especializadas
   1. Fabricação da sonda. Segure um capilar de vidro em um ângulo como mostrado no painel esquerdo da Figura 2A. Coloque uma chama de um isqueiro a cerca de 2 cm de uma extremidade e mantenha-a lá até que a extremidade se dobre em 90°, como mostrado no painel direito da Figura 2A.
   2. Fabricação de plataforma de amostra. Utilizando software de desenho 3D, projete uma plataforma de 30 x 30 x 5 mm e contendo recuos hemisféricos de 2.0, 2,5 e 3,0 mm de diâmetro, como mostrado na Figura 2B.
   3. Fabricação do suporte da sonda. Usando o software de desenho 3D, projete uma montagem que segure a sonda capilar e anexe-a a um micromanipulador (ver Figura 2C).
      NOTA: Um arquivo 3D amostra para fabricação da plataforma e fabricação do suporte do teste em formato STL está disponível apenas a pedido do autor correspondente.
   4. Montagem negativa da lente. Coloque uma lente cilíndrica negativa (-75 mm na distância focal e aproximadamente 50 mm em altura e comprimento) como mostrado na Figura 1C e Figura 1D para corrigir a distorção causada pela adição de fluido à placa de Petri (a adição de fluido distorce a visão do olho dissecado quando visualizado do lado).
   5. Cole a lente negativa a uma das bases de 2 ranhuras (ver Figura 2D para posicionamento da lente na base).
   6. Monte as peças restantes conforme mostrado na Figura 2D.
   7. Ajuste a altura do poste para que a lente mal paire sobre a balança e aperte o parafuso no suporte do post.
2. Construção de aparelhos
   1. Instale em um computador o programa de registro fornecido com a escala, o software de câmera de microscópio e o aplicativo do controlador de micrometer motorizado.
   2. Conecte o micrômetro motorizado ao controlador do motor servo e o último ao computador. Inicie a aplicação do controlador do motor e edite as configurações do motor.
      NOTA: As configurações do motor, listadas abaixo, foram escolhidas após experimentos preliminares que revelaram que as tensões relaxadas em uma escala de tempo de 10 a 20 s. Com base nessa determinação, selecionamos uma velocidade e aceleração que permitiu ao motor completar um deslocamento de 50 μm em um tempo menor do que o tempo de relaxamento, mas não muito curto para evitar sacudir a amostra. Aqui escolhemos um tempo de deslocamento de cerca de 5-10 s.
   3. Defina a velocidade máxima para 0,01 mm/s e a aceleração para 0,005 mm/^s2.
   4. Instale a câmera no microscópio de inspeção e teste o software de imagem da câmera.
   5. Coloque a balança no espaço de banco dedicado ao aparelho.
   6. Cole uma plataforma impressa em 3D (a partir do passo 1.1.2) a uma placa de Petri e adicione uma conta de vidro de 2-3 mm a um dos poços. Coloque a placa de Petri na balança para que a conta esteja localizada perto do centro da panela.
   7. Substitua o micrometro manual do micromanípulo pelo motorizado.
   8. Enrosque os dois parafusos 4-40 no suporte da sonda. Conecte o suporte da sonda ao manipulador conforme mostrado na Figura 1C.
   9. Prepare uma sonda ilustrada na Figura 2A, coloque-a dentro do suporte da sonda com a porção dobrada voltada para baixo e aperte os parafusos.
   10. Posicione o micromanipulador sobre a mesa de tal forma que a ponta da sonda esteja sobre a conta na plataforma. Fixar o micromanipulador na mesa para evitar o movimento acidental durante o experimento.
   11. Posicione o microscópio lateral sobre a mesa para que a conta esteja no centro de seu campo de visão e em foco.

2. Preparação de amostras e aquisição de dados

1. Fixação e dissecção dos olhos
   1. Mantenha camundongos de tipo selvagem e animais magp1-nulos em um fundo C57/BL6J idêntico. Eutanize camundongos de 1 mês ou 1 ano por inalação de _CO2 .
   2. Remova os olhos com fórceps finos e fixe os globos enucleados a 4 °C durante a noite em 4% de paraformaldeído/salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7.4). Mantenha uma pressão positiva de 15-20 mmHg no olho durante o processo de fixação, conforme ^descrito6.
      NOTA: Experimentos são realizados em camundongos machos, para controlar possíveis diferenças relacionadas ao sexo no tamanho do globo ocular. A pressão positiva garante que o globo permaneça inflado, preservando a distância entre a lente e a parede do olho atravessada pelas fibraszonulares.
   3. Lave os olhos por 10 minutos na PBS. Usando tesoura cirúrgica oftálmica e trabalhando sob um estereomicroscópio, faça uma incisão de espessura total na parede do olho perto da cabeça do nervo óptico.
   4. Estenda o corte para a frente para o equador, e depois em torno da circunferência equatorial do olho. Tome cuidado para poupar os delicados processos ciliares e fibraszonulares associadas.
   5. Remova a parte de trás do globo, expondo a superfície posterior da lente.
   6. Use as fórceps para remover um olho dissecado da solução tampão e coloque-o em uma limpeza de tarefa seca com a córnea virada para baixo. Arraste suavemente a córnea sobre a superfície da limpeza para secá-la.
   7. Adicione 3 μL de cola instantânea aos poços da plataforma que acomodarão o olho na placa de Petri.
   8. Coloque o prato na placa do palco do estereoscópio para que o poço com a cola esteja à vista.
   9. Transfira o olho da limpeza para a borda do poço que contém cola. Em seguida, arraste cuidadosamente o olho para o poço e ajuste rapidamente sua orientação para que a parte de trás da lente fique mais alta.
   10. Seque o lado exposto da lente, borrando-a suavemente com o canto de uma limpeza seca.
   11. Aplique um pouco de cola instantânea na parte inferior de uma placa de Petri de 50 mm e cimente a plataforma para ela.
2. Medição da resposta viscoelástica zonular
   1. Ligue a escala, inicie o programa de registro de escala e o software da câmera. Certifique-se de que o programa de registro pode adquirir dados por 30 minutos, pois alguns testes podem durar tanto tempo.
   2. Ligue o controlador do motor servo e inicie a aplicação do controlador no computador. Certifique-se de que o controlador está configurado para mover-se em incrementos de 50 μm usando parâmetros de movimento semelhantes aos descritos no NOTE na etapa 1.2.2.
   3. Crie uma curva de 90° em uma haste capilar, conforme descrito na etapa 1.1.1.
   4. Coloque o capilar dobrado no suporte da sonda capilar e aperte os parafusos de fixação.
      NOTA: Para minimizar a desidratação da amostra, recomendamos que as etapas 1-4 sejam concluídas antes ou durante a dissecção dos olhos.
   5. Adicione uma pequena (~1 mm) de cola de cura UV na ponta do capilar.
   6. Usando os ajustes manuais no manipulador, mova a ponta da sonda capilar para que ela fique diretamente sobre o centro da lente. Verifique se a parte inferior da cola UV aparece centrada na parte superior da lente quando vista da frente (por inspeção visual) e do lado (através da câmera do microscópio).
   7. Ao olhar através da câmera, baixe a ponta da sonda até que a cola UV faça contato com a lente e cubra de um terço a metade de sua superfície superior.
   8. Use uma fonte de luz de baixa intensidade (~ 1 mW), direcional, quase visível (380-400 nm) para curar a cola.
      NOTA: Essas especificações são suficientes para curar a cola em poucos segundos, minimizando o potencial de indução de 30% de ligação entre proteínas. As fontes de luz UV fornecidas com canetas comerciais de cola UV atendem a essas especificações.
   9. Adicione a solução PBS ao prato até que o olho esteja coberto por fluido a uma profundidade de pelo menos 2 mm.
   10. Coloque a lente cilíndrica em frente ao microscópio de inspeção e o mais próximo possível da placa de Petri sem tocá-la.
   11. Inicie simultaneamente o programa de registro e um programa de temporizador. Tire uma foto do olho/sonda usando a câmera.
   12. Depois dos 60, inicie outro deslocamento de 50 μm, e depois a cada 60 s até que o experimento esteja completo, ou seja, até que todas as fibras tenham sido quebradas. Observe que o sinal não retornará aos níveis de linha de base devido à evaporação do buffer durante o experimento. Corrija a deriva resultante nas leituras durante a análise dos dados, conforme exemplificado na etapa 2.2.14.
   13. Após a conclusão de uma execução, salve os dados de registro de escala e exporte-os em um formato compatível com a planilha, por exemplo, um formato .csv. Guarde as imagens das lentes coletadas durante a execução.
   14. Importar dados em uma planilha. Use a leitura da primeira e última escala para interpolar a deriva na leitura de fundo ao longo do tempo devido à evaporação (ver Figura 3). Subtraia a leitura interpolada da leitura em cada ponto de tempo.
       NOTA: Se usar uma planilha, a interpolação pode ser realizada automaticamente inserindo a fórmula = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 na célula à direita da leitura da primeira escala, em seguida, movendo o cursor para o canto inferior direito da célula e arrastando-o para o último valor de dados. A fórmula pressupõe que os dados estão organizados em uma coluna com o primeiro ponto de dados aparecendo na célula B2. Se desejar, os dados processados na etapa 2.2.14 podem ser analisados com o modelo viscoelástico quase elástico desenvolvido por um dos coautores, Dr. Matthew ^Riley4.

Resultados

A técnica de pull-up descrita aqui fornece uma abordagem simples para determinar propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos. Resumindo, o olho do rato é primeiro preservado pela injeção de um fixador na pressão intraocular fisiológica. Essa abordagem mantém a inflação natural do olho e mantém as fibras adequadamente pré-tensionadas (a fixação foi considerada aceitável após experimentos preliminares demonstrarem que não alterou significativamente a elasticidade ou força das fibras). A...

Discussão

O zonule é um sistema ECM incomum onde as fibras são organizadas simetricamente e podem ser manipuladas de forma idêntica deslocando a lente ocular ao longo do eixo óptico. O espaço também pode ser facilmente acessado sem interrupção celular, permitindo que as fibras sejam estudadas em um ambiente próximo ao seu estado natal. A técnica de pull-up aproveita esta apresentação de ECM para manipular as fibras delicadas de camundongos, um sistema geneticamente tratável, e quantificar com precisão suas propriedad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon