JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

Resumo

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite a imagem livre de rótulos dos tecidos biológicos em seu microambiente natural com base na vibração molecular intrínseca, fornecendo assim uma ferramenta perfeita para o estudo in vivo de processos biológicos em resolução subcelular. Ao integrar a fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) no microscópio SRS, a imagem em si de tecidos pode adquirir informações bioquímicas e biofísicas críticas de múltiplas perspectivas que ajudam a entender os processos dinâmicos envolvidos no metabolismo celular, resposta imune e remodelagem tecidual, etc. Neste protocolo de vídeo, é introduzida a configuração de um sistema de microscópio TPEF-SRS, bem como o método de imagem in vivo da medula espinhal animal. A medula espinhal, como parte do sistema nervoso central, desempenha um papel crítico na comunicação entre o cérebro e o sistema nervoso periférico. A baia de mielina, abundante em fosfolipídios, circunda e isola o axônio para permitir a condução saltatória de potenciais de ação. A imagem in vivo de baias de mielina na medula espinhal é importante para estudar a progressão de doenças neurodegenerativas e lesão medular. O protocolo também descreve a preparação animal e métodos de imagem in vivo TPEF-SRS para adquirir imagens biológicas de alta resolução.

Introdução

A microscopia raman1,2 está emergindo como um poderoso método livre de rótulos para imagem de tecidos biológicos com base nas frequências características de várias ligações químicas em biomoléculas. Devido à sua capacidade de imagem não invasiva e bem adaptativa, a microscopia de Raman tem sido amplamente utilizada para imagens de componentes enriquecidos com lipídios em tecidos biológicos como a bainha de mielina3,4,5, adipócitos6,7, e gotículas lipídicas8,9,10 . O sinal de dispersão de Raman estimulado (SRS) adquirido como ganho de Raman estimulado (SRG) ou perda de Raman estimulado (SRL) é livre de fundo, mostrando perfeita semelhança espectral com Raman espontâneo espalhando11,12. Além disso, o SRL e o SRG dependem linearmente da concentração de analitos, permitindo a análise quantitativa dos componentes bioquímicos9,11,13. A microscopia de fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) tem sido amplamente utilizada para imagens biológicas in vivo devido à sua capacidade de seção óptica inerente, profundidade de penetração profunda e baixa fototoxicidade14,15,16. No entanto, o desempenho da imagem TPEF depende das características das tags fluorescentes, e o número de cores solucionáveis é limitado devido ao espectro de fluorescência de banda larga8,17,18,19. A imagem TPEF baseada em imagens TPEF baseadas em ressonância magnética e fluorescência sem rótulos são duas modalidades de imagem complementares, e sua combinação pode fornecer informações biofísicas e bioquímicas abundantes dos tecidos. Essas duas modalidades de imagem são baseadas nos processos ópticos não lineares (NLO), o que permite uma integração simples em um sistema de microscópio. A combinação da imagem SRS e TPEF, a chamada imagem dual-modal, permite imagens de alta dimensão e perfil de células e tecidos, facilitando uma compreensão abrangente de sistemas biológicos complexos. Especificamente, a microscopia SRS picosecond (ps) pode alcançar imagens de ligação química com alta resolução espectral em comparação com a técnica srs femtosegundo (fs)11, permitindo diferenciar múltiplos componentes bioquímicos em tecido biológico, especialmente na região de impressão digital lotada20,21. Além disso, em comparação com outro sistema de microscópio NLO dual-modal comumente usado com integração do microscópio de dispersão anti-Stokes coerente (CARS), o SRS mostra desempenho superior aos CARS em termos de interpretação espectral e de imagem, bem como sensibilidade de detecção11. O microscópio SRS-TPEF tem sido usado como uma poderosa ferramenta para estudar vários sistemas biológicos, como Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cérebro de rato23,24, medula espinhal25,26, nervo periférico27, e tecido adiepos7, etc.

A medula espinhal juntamente com o cérebro compõe o sistema nervoso central (SNC). Visualizar atividades celulares no IN VIVO em condições fisiológicas e patológicas é fundamental para a compreensão dos mecanismos dos transtornos do CNS28,29,30 e para o desenvolvimento de terapias correspondentes31,32,33. A baia de mielina, que envolve e isola axônios para condução potencial de ação de alta velocidade, desempenha um papel significativo no desenvolvimento do CNS. A demyelination é considerada uma marca registrada em distúrbios da matéria branca, como a esclerose múltipla34. Além disso, após lesão na medula espinhal35, os detritos de mielina podem modular a ativação do macrófago, contribuindo para inflamação crônica e lesões secundárias36. Portanto, a imagem in vivo da baialina de mielina juntamente com neurônios e células gliais em modelos de camundongos vivos é de grande ajuda para entender os processos dinâmicos nos distúrbios do CNS.

Neste protocolo, são descritos os procedimentos fundamentais de configuração de um microscópio TPEF-SRS construído em casa e introduzidos os métodos de imagem in vivo dual-modal para medula espinhal do rato.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os procedimentos animais realizados neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes do Laboratório de Instalações Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong (HKUST) e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do HKUST. O treinamento de segurança para manuseio a laser é necessário para configurar e operar o microscópio TPEF-SRS. Use sempre óculos de segurança a laser com alcance de comprimento de onda apropriado ao lidar com laser.

1. Configuração do microscópio TPEF-SRS (para esquema de configuração ver Figura 1)

  1. Use um oscilador óptico integrado (OPO) conectado com um laser de fibra Ytterbium bloqueado no modo como fonte de laser ps para imagem SRS.
    NOTA: OPO produz um feixe de Stokes (1031 nm) e um feixe de bomba (tunable de 780 nm a 960 nm) com duração de pulso de 2 ps e taxa de repetição de 80 MHz. O feixe stokes é modulado a 20 MHz por um modulador eletro-óptico embutido (EOM) para detecção de SRS sensível à fase de alta frequência no nível de MHz.
  2. Use um titânio fs (Ti): laser de safira como fonte de laser para imagens TPEF.
  3. Use um par de lentes (L1 e L2) para cotor e ajustar o tamanho do feixe fs para 3 mm.
  4. Use um par de lentes (L3 e L4) para colidir o feixe laser do PS e expandir seu diâmetro para 3 mm.
  5. Alterar a polarização do raio laser fs da polarização p para a polarização de S usando uma placa de meia onda.
  6. Combine os dois raios laser com um divisor de feixe polarizador (PBS).
  7. Adicione um par de espelhos galvanômetros XY de 3 mm atrás do PBS para varredura de feixe.
  8. Use uma lente de varredura telecêntrica (L5) e uma lente de tubo corrigida pelo infinito (L6) para conjugar o espelho de varredura e a pupila traseira da lente objetiva de 25x. Expanda o raio laser pela lente de varredura e lente do tubo para preencher a abertura traseira do objetivo.
  9. Coloque um PBS ou espelho dicroico (D2) entre a lente do tubo e a lente objetiva para coleta de sinal de SRS ou fluorescência. Use uma nadadeira motorizada para alternar entre PBS e D2.
    NOTA: Parte do sinal SRS espalhado por trás é perdida ao passar pelo PBS como resultado de sua polarização deslocada aleatoriamente.
  10. Use um par de lentes (L7 e L9) para estreitar o feixe de detecção e conjugar a pupila traseira da lente objetiva de 25x com um sensor fotodiode.
  11. Use um par de lentes (L8 e L10) para estreitar o feixe de detecção e conjugar a pupila traseira do objetivo de 25x com a superfície de detecção do fotomultiplier (PMT).
  12. Use um espelho dicroico (D3) para separar o caminho de detecção de sinais de fluorescência e SRS.
  13. Coloque um conjunto de filtro (Fs1) na frente do detector de fotodiodos para bloquear o laser stokes e passe apenas o feixe da bomba.
  14. Coloque um conjunto de filtro (Fs2) em frente ao detector PMT para passar apenas o sinal de fluorescência alvo.
  15. Conecte o PMT a um amplificador de corrente para amplificação de sinal.
  16. Conecte o fotodiodo a um amplificador de travamento.
  17. Conecte o sinal de sincronização da saída EOM incorporada à entrada de referência do amplificador de travamento para desmodulação de sinal SRS.
  18. Conecte as saídas do amplificador PMT e do amplificador de travamento ao módulo de aquisição de dados.

2. Calibração do sistema de microscópio TPEF-SRS

  1. Startup dos lasers
    1. Mude a chave de posição standby para on para ligar o ti: laser de safira e esperar por 30 minutos para o laser aquecer.
    2. Ligue o OPO clicando no botão Iniciar no painel de controle OPO e espere 20 minutos para que o laser aqueça.
    3. Depois que o laser ps se aquecer, use um fotodetetor de alta velocidade para verificar a profundidade de modulação do feixe stokes. Abra o obturador laser para o raio Stokes. Clique na caixa De alimentação OPO e digite 20. Coloque o fotodetector de alta velocidade na saída OPO para detectar o feixe. Conecte a porta de saída do fotodetetor à porta de entrada de um osciloscópio usando um cabo coaxial com o conector Bayonet Neill-Concelman (BNC) para monitorar o pulso laser.
    4. Abra a janela EOM Control no software de controle OPO. Ajuste a potência e a fase do EOM de acordo com o diagrama de intensidade de pulso mostrado no osciloscópio para alcançar a profundidade máxima de modulação a 20 MHz.
      NOTA: O desempenho do EOM é geralmente estável e só precisa ser verificado quando o sinal SRS é encontrado significativamente diminuído.
  2. Alinhamento óptico do microscópio combinado TPEF-SRS
    1. Realize o alinhamento óptico para colocalização dos feixes ps e fs, conforme descrito nas etapas 2.2.2 a 2.2.13.
    2. Abra o obturador a laser da bomba enquanto para a saída de Stokes no software de controle OPO. Use o software de controle OPO para definir o comprimento de onda do feixe da bomba para 796 nm clicando na caixa Definir sinal e digitando o valor do comprimento de onda 796. Clique na caixa De potência OPO e digite 20 para definir sua potência ao mínimo (~20 mW) para alinhamento óptico.
    3. Ligue o computador do microscópio e todos os componentes eletrônicos associados, incluindo scanners, atuadores objetivos, fotodiodos, PMTs, amplificadores atuais, amplificadores de travamento e nadadeiras motorizadas. Inicie o software de controle de microscópio.
      NOTA: O software de controle de microscópio é uma interface caseira.
    4. Coloque duas placas de alinhamento (P1 e P2 na Figura 1) no caminho óptico. Coloque P1 atrás da PBS a uma distância de cerca de 10 cm e coloque P2 atrás de P1 a uma distância de cerca de 30 cm.
      NOTA: Os feixes ps e fs são combinados usando um PBS (Figura 1). As duas placas de alinhamento são usadas para verificar o alinhamento, bem como a colocalização dos dois raios laser.
    5. Abra o obturador do microscópio para o raio laser ps.
    6. Ajuste o espelho M1 para localizar o centro de raios laser ps no buraco de P1. Use um escopo infravermelho (IR) para observar a posição do ponto de feixe em P1 ao ajustar o espelho M1.
    7. Ajuste o espelho M2 para localizar o centro de raios laser ps no buraco de P2. Use o escopo IR para observar a posição do ponto de feixe em P2 ao ajustar o espelho M2.
    8. Repita as etapas 2.2.6 e 2.2.7 até que o centro de feixe ps se localize no buraco de ambas as placas de alinhamento. Feche o obturador do feixe ps no software de controle de microscópio.
    9. Defina o comprimento de onda de fs Ti: laser de safira a 740 nm e abra o obturador a laser. Defina a potência laser para 5 mW (medida na porta de entrada do sistema de microscópio) para alinhamento óptico.
    10. Abra o obturador de microscópio para o raio laser fs.
    11. Ajuste o espelho M3 para localizar o centro de ponto do raio laser fs no buraco de P1.
    12. Ajuste o espelho M4 para localizar o centro de ponto do feixe de laser no buraco do P2.
    13. Repita as etapas 2.2.11 e 2.2.12 até que o centro de raios laser fs se localize nos buracos de duas placas de alinhamento. Feche o obturador de microscópio para o feixe fs.
    14. Realize sobreposição espacial da bomba e dos feixes de Stokes, conforme descrito nas etapas 2.2.15 a 2.2.18.
      NOTA: Embora os feixes de bomba e Stokes estejam aproximadamente sobrepostos dentro do laser ps, é necessário ajuste fino das posições dos dois raios laser para obter o desempenho ótimo do SRS. Uma vez que o feixe da bomba está em primeiro lugar alinhado como descrito anteriormente, o próximo feixe stokes é ajustado para colocarlize com o feixe da bomba.
    15. Coloque uma câmera na posição do objetivo de visualizar a localização de dois pontos de viga. Marque a posição do feixe da bomba na tela da câmera como referência.
    16. Coloque uma placa de alinhamento P0 antes de L3 (Figura 1). Use uma chave hexabil para ajustar o espelho óptico 1 (OM1) para que o centro de feixe stokes passe pelo orifício da placa de alinhamento e coloque com o feixe da bomba na porta de saída do laser. Use o escopo IR para confirmar a posição da mancha de feixe em P0 durante o ajuste.
      NOTA: OM1 e OM2 são dois espelhos na cabeça OPO para ajustar a posição do feixe stokes de 1031 nm.
    17. Remova a placa de alinhamento P0 e use a tecla hexais para ajustar o OM2 de modo que o centro do feixe stokes se colocalize com a marca de referência do feixe da bomba na câmera.
    18. Repita os passos 2.2.16 e 2.2.17 até que o feixe de Stokes se sobreponha estritamente com o feixe da bomba em ambos os planos P0 e câmera.
      NOTA: Ao visualizar as manchas do feixe na câmera, todas as placas de alinhamento devem ser removidas do caminho óptico.
  3. Otimizar as condições de imagem
    1. Realize o ajuste de fase do amplificador de travamento conforme descrito nas etapas 2.3.2. para 2.3.7.
      NOTA: A detecção de SRS é baseada em um esquema sensível a fases de alta frequência. Para detecção de SRL, a intensidade do feixe stokes é modulada a 20 MHz e um amplificador de travamento é usado para desmodular o sinal. A fase e o deslocamento do amplificador de travamento precisam ser ajustados para alcançar o contraste de imagem ideal.
    2. Abra o software de controle do amplificador de travamento.
    3. Defina o comprimento de onda do laser da bomba para 796 nm e a potência da bomba e do feixe de Stokes seja de 15 mW e 25 mW na amostra, respectivamente.
      NOTA: Aqui use azeite para otimização e calibração de imagens SRS. O pico raman de azeite na região carbono-hidrogênio é de 2863,5 cm-1, correspondendo ao comprimento de onda do feixe da bomba a 796 nm.
    4. Sele o azeite em um slide e conecte um papel de tecido dobrado na parte inferior do slide para melhorar a contra-queda do sinal para detecção epi-SRS. Coloque a amostra de azeite no palco e ajuste o foco do objetivo de 25x na amostra.
    5. Use o software de controle de microscópio para definir os parâmetros de imagem da seguinte forma: 512 x 512 pixels para 500 μm x 500 μm de campo de visão (FOV), 6,4 μs de pixel. Use o software de controle do amplificador lock-in para definir o valor constante de tempo para 10 μs, o que é próximo do tempo de moradia do pixel.
    6. Escaneie o raio laser sobre a amostra. Use o software de controle do amplificador de travamento para ajustar a fase (0-180°) com um tamanho de passo de 22,5° até que a intensidade do sinal SRS atinja o máximo.
      NOTA: Neste amplificador de travamento totalmente analógico, a saída do sinal é o componente em fase, que depende da fase do sinal de referência. A fase pode ser ajustada pelo software de controle do amplificador lock-in com resolução de 11°, permitindo maximizar o sinal detectado para dentro de ~2%12. O amplificador de travamento fica fora de fase assim que o sinal de sincronização é interrompido. A fase precisa ser reajustada toda vez que o sinal de sincronização for restabelecido.
    7. Escaneie a amostra com obturador a laser fechado. Use o software de controle do amplificador lock-in para ajustar o valor de deslocamento com um tamanho de passo de 1 mV até que o sinal SRS médio esteja próximo de zero.
      NOTA: O sinal srs médio é estimado como a intensidade média de todos os pixels na imagem SRS, que é calculada automaticamente pelo software de controle de microscópio. Compensações são úteis para cancelar sinais indesejados de formação de fase.
    8. Realizar otimização de sincronização temporal conforme descrito nas etapas 2.3.9 a 2.3.14.
    9. Abra o diálogo Delay Manager (Figura 2) no software de controle OPO.
    10. Escaneie o azeite e ajuste o estágio de atraso até que o sinal SRS de azeite atinja seu máximo.
      NOTA: Pela primeira vez da imagem SRS, quando a fase do amplificador de travamento não foi otimizada, a sincronização temporal é ajustada primeiro aproximadamente para visualizar o sinal SRS da amostra antes de otimizar a fase do amplificador de travamento.
    11. Pare de digitalizar e clique no botão Adicionar dados no diálogo do gerenciador de atraso para registrar os dados de atraso atuais.
    12. Repita os passos 2.3. 10 e 2.3.11 para diferentes amostras químicas em diferentes comprimentos de onda.
      NOTA: Contas de poliestireno, água pesada, 5-Ethynyl-2'-desoxyuridina, glicerol são usados para medir os dados de atraso em diferentes bandas vibracionais.
    13. Selecione o Data Fit e o Order 5 no diálogo do gerenciador de atraso para se adequar aos pontos de dados atuais com a função polinómica de quinta ordem. Aplique os dados instalados clicando no botão Usar como personalizado e verificar a caixa de seleção. A etapa de atraso será ajustada automaticamente em diferentes comprimentos de onda de acordo com a curva de atraso instalada.
    14. Salve todos os dados de atraso em um arquivo de texto, que podem ser carregados para uso futuro.

3. Preparação cirúrgica do rato para fluorescência in vivo e imagem srs

  1. Esterilize todas as ferramentas necessárias, incluindo bisturis, tesouras de mola, fórceps, tampas e almofadas de gaze.
  2. Desinfetar todas as superfícies, que seriam tocadas durante a cirurgia com 70% de etanol. Cubra a área de trabalho do banco com cortinas estéreis. Coloque uma almofada de aquecimento sob a cortina.
  3. Use Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 camundongos transgênicos que expressam proteína de fluorescência amarela aprimorada (EYFP) em neurônios aferentes de gânglio dorsal para imagem da medula espinhal in vivo . Pesar o camundongo e induzir a anestesia por injeção intraperitoneal (i.p.) da mistura cetamina-xilazina (87,5 mg kg-1 e 12,5 mg kg-1).
  4. Aperte o dedo do mouse para garantir anestesia profunda. Suplemente com metade da dose original dos anestésicos, se necessário. Aplique pomada nos olhos do rato para evitar o ressecamento da córnea.
  5. Raspe o cabelo na parte de trás acima da coluna torácica e, em seguida, remova completamente o cabelo usando creme de depilação. Desinfete a área raspada com solução de iodo.
  6. Faça uma pequena incisão midline (~1,5 cm) da pele sobre a vértebra T11-T13 com um bisturi.
  7. Incisar músculos e tendões tanto em cima quanto em lados da vértebra T11-T13 com tesouras de mola e fórceps. Exponha as três vértebras adjacentes. Use gazepads estéreis e soro fisiológico estéril para controlar o sangramento e limpar o local cirúrgico.
  8. Estabilize a coluna vertebral com a ajuda das duas barras laterais de aço inoxidável em um estágio de estabilização personalizado (Figura 2B).
  9. Use um fípnico número 2 para realizar uma laminectomia em T12. Use cuidadosamente o pedacinho para quebrar a peça de lamina por peça até que toda a lâmina da vértebra T12 seja removida.
  10. Lave o sangue sobrevoando a medula espinhal com soro fisiológico estéril e use a almofada de gaze para absorver o excesso de fluido. Aplique pressão no local do sangramento com um pedaço de gaze para controlar o sangramento.
  11. Coloque uma mancha de cobertura (22 x 22 mm) na barra de fixação e encha o interespaço entre a tampa e a medula espinhal com soro fisiológico.

4. In vivo TPEF-SRS imagem de medula espinhal do rato

  1. Monte o estágio de estabilização em um estágio de cinco eixos abaixo do microscópio TPEF-SRS.
    NOTA: O estágio de cinco eixos permite a tradução de três eixos e o movimento de flexão de arremesso e rolo de ±5°.
  2. Fixar a cabeça do mouse com duas barras de cabeça e baixar a placa de retenção para oferecer espaço suficiente para o movimento do peito durante a respiração, aliviando artefatos de movimento.
  3. Insira uma almofada de aquecimento sob o mouse para manter o mouse aquecido durante a imagem.
  4. Ajuste o estágio translacional z para ajustar o foco até que a imagem de campo brilhante da vasculatura da medula espinhal possa ser observada sob um objetivo de 10x.
  5. Localize a veia dorsal da medula espinhal no centro do FOV afinando o estágio translacional de dois eixos do estágio de cinco eixos.
  6. Sintonize os ângulos de rolo e tom do estágio de cinco eixos para ajustar a superfície dorsal da medula espinhal perpendicular ao eixo objetivo com base na imagem de campo brilhante.
  7. Substitua o 10x por um objetivo de imersão de água de 25x para imagens TPEF-SRS.
  8. Defina o comprimento de onda do feixe fs para 920 nm. Sintonize a potência do feixe fs para ser de 10 mW na amostra.
  9. Coloque o comprimento de onda do feixe da bomba para 796 nm. Sintonize a potência da bomba e do feixe de Stokes a 60 mW e 75 mW na amostra, respectivamente.
    NOTA: A imagem srs da medula espinhal é realizada no número de ondas de 2863,5 cm-1, o que corresponde ao pico raman de baias de mielina na região carbono-hidrogênio com base no espectro SRS medido7,9. A potência do laser é determinada para garantir imagens TPEF-SRS de alta resolução da medula espinhal. Os danos teciduais não são observados nas condições atuais de imagem.
  10. Para imagens SRS, selecione PBS acima do objetivo usando uma nadadeira motorizada pressionando o botão Switch conectado à nadadeira motorizada.
  11. Defina os parâmetros de imagem da seguinte forma: 512 x 512 pixels para 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel de tempo de moradia, 2 μs de tempo constante.
  12. Comece a digitalizar a amostra e coloque o foco na superfície dorsal da medula espinhal.
  13. Ajuste bem o estágio de atraso pelo software de controle OPO até que o sinal máximo de SRS da medula espinhal seja alcançado.
    NOTA: Amostras biológicas podem induzir dispersão cromática extra, o estágio de atraso pode exigir ser ajustado para otimizar a sincronização temporal. No entanto, quando a imagem srs é realizada perto da superfície superior do tecido, a diferença temporal dos dois pulsos de laser introduzidos pelo tecido biológico e a janela de imagem é geralmente pequena (menos de várias centenas de fs).
  14. Para imagens TPEF, selecione o espelho dicroico D2 acima do objetivo usando uma nadadeira motorizada pressionando o botão Switch conectado à nadadeira motorizada.
  15. Defina os parâmetros de imagem e comece a digitalizar a amostra. Para capturar a pilha de imagens TPEF-SRS, adquira as imagens TPEF e SRS sequencialmente com um intervalo de 1 s na mesma profundidade antes de ir para a próxima profundidade. Os parâmetros de imagem para imagens TPEF são 512 x 512 pixels, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs de tempo de moradia.
  16. Remova o animal da fase de estabilização depois que todas as imagens forem coletadas.
  17. Limpe o tecido exposto lavando soro fisiológico e absorva o excesso de fluido usando uma almofada de gaze. Aplique gel de silicone na medula espinhal exposta e espere ~5 minutos até que ele fique curado.
  18. Sutura a pele com sutura cirúrgica nº 6-0 para fechar a ferida. Aplique creme de queimado na pele do local cirúrgico para prevenir a infecção. Administrar tratamento analgésico subcutâneamente (0,1 mg/kg buprenorfina).
  19. Coloque o animal em uma gaiola limpa e coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento até que o rato se recupere totalmente da anestesia.
  20. Repita a administração analgésico a cada 12 horas durante 3 dias após a cirurgia.
  21. Feche o obturador de OPO e fs laser. Coloque ao máximo a potência da bomba e o feixe de Stokes.
    NOTA: Definir a potência máxima antes de desligar o laser é benéfico para a manutenção do laser.
  22. Defina o comprimento de onda do feixe da bomba e fs laser para 800 nm.
  23. Defina os dois lasers em prontidão, feche todo o software de controle eletrônico e desligue todos os equipamentos associados.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

A imagem dual-modal in vivo de axônios espinhais, bem como baiatas de mielina é conduzida usando os camundongos transgênicos Thy1-YFPH, que expressam EYFP em neurônios aferentes neurônios aferentes de gânglios de raiz dorsal (Figura 3). Estes neurônios rotulados retransmitem as informações sensoriais do nervo periférico para a medula espinhal, com o ramo central localizado na coluna dorsal da medula espinhal. Com o microscópio TPEF-SRS, a baátima de mielina densamente di...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Neste protocolo, a configuração básica do microscópio TPEF-SRS é descrita em detalhes. Para a imagem srs, os feixes de bomba e Stokes são temporalmente e espacialmente sobrepostos dentro do OPO. No entanto, essa sobreposição pode ser interrompida após passar pelo sistema de microscópio. Portanto, tanto a otimização espacial quanto temporal da colocalização das vigas da bomba e dos feixes de Stokes é necessária e fundamental para alcançar a imagem ótima do SRS. O atraso temporal entre a bomba e o feixe ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar e não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong através de subsídios 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, a Comissão de Inovação e Tecnologia (ITCPD/17-9), a Área de Excelência do Comitê de Subsídios Universitários (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) e a Universidade de Ciência & Tecnologia de Hong Kong (HKUST) através da concessão RPC10EG33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
#2 ForcepsDumont11223-20For laminectomy
10X objectiveNikonCFI Plan Apo Lambda 10X
25X objectiveOlympusXLPLN25XSVMP2
Burn creamBetadine
CameraSonyα6300
Current amplifierStanford researchSR570
Current photomultiplier modulesHamamatsuH11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirrorSemrockFF665-Di02-25x36For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirrorEdmund69-206For separating SRS from TPEF detection path
Depilating creamVeet
FS1 975 nm short-pass filterEdmund86-108For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filterSemrockFF01-850/310For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filterSemrockFF01-525/50For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filterSemrockFF01-715/SP-25For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plateThorlabsSAHWP05M-1700
High-speed photodetectorMenloSystemsFPD 310-FFor checking Stokes beam modulation
IodineBetadine
IR ScopeFJWFIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
IrisThorlabsCPA1
L1ThorlabsAC254-060-B-ML
L10ThorlabsLA4052-A
L2ThorlabsLA1422-B
L3ThorlabsAC254-050-B
L4ThorlabsAC254-060-B-ML
L7f=100 mm, AB coating
L8ThorlabsLA4874-A
L9ThorlabsAC254-035-B-ML
Lock-in amplifierAPE
MirrorThorlabsPF10-03-P01
Motorized flipperThorlabsMFF101/M
multifunctional acquisition cardNational InstrumentPCIe-6363
OscilloscopeTektronixTDS2012C
PhotodiodeAPEFor detecting SRS signal
Picosecond laser sourceAPEpicoEmerald
Polarizing beam splitterThorlabsCCM1-PBS252/M
Power meterNewport843-R
SalineBraun
Scan lens L5ThorlabsSL50-CLS2
Scanning mirrorCambridge Technology6215H
Silicone gelWorld Precision Inc.KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laserCoherentChameleon Ultra II
Tube lens L6ThorlabsTTL200-S8

Referências

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711(1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283(2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012(2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005(2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894(2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715(2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501(2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109(2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008(2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084(2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530(2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691(2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. Introduction to Optics. , Higher Education from Cambridge University Press. (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

BioengenhariaEdi o 178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados