Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Resumo

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Resumo

Invasão e propagação metastática de células cancerígenas são a principal causa de morte por câncer. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações de células cancerosas normalmente geram uma única medição de ponto final que não distingue entre subpopulações de células cancerosas com diferentes potenciais invasivos. Além disso, o microambiente tumoral consiste em diferentes células estrômicas residentes e imunes que alteram e participam do comportamento invasivo das células cancerosas. A invasão aos tecidos também desempenha um papel nas subpopulações de células imunes que se defendem de microrganismos ou eliminam células doentes das células parenchyma e endotelial durante a remodelação tecidual e angiogênese. A Análise Celular em Tempo Real (RTCA) que utiliza biosensores de impedância para monitorar a invasão celular foi um grande passo em frente além da medição do ponto final da invasão: isso fornece medições contínuas ao longo do tempo e, portanto, pode revelar diferenças nas taxas de invasão que são perdidas no ensaio de ponto final. Usando a tecnologia RTCA atual, expandimos matrizes de câmara dupla adicionando uma câmara adicional que pode conter células estrômicas e/ou imunes e permite medir a taxa de invasão sob a influência de fatores secretados de células estromais ou imunes co-cultivadas ao longo do tempo. Além disso, o design único permite desprender câmaras a qualquer momento e isolar a célula cancerígena mais invasiva, ou outras subpopulações celulares que estão presentes em misturas heterogêneas de isolados tumorais testados. Essas células cancerígenas mais invasivas e outras subpopulações celulares impulsionam a progressão maligna para doenças metastáticas, e suas características moleculares são importantes para estudos mecanicistas aprofundados, o desenvolvimento de sondas diagnósticas para sua detecção e a avaliação de vulnerabilidades. Assim, a inclusão de drogas de pequenas ou grandes moléculas pode ser usada para testar o potencial de terapias que visam o câncer e/ou subpopulações de células estromicas com o objetivo de inibir (por exemplo, células cancerosas) ou melhorar (por exemplo, células imunes) comportamento invasivo.

Introdução

A invasão celular é um processo importante que permite que as células cruzem barreiras de membrana de porão em resposta a pistas ambientais fornecidas por células estromas. É um passo crucial durante vários estágios de desenvolvimento para respostas imunes, cicatrização de feridas, reparação de tecidos e malignidades que podem progredir de lesões locais para cânceres invasivos e metastáticos¹. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações celulares normalmente geram uma única medição de ponto final ou requerem pré-rotulagem de células invasoras². A integração das técnicas de microeletrônica e microfluido é agora desenvolvida para detectar diferentes aspectos da biologia celular, como viabilidade, movimento e apego usando a impedância elétrica de células vivas em microeletrodos ^3,4. A medição de impedância permite uma avaliação não invasiva e quantitativa do status^{celular 3}. Aqui descrevemos uma matriz de três câmaras baseada no design do sistema RTCA (Real-Time Cellular Analysis, análise celular em tempo real) que foi desenvolvido pela Abassi et ^al.5. O conjunto de três câmaras permite a avaliação de células co-cultivadas sobre invasão celular e recuperação de células invasoras para análises adicionais ou expansão.

No sistema de analisador celular, as células invadem através de uma matriz extracelular revestida em uma membrana porosa e atingem uma matriz de eletrodos interdigitadas posicionada no lado oposto da barreira. À medida que as células invasoras continuam a prender e ocupar esta matriz de eletrodos ao longo do tempo, a impedância elétrica muda em paralelo. O sistema atual compreende uma placa de invasão e migração celular (CIM) de 16 poços com duas câmaras. O instrumento RTCA-DP (dual purpose cell analyzer a partir de agora) contém sensores para medição de impedância e software integrado para analisar e processar os dados de impedância. Os valores de impedância na linha de base dependem da força iônica da mídia nos poços e são alterados à medida que as células se ligam aos eletrodos. As mudanças de impedância dependem do número de células, sua morfologia, e até que ponto as células se ligam aos eletrodos. Uma medição dos poços com mídia antes que as células sejam adicionadas é considerada como o sinal de fundo. O fundo é subtraído de medidas de impedância depois de atingir o equilíbrio com células anexando e se espalhando para os eletrodos. Um parâmetro sem unidade do status das células em um índice celular denominado eletrodo (IC) é calculado da seguinte forma: IC = (impedância após equilíbrio - impedância na ausência de células) / valor de impedância nominal⁶. Quando as taxas de migração de diferentes linhas celulares são comparadas, o CI Delta pode ser usado para comparar o status da célula, independentemente da diferença de apego representada nas primeiras medições.

O recém-projetado array de três câmaras se baseia no design existente e usa a câmara superior do sistema de analisador de células de dupla finalidade que contém os eletrodos. As câmaras média e inferior modificadas são adaptadas para encaixar o conjunto no analisador de células de dupla finalidade para medição e análise de impedância usando o software integrado. Os dois principais avanços que o novo projeto proporciona sobre a placa CIM de duas câmaras existente (chamada placa analisador de células a partir de agora) são: i) a capacidade de recuperação e, em seguida, analisar subpopulações celulares invasivas que estão presentes em misturas de células heterogêneas e ii) a opção de avaliar o impacto de fatores secretados de células estromes ou imunes co-cultivadas na invasão celular (Figura 1).

Essa tecnologia pode ser útil no estudo das subpopulações de células com diferentes capacidades invasivas. Isso inclui (a) células cancerígenas invasivas que invadem tecidos ou sangue ao redor e vasos linfáticos ou extravasados em locais de semeadura metastática em órgãos distantes, (b) células do sistema imunológico que invadem tecidos para combater patógenos ou células doentes, (c) células endoteliais que invadem tecidos para formar novos vasos sanguíneos durante a reorganização tecidual ou cicatrização de feridas, assim como (d) células estromas do microambiente tumoral que suportam e invadem junto com células cancerígenas. A abordagem permite a inclusão de conversas cruzadas estromicas que podem modular a motilidade celular e a invasão. Os estudos de viabilidade aqui mostrados utilizam este conjunto modificado focado na invasão de células cancerosas e na interação com o estroma como um sistema modelo, incluindo a invasão endotelial em resposta a sinais diferenciais de células cancerosas. A abordagem pode ser extrapolada para isolar células cancerígenas e outros tipos de células, como subpopulações de células imunes, fibroblastos ou células endoteliais. Testamos linhas invasivas e não invasivas estabelecidas células cancerígenas de mama como prova de princípio. Também usamos células da invasão de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) em resposta às células imunes da medula óssea humana para mostrar viabilidade para uso futuro também em ambientes de diagnóstico clínico. PDX são tecidos tumorais do paciente que são implantados em camundongos imunocomprometidos ou humanizados para permitir o estudo do crescimento, progressão e opções de tratamento para o paciente original ^7,8.

Protocolo

O estudo foi revisado e considerado como "isento" pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Georgetown (IRB # 2002-022). Os tecidos de medula óssea recém-colhidos foram coletados a partir de filtros descartados de coleta de medula óssea humana saudável que haviam sido desidentificulados.

1. Novo desenho de câmara (Figura 2)

1. Abra uma nova placa de analisador de células de câmara dupla. Reserve a câmara superior com eletrodos.
2. Usando uma máquina de fresar, raspe 2 mm dos poços inferiores em forma de U da placa analisadora de células.
3. Conecte uma membrana de 2 cm x 7 cm de poliethersulfone (PES) com tamanho de poros de 0,2 μm na parte inferior dos poços raspados usando adesivo com curadoria UV. Deixe 30 minutos de cura para garantir que a cola esteja completamente curada e inerte.
4. Usando uma máquina de fresar, corte duas fendas longitudinais (1,5 mm x 5,6 mm) ao longo dos lados para encaixar nos cumes da terceira câmara recém-fabricada.
5. Utilizando uma máquina de fresar, crie uma terceira câmara de policarbonato que replica as dimensões gerais da placa analisadora celular; 72 mm x 18 mm (Tabela de Materiais).
6. Crie poços de 4,8 mm de profundidade e 4,75 mm de diâmetro para replicar o design de 16 poços da placa analisadora de células. Isso permite 90 μL de volume por poço.
7. Nas laterais, crie dois cumes triangulares para que a câmara se bloqueie nas fendas originais criadas na etapa 1.4. A parte horizontal do triângulo é de 1,5 mm, a vertical é de 1,4 mm, e a hipotenusa é de 2.052 mm.
8. Crie um botão no lado curto de 50,8 mm de diâmetro e 1.397 mm de altura para caber no entalhe da placa original (Figura 2, Médio).
9. Use uma arruela de borracha de 0,9 mm de espessura para cada poço para fornecer um ajuste selado.

2. Cultura celular (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasts)

1. Lave culturas celulares aderentes (~70% de confluência) com soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (PBS).
2. Adicione 0,05% de solução trypsin-EDTA para levantar as células.
3. Neutralizar a solução de trippsina com meios de cultura celular contendo soro e contar as células usando uma alíquota da suspensão celular.
   NOTA: Os meios de cultura celular específicos podem ser encontrados na Tabela 1.

3. Dissociação de xenoenxerto derivada do paciente

1. Pique uma peça de tumor fresca (1 cm²) em mingau fino usando um bisturi estéril.
2. Coloque em um tubo cônico de 50 mL com 20 mL de mídia DMEM F12 complementada com trippsina de 3 mg/mL e colagenase de 2 mg/mL.
3. Incubar em um agitador térmico (150 RPM) a 37 °C por 20 min.
4. Gire o tubo a 500 x g por 5 min; remover o supernatante.
5. Adicionar 20 μL de DMEM F12 + 2% FBS para lavar as células; gire a 300 x g por 5 min e remova o supernatante. Repita lavar mais duas vezes.
6. Resuspend em 1 mL de mídia PDX (Tabela 1) para contar as células.

4. Extração de células de medula óssea

1. Lave o filtro de coleta de medula óssea (BM) com 25 mL de 1x PBS.
   NOTA: Neste estudo, a PBS foi adicionada a um filtro de coleta de BM usado do hospital para coletar o BM restante no filtro.
2. Adicione o BM lavado lentamente a um tubo cônico de 50 mL com 25 mL de gradiente de densidade, tomando cuidado para manter as camadas o mais separadas possível.
3. Gire a 800 x g por 20 min a 18 °C
4. Sifão das camadas superiores após centrifugação (gordura/plasma) e transfira 5 mL da camada branca acima do meio gradiente de densidade que tem as células BM para um tubo cônico de 15 mL.
   NOTA: Alternativamente, mergulhe uma pipeta de 5 mL na camada superior até tocar a camada média (BM) e a pipeta para fora da camada média muito lentamente sem mover a pipeta.
5. Encha o tubo cônico de 15 mL com 1x PBS (~10 mL) e gire a 300 x g por 15 min.
6. Remova o supernante; a pelota branca restante é a BM.
7. Se os glóbulos vermelhos forem observados na pelota, adicione 5 mL de solução de lise RBC (Tabela de Materiais) e deixe-o sentado por 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Gire a 300 x g por 5 min e remova o supernaspe.
8. Adicione 10 mL de 1x PBS para lavar as células, gire a 300 x g por 5 min e remova o sobrenante. Repita a lise RBC (passo 4.7) até que a pelota esteja branca.

5. Semeadura e montagem de células

1. Coloque as três câmaras estéreis na capa da cultura tecidual.
2. Localize o botão no lado curto da câmara inferior. Oriente a câmara inferior para que o botão esteja voltado para o experimentador.
3. Adicione 30.000-50.000 células em 90 μL de mídia a cada poço da câmara inferior. Evite formar bolhas. Estas são as células estromal que fornecerão fatores secretos, mas não serão detectadas pelos eletrodos da câmara superior.
4. Use 5% de mídia bovina bovina-suplementada em dois poços de câmara inferior como um controle positivo para motilidade celular. Use 0% de mídia suplementada por soro como controle negativo.
5. Deixe a câmara inferior com as células sentar por 10-15 minutos no capô para resolver.
   NOTA: Esta etapa é recomendada se as células forem aderentes ou crescerem em suspensão.
6. Gire a câmara inferior a 90° e coloque a câmara do meio em cima para que o botão na câmara inferior deslize para o entalhe na câmara do meio.
   NOTA: O botão na câmara inferior e o ponto azul na câmara do meio estão em extremidades opostas da montagem.
7. Empurre verticalmente para baixo até que um som de clique seja ouvido de cada um dos lados longos da montagem.
8. Adicione 160 μL de mídia sem soro a todos os poços da câmara do meio.
9. Certifique-se de que um menisco em forma de cúpula seja visível após o preenchimento dos poços; caso contrário, ajuste o volume final com base na calibração da pipeta. Evite formar bolhas.
10. Coloque a câmara superior com eletrodos voltados para a câmara do meio, certificando-se de alinhar os pontos azuis nas câmaras média e superior.
11. Empurre verticalmente para baixo até que um som de clique seja ouvido de cada um dos lados longos da montagem.
12. Adicione 25-50 μL de mídia sem soro à câmara superior.
13. Monte o conjunto no analisador de células de dupla finalidade na incubadora de cultura tecidual e espere por 30 minutos antes de medir o fundo.
    NOTA: Este tempo é necessário para equilibrar a matriz e pode ser usado para preparar as linhas de celular a serem adicionadas à câmara superior.
14. Meça o fundo (ver seção 6) e coloque a montagem de volta na capa da cultura tecidual.
15. Adicione 30.000-50.000 células em 100 μL de mídia sem soro a cada poço da câmara superior. Estas são as células que o eletrodo detectará assim que migrarem com sucesso através da membrana.
    NOTA: Para obter a máxima resposta, recomenda-se cultivar células em mídia sérico livre de soro ou baixo por 6-18 h antes de realizar o ensaio.
16. Deixe a montagem ficar no capô por 30 minutos antes de montar no analisador de célula de dupla finalidade para medição de impedância.

6. Medição de fundo e impedância

1. Coloque a matriz no berço no instrumento analisador de células de duplo propósito.
2. Abra o software do analisador de células e selecione o berço a ser usado.
3. Clique na guia Mensagem e certifique-se de que diz que as conexões OK para garantir que a matriz esteja bem colocada no berço e os eletrodos estejam bem alinhados com os sensores.
4. Clique na guia Notas de experimento e preencha o máximo de informações sobre o experimento possível.
5. Clique na guia Layout e preencha a descrição do layout do array.
6. Clique na guia Agendar e adicione duas etapas do menu Passos ; um passo de fundo (uma varredura) e uma etapa de teste com 100 varreduras a cada 15 minutos, totalizando 25 h.
7. Depois que a matriz estiver na incubadora de células de duplo propósito por 30 minutos, clique no botão Reproduzir para iniciar a medição de fundo. Uma janela pedindo para escolher a pasta para salvar os dados aparecerá.
8. Depois que a medição de fundo for feita, remova a matriz do berço e coloque-a de volta na capa de cultura celular.
9. Adicione células à câmara superior, conforme descrito na etapa 5.13, e mantenha a montagem na capa de cultura tecidual por 30 minutos para as células se instalarem.
10. Coloque o array de volta no analisador de células de duplo propósito e verifique a guia Mensagem para a mensagem Conexões OK .
11. Clique no botão Reproduzir para iniciar a medição de impedância.
12. Clique na guia Plot para monitorar o progresso do sinal.
13. Se o ponto final for atingido antes das 25h, clique na etapa abortar do menu suspenso execute .
14. Para exportar dados, clique com o botão direito do mouse no gráfico, escolha Copiar no formato de lista e, em seguida, cole os dados em uma planilha.
    NOTA: Os dados podem ser exportados como índice celular ou índice de célula delta. As informações de gráfico e/ou layout também podem ser escolhidas para exportação.

7. Desprendimento e coleta de células

1. Monitore a taxa de migração em tempo real no analisador de células de dupla finalidade para determinar o ponto de parada de juros (6-18 h).
   NOTA: O ponto de parada depende da taxa de invasão da célula e quando um sinal de invasão distinto do controle negativo é alcançado.
2. Uma vez alcançado, desmonte o conjunto do analisador celular de duplo propósito e coloque-o na capa da cultura tecidual.
3. Prepare um número apropriado de tubos de microcentrifuuagem de 1,5 mL para coletar as células dos poços de interesse.
4. Coloque o conjunto em um prato de 10 cm para conter líquidos quando as câmaras se soltarem.
5. Empurre as extremidades flexíveis de estalo no lado longo da câmara do meio para dentro até que um som de clique seja ouvido.
6. Desmonte a câmara superior e inverta-a em um novo prato de 10 cm.
7. Use um levantador de células com uma lâmina de 13 mm para coletar as células de todos os poços que abrigam a mesma condição experimental (ou seja, tipo celular, tratamento medicamentoso, etc.).
   NOTA: Projete a configuração para ter pelo menos dois poços para cada condição experimental para obter mudanças estatisticamente significativas de controles negativos.
8. Enxágüe ou mergulhe a lâmina em 1x salina tamponada de fosfato para coletar as células em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
9. Gire as células a 500 x g por 5 min.
10. Propague as células coletadas (ver seção 8) ou realize análises de ponto final, como RNA-seq unicelular.
    NOTA: Para RNA-seq a granel, use um kit de extração de RNA de número de celular baixo.

8.3D propagação e recuperação celular

NOTA: Devido ao pequeno número de células coletadas, semeou as células em 3D usando uma matriz extracelular (ECM) para melhorar a viabilidade. Dito isto, a cultura 2D também é uma opção neste momento, especialmente se as células utilizadas são de linhas celulares estabelecidas.

1. Descongele uma alíquota da matriz de membrana do porão a 4 °C durante a noite. Mantenha a matriz de membrana do porão no gelo até estar pronto para usar.
2. Adicione 25 μL de matriz de membrana fria do porão à pelota de células vivas coletadas e suavemente pipeta para cima e para baixo para misturar. Evite formar bolhas.
3. Adicione a mistura de matriz de membrana célula-porão ao fundo de uma pequena cultura tecidual bem (ou seja, em uma placa de 96 poços), formando uma cúpula. Tente não tocar nas paredes do poço. Incubar a 37 °C por 20 min antes de adicionar suavemente 100 μL de mídia dropwise.
4. Para recuperar células, aspire a mídia e adicione 100 μL de despase a cada poço.
5. Incubar na RT por 10 minutos, pipetting para cima e para baixo ocasionalmente.
6. Transfira as células e a matriz de membrana do porão dissolvida em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Adicione 1 mL de 1x PBS, gire a 300 x g por 5 min e remova o supernasciente. Repita a lavagem uma vez.
7. Aspire o supernatante. Divida as células na pelota ou realize a análise do ponto final.

Resultados

Usando a matriz recém-projetada de três câmaras, a invasão das células foi testada na presença ou ausência de células estromas, como os fibroblastos. A invasão celular MDA-MB-231 foi reforçada quando os fibroblastos 3T3 suíços irradiados (cepa J2) foram semeados na câmara inferior, permitindo a troca de fatores entre as duas linhas celulares. Curiosamente, a invasão MDA-MB-231 aumentou quando as células 3T3-J2 foram duplicadas em número (Figura 3A). Por outro lado, a taxa de ...

Discussão

Modificamos o projeto de uma matriz de câmara dupla para incluir uma terceira câmara para monitorar a invasão celular em tempo real na presença de células estromicas. Observamos efeitos distintos de fibroblastos co-cultivados em células cancerígenas invasivas e não invasivas indicando que a matriz pode ser usada para distinguir entre subpopulações de células cancerosas que respondem de forma diferente aos fatores produzidos por células estrogonais co-cultivadas. A matriz também foi usada para monitorar a inv...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25300-054
Adhesive	Norland Optical Adhesive	NOA63
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell lifter	Sarstedt	83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
CIM-plate	Agilent	5665817001	Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Horse serum (HS)	Gibco	16050-122
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)	Thermofisher	51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution	Sigma	C8052
J2 Fibroblasts	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel	Corning	354230	Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells	RRID:CVCL_0062
Milling machine			Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x)	Thermofisher	10010049
Polyethersulfone (PES) membrane	Sterlitech	PCTF029030
RBC lysis solution	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
RTCA DP analyzer	Agilent	3X16	Dual purpose cell analyzer
Trypsin	Sigma	T4799