In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

Resumo

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

Resumo

Como vertebrado, o zebrafish tem sido amplamente utilizado em estudos biológicos. Zebrafish e humanos compartilham alta homologia genética, o que permite seu uso como modelo para doenças humanas. O estudo da função gênica baseia-se na detecção de padrões de expressão gênica. Embora a imunohistoquímica ofereça uma maneira poderosa de avaliar a expressão de proteínas, o número limitado de anticorpos comercialmente disponíveis em zebrafish restringe a aplicação de costaína. A hibridização in situ é amplamente utilizada em embriões de peixe-zebra para detectar a expressão de RNAm. Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica para cortes de embriões de peixe-zebra. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. A imuno-histoquímica e a obtenção de imagens de uma única criossecção foram realizadas após hibridização in situ . O protocolo é útil para desvendar o padrão de expressão de dois genes, primeiro pela detecção in situ do transcrito e depois pela imunohistoquímica contra uma proteína na mesma seção.

Introdução

O zebrafish é um poderoso modelo de vertebrado para estudos de desenvolvimento e^genética1,2. Zebrafish e humanos compartilham alta homologia genética (70% dos genes são compartilhados com o genoma humano), o que permite seu uso como modelo para doenças humanas³. No peixe-zebra, é bastante comum detectar os padrões de expressão de dois genes e sua relação espacial. A imuno-histoquímica foi utilizada pela primeira vez em 1941 para detectar patógenos em tecidos infectados por meio da aplicação de anticorpos marcados com FITC⁴. A proteína-alvo na seção de tecido é primeiramente marcada com um anticorpo primário, e a seção é então marcada com um anticorpo secundário contra a imunoglobulina da espécie hospedeira do anticorpo primário. A coloração de anticorpos é uma abordagem robusta para detectar a localização de proteínas, que oferece alta resolução óptica em nível intracelular. No entanto, o número de anticorpos disponíveis é muito limitado em peixes-zebra. Um estudo recente mostra que aproximadamente 112.000 anticorpos estão comercialmente disponíveis para camundongos; no entanto, muito poucos anticorpos demonstraram ser confiáveis em zebrafish⁵.

Em vez disso, em peixes-zebra, a hibridização in situ tem sido amplamente aplicada para análise de padrões de expressão gênica. Esse método foi utilizado pela primeira vez para avaliar a expressão gênica em embriões de Drosophila ^{na década de} 19806,7 e, desde então^, essa tecnologia vem sendo continuamente desenvolvida e aprimorada. Inicialmente, sondas de DNA radiomarcadas foram usadas para detectar transcritos de RNAm; no entanto, a resolução espacial foi relativamente baixa, e houve riscos potenciais à saúde causados pela radioatividade. Posteriormente, a hibridização in situ depende das sondas de RNA marcadas com digoxigenina (DIG) ou fluoresceína (Fluo), que são conjugadas à fosfatase alcalina (FA) ou detectadas por amplificação fluorescente do sinal da tiramida (TSA)^8,9. Embora a TSA tenha sido usada para detectar dois ou três genes, a marcação DIG de sondas de RNA e o anticorpo conjugado antiDIG AP ainda são abordagens altamente sensíveis, estáveis e amplamente utilizadas para hibridização in situ. Portanto, anticorpos comercializados combinados com sondas in situ marcadas com DIG são úteis para fornecer informações sobre a localização e expressão de proteínas de um gene.

Embriões de montagem total não podem revelar a relação espacial entre genes devido à baixa resolução óptica, embora os embriões de peixe-zebra sejam pequenos e transparentes¹⁰. Assim, o corte é necessário para analisar os padrões de expressão de genes em nível intracelular. A criossecção tem sido amplamente utilizada em peixes-zebra, pois é de fácil execução e pode efetivamente preservar o antígeno. Portanto, a hibridização in situ combinada com imunohistoquímica em criossecções de peixe-zebra oferece uma maneira poderosa de analisar os padrões de expressão de dois genes. Uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica foi aplicada ao zebrafish¹¹. No entanto, o tratamento com proteinase K foi usado para aumentar a penetração da sonda em detrimento da integridade do antígeno. Para superar essa limitação, este protocolo utiliza o aquecimento para induzir a recuperação antigênica. Este protocolo não só é aplicável a embriões de diferentes estágios e cortes de tecidos de várias espessuras (cortes de cabeça de 14 μm e cortes medulares de 20 μm), mas também foi verificado usando genes expressos em dois órgãos, incluindo a cabeça e a medula espinhal.

Este artigo descreverá como combinar hibridização in situ e coloração de anticorpos em embriões de zebrafish em criossecções. A versatilidade deste protocolo é demonstrada pelo uso de várias combinações de hibridização in situ-imunohistoquímica, incluindo sondas de hibridização in situ para dois neurônios diferentes. Este método é adequado para detectar mRNA e proteína em diferentes regiões e embriões de diferentes idades, bem como os padrões de expressão de dois genes.

Protocolo

Todos os protocolos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Nantong (nº S20191210-402).

1. Coleta de embriões de peixe-zebra

1. Configure um par de peixes-zebra em tanques de reprodução na noite anterior à coleta dos ovos, um peixe-zebra transgênico e o outro um peixe-zebra selvagem AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type ou Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (veja a Tabela de Materiais). Use uma divisória de plástico diagonal para separar o macho e a fêmea para impedir o acesso físico. No dia seguinte, encaixe a parte superior do tanque de reprodução em uma parte inferior limpa cheia de água doce e remova o divisor do tanque de reprodução. Deixe o peixe acasalar por 10-20 min, e colete os ovos depois que eles afundaram no fundo do tanque de reprodução.
2. Cultivar os embriões em meio embrionário E3 (ver Tabela de Materiais) contendo azul de metileno (1 mL de azul de metileno a 0,05% em 1 L de meio embrionário E3) a 28,5 °C.
3. Tratar os embriões 24 h após a fertilização (hpf) com feniltioureia (PTU, ver Tabela de Materiais) para evitar a formação de pigmentos.
   NOTA: Animais de ambos os sexos são usados em experimentos.

2. Hibridização in situ

NOTA: A água utilizada para os passos 2.1-2.11 é a água tratada com pirocarbonato de dietilo (DEPC) (consulte a Tabela de Materiais).

1. Fixar ~10 embriões com 0,5-1 mL de paraformaldeído fresco a 4% (PFA, veja a Tabela de Materiais) em um tubo de microfuga de 1,5 mL a 4 °C durante a noite por 12-14 h.
   NOTA: O protocolo para hibridização in situ é ligeiramente modificado em relação à literatura previamente^publicada12. O PFA deve ser preparado na hora e armazenado a 4 °C no prazo de uma semana após a utilização ou durante um mês a -20 °C. Todas as etapas seguintes de hibridização in situ foram realizadas utilizando tubos de microfuga de 1,5 mL.
2. Use pinças para remover a pele apenas de embriões com mais de 48 hpf.
   NOTA: A pele é removida para facilitar a penetração de sondas de RNA na região do tronco de embriões com mais de 48 hpf.
3. Desidratar gradualmente os embriões lavando com metanol a 25%, 50% e 75% em solução salina tamponada com fosfato contendo Tween-20 a 0,1% sucessivamente (PBST, ver Tabela de Materiais) por 5 min cada à temperatura ambiente. Em seguida, lavar os embriões por 5 min em metanol 100% à temperatura ambiente. Incubar os embriões em metanol a 100% a -20 °C durante pelo menos a noite durante 12-14 horas.
   NOTA: Embriões desidratados podem ser armazenados em metanol 100% a -20 °C por 6 meses.
4. Reidratar gradualmente os embriões lavando com 75%, 50% e 25% de metanol em PBST sucessivamente por 5 min cada um à temperatura ambiente. Lavar o embrião três vezes com PBST por 5 min cada em temperatura ambiente.
5. Digerir os embriões com 10 μg/ml de proteinase K (ver Tabela de Materiais) em PBST à temperatura ambiente (ver Tabela 1).
6. Lave os embriões com PBST por 5 min. Execute esta etapa de lavagem três vezes.
7. Refixar os embriões lavados em PFA a 4% por 15 min à temperatura ambiente.
   NOTA: Esta etapa interrompe a digestão porque o PFA inativa a proteinase K. Certifique-se de que a amostra seja misturada suavemente para expor todos os embriões ao PFA; Os tubos podem ser colocados em seus lados para distribuir uniformemente os embriões na solução. Este PFA não precisa ser fresco (pode ser refrigerado por até 2 semanas).
8. Lave o embrião três vezes com PBST, incubando por 5 min durante cada lavagem.
9. Realizar a pré-hibridização dos embriões incubando com solução de pré-hibridização (preHYB, ver Tabela de Materiais) a 65 °C por 5 min. Substitua o preHYB por uma solução de hibridização (HYB, consulte a Tabela de Materiais) e pré-hibridize por pelo menos 4 h em HYB.
   NOTA: Antes de proceder à pré-hibridização, pré-aqueça as soluções a 65 °C. A formamida (ver Tabela de Materiais) é usada para manter a forma e a estrutura do tecido. A formamida também impede a ligação de fragmentos não homólogos a baixas temperaturas.
10. Aquecer a sonda (Insm1a ou 5-HT2C) em HYB durante 5 min a 95 °C antes de adicionar aos embriões. Use a sonda a 1 μg/mL HYB. Remova o máximo possível de preHYB sem deixar os embriões entrarem em contato com o ar e adicione sonda pré-aquecida em HYB ao tubo que contém os embriões.
    NOTA: Uma sonda de RNA marcada pode ser usada para hibridizar com uma sequência de mRNA alvo nos embriões. Portanto, a sonda pode ser usada para detectar a expressão de um gene de interesse e a localização do RNAm.
11. Permitir que a sonda hibridize durante a noite (12-14 h) a 50-70 °C.
    NOTA: A temperatura de hibridização difere para diferentes sondas.
12. No dia seguinte, aspirar a solução da sonda com uma pipeta e armazená-la em um tubo a -20 °C para que possa ser reutilizada muitas vezes.
13. Lave os embriões da seguinte forma:
    1. Lavar os embriões durante 15 min com 100% de HYB a 65 °C.
    2. Lavar os embriões sequencialmente com 75%, 50% e 25% de HYB em 2x citrato salino padrão contendo 0,1% de Tween-20 (SSCT, ver Tabela de Materiais) por 15 min cada a 65 °C.
    3. Lavar os embriões durante 15 min em 2x SSCT a 65 °C.
    4. Lavar os embriões durante 15 min em 0,2x SSCT a 65 °C.
14. Lavar os embriões duas vezes durante 10 minutos em tampão de ácido maleico contendo 0,02% de Tween-20 (MABT, ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente.
15. Bloquear os embriões hibridizados e lavados durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente com solução de bloqueio a 2% 1 (ver Tabela de Materiais).
16. Substitua a solução de bloqueio-1 por antidigoxigenina AP (diluição de 1:4.000, consulte a Tabela de Materiais) em uma solução de bloqueio de 2% nova-1 e agite durante a noite por 12-14 h a 4 °C.
17. Lavar os embriões quatro vezes por 30 min em MABT à temperatura ambiente.
    NOTA: Retire o BM roxo (consulte a Tabela de Materiais) da geladeira durante a terceira lavagem e agite-o ocasionalmente durante as lavagens subsequentes.
18. Lavar os embriões duas vezes por 10 min em NTMT (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, Tween-20 1%, ver Tabela de Materiais).
19. Use uma pipeta para remover o máximo possível de NTMT dos embriões. Substitua pelo substrato BM purple AP e core os embriões à temperatura ambiente no escuro. Monitore as mudanças de cor a cada 30 min para controlar o grau de tingimento.
    OBS: O tempo específico de tingimento é diferente e precisa ser ajustado de acordo com cada sonda. A incubação dos embriões a 37 °C pode acelerar a reação. A incubação dos embriões a 4 °C pode aumentar o tempo de reação e pode ser feita durante a noite.
20. Uma vez que é desenvolvido na extensão desejada, pare a reação enxaguando brevemente com NTMT duas vezes. Após hibridização in situ , enxaguar os embriões com PBST três vezes por 20 min.

3. Incorporação

1. Imergir os embriões em sacarose a 5% em 1x PBS (ver Tabela de Materiais) durante a noite durante 12-14 h a 4 °C.
2. Trocar a solução que cobre os embriões para 15% de sacarose em 1x PBS e incubar durante a noite por 12-16 h a 4 °C.
3. Trocar a solução que cobre os embriões para 30% de sacarose em 1x PBS e incubar por 1-2 dias a 4 °C.
   NOTA: Incubar nesta solução até que os embriões afundem no fundo do tubo.
4. Preencha um criomold com temperatura de corte ideal (OCT) (consulte a Tabela de Materiais). Transferir os embriões em sacarose a 30% para o criomolde com meio OCT. Mexa-os para retirar a sacarose dos embriões.
5. Transfira os embriões para um novo criomolde para tecido e preencha-o suavemente com meio OCT, evitando a formação de bolhas.
6. Submergir cada embrião, empurrando-o para o fundo do criomold, e colocar cada embrião na orientação desejada (dorso-ventral ou lateral). Mantenha os embriões em linha reta.
   NOTA: Recomenda-se vivamente a colocação de apenas um embrião em cada criomolde (ver Tabela de Materiais).
7. Coloque os embriões embebidos em criomoldes em banho de etanol de gelo seco.
8. Conservar a -80 °C pelo menos durante a noite durante 12-14 h.
   NOTA: Os criomoldes podem ser mantidos a -80 °C por pelo menos um mês.

4. Criosecção

1. Ajustar as criossecções com um criostato a -20 °C.
2. Retire o bloco da amostra do criomold e coloque-o no criostato. Coloque o meio OCT na base do mandril resfriado e coloque o bloco por cima.
3. Certifique-se de que o bloco da amostra esteja paralelo à lâmina de barbear. Corte cuidadosamente o excesso de meio OCT ao redor do espécime.
4. Corte em secções de 12-20 μm de espessura utilizando um criostato. Transfira rapidamente as seções para lâminas de vidro para que cada lâmina tenha de 3 a 4 seções. Permitir que as amostras atinjam a temperatura ambiente e armazenar as secções numa caixa deslizante selada a -80 °C para utilização posterior.

5. Imunomarcação

NOTA: A coloração GFP é realizada nas seções.

1. Lave as lâminas contendo as seções com PBS por 5 min.
2. Aqueça o tampão citrato para ferver no micro-ondas.
3. Coloque as lâminas no tampão e continue a aquecer para manter a solução perto da ebulição por aproximadamente 20 min.
   Observação : esta etapa ajuda na recuperação de antígeno. O tecido permanece intacto mesmo em altas temperaturas, o que melhora a qualidade da coloração, evitando dobramento, dano ou descolamento dos tecidos.
4. Deixe as amostras arrefecerem lentamente até à temperatura ambiente antes do passo seguinte. Escorra o excesso de solução, seque cuidadosamente a área ao redor de cada seção com um pedaço de tecido e desenhe um círculo ao redor da seção com uma caneta repelente de água (consulte a Tabela de Materiais) para formar uma barreira hidrofóbica. Tenha cuidado para não secar as seções de tecido.
5. Lave as lâminas duas vezes com PBS, incubando por 10 min durante cada lavagem.
6. Bloquear durante 2 h em solução de bloqueio-2 (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente.
7. Pipetar a solução de anticorpos primários (α GFP monoclonal de ratinho, 1:250, ver Tabela de Materiais) por lâmina e incubar as lâminas numa caixa húmida imunohistoquímica a 4 °C durante a noite.
8. Lave as lâminas três vezes com PBS, incubando por 10 min durante cada lavagem.
9. Drene o excesso de PBS. Incubar as lâminas com o anticorpo secundário apropriado (1:400, ver Tabela de Materiais) por 1 h à temperatura ambiente em PBS.
10. Lave as lâminas três vezes com PBS, incubando por 10 min durante cada lavagem.
11. Escorra o PBS excedente, pipete o meio de montagem no escorregador e monte com uma tampa deslizante.

Resultados

Este protocolo pode ser usado para examinar simultaneamente o padrão de expressão de um RNAm e uma proteína. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho experimental. O receptor 5-HT2C é um subtipo do receptor 5-HT ligado pelo neurotransmissor serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT). É amplamente distribuída no sistema nervoso central (SNC) e pode regular significativamente uma variedade de funções cerebrais, incluindo apetite, humor, ansiedade e comportamento reprodutivo^1...

Discussão

Este protocolo propõe uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica, um passo importante nos experimentos de colocalização em embriões de zebrafish. Este método serve como uma maneira fácil e eficiente de analisar simultaneamente um RNAm e uma proteína. Hibridização in situ e coloração de anticorpos foram realizadas em embriões de zebrafish. Em contraste com vários protocolos publicados^{anteriormente14,15,16,}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A