Um modelo de dano peritoneal induzido por gluconato de clorexidina em camundongos

Resumo

O presente protocolo estabelece um modelo de diálise peritoneal (DP) em camundongos de fibrose peritoneal induzida por gluconato de clorexidina (GC). O modelo atual é simples e fácil de usar em comparação com outros modelos animais de DP.

Resumo

A fibrose peritoneal é uma importante complicação da diálise peritoneal (DP). Para investigar e resolver esse problema, um modelo animal apropriado de DP é necessário. O presente protocolo estabelece um modelo de fibrose peritoneal induzida por gluconato de clorexidina (GC) que mimetiza a condição de um paciente com DP. A fibrose peritoneal foi induzida pela injeção intraperitoneal de 0,1% de GC em etanol a 15% por 3 semanas (administrada em dias alternados), totalizando nove vezes em camundongos C57BL/6 machos. Os testes funcionais peritoneais foram então realizados no 22º dia. Após o sacrifício dos camundongos, o peritônio parietal da parede abdominal e o peritônio visceral do fígado foram retirados. Eles eram mais espessos e fibróticos quando analisados microscopicamente após a coloração tricrômico de Masson. A taxa de ultrafiltração diminuiu, e o transporte de massa de glicose indicou um aumento da permeabilidade peritoneal induzido por CG. O modelo de DP assim estabelecido pode ter aplicações no aprimoramento da tecnologia de DP, eficácia dialítica e prolongamento da sobrevida dos pacientes.

Introdução

A diálise peritoneal (DP) é um tipo de terapia renal substitutiva. No entanto, a DP tem problemas que não podem ser resolvidos. Por exemplo, o tratamento prolongado da DP pode causar dano peritoneal, eventualmente levando à falha da ultrafiltração e à suspensão do tratamento 1,2,3,4,5,6. A fibrose peritoneal é uma das complicações mais^graves7,8. A fibrose peritoneal é caracterizada pela deposição e acúmulo de matriz extracelular no interstício, neoangiogênese e vasculopatia do peritônio9,10.

As principais causas dessas alterações peritoneais são as peritonites recorrentes e a não biocompatibilidade do dialisato, que são hiperosmóticas, glicose elevada, pH baixo e acúmulo de produtos da degradação da glicose^11,12. Portanto, modelos experimentais animais adequados podem ajudar os pesquisadores a estudar melhor as alterações fisiológicas e patológicas do peritônio durante a terapia da DP. Portanto, o estabelecimento de um modelo animal de DP é importante para melhorar a tecnologia de DP e a eficácia dialítica e prolongar a sobrevida dos pacientes. Este estudo teve como objetivo gerar um modelo de DP em camundongos por injeção intraperitoneal (i.p.) de gluconato de clorexidina (CG), conforme descrito anteriormente^13,14. Este modelo de camundongo PD é simples, fácil de usar e viável em comparação com outros modelos animais PD.

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Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Laboratory Animal Center do E-DA Hospital/ I-Shou University e manuseados de acordo com o "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (NRC, EUA 2011). Camundongos C57BL/6 machos, com 7-8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo.

1. Preparação química

1. Preparar o irritante químico diluindo gluconato de clorexidina a 0,1% (CG, ver Tabela de Materiais) em etanol a 15%.

2. Tratamento dos animais

1. Atribua três ratos como grupo de controle. Realizar injeção intraperitoneal (i.p.) de 1 mL/kg de solução fisiológica (SF) a 0,9% em dias alternados por 3 semanas, totalizando nove vezes.
2. Atribua três camundongos ao grupo de fibrose peritoneal. Induzir fibrose peritoneal usando gluconato de clorexidina (GC) administrando injeções i.p. de 0,1% de GC em etanol a 15% (passo 1.1) na dose de 12,5 μL/g de peso corporal. Realize isso a cada dois dias por 3 semanas, por um total de nove vezes.

3. Testes de função peritoneal (teste de equilíbrio peritoneal modificado)

1. Preparar uma solução de diálise contendo 4,25% de glicose. Extrair 0,5 ml de amostra de dialisato com uma seringa e, em seguida, verificar a concentração de glicose na amostra de dialisato.
   NOTA: A concentração de glicose é determinada de acordo com o método hexoquinase/G6PD. As amostras de dialisato foram acessadas para o ensaio de Glu 2 do tipo L e investigadas com um analisador bioquímico (ver Tabela de Materiais). Esta é a concentração inicial de glicose do dialisato.
2. Anestesiar os ratinhos por injeção intramuscular de Zoletil e Xilazina (preparados numa proporção de 1:2 por volume, ver Tabela de Materiais) na dose de 20 μL/20 gw. Além disso, use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento sob anestesia.
3. Realizar instilação i.p. da solução de diálise (2 mL/20 g de peso corporal).
4. Após 30 min, avaliar e verificar a profundidade da anestesia com ausência do reflexo de pinça dos dedos. Em seguida, realizar uma incisão vertical na linha média do abdome (abaixo do processo xifoide), em seguida, abrir o abdome dos camundongos e coletar o líquido intraperitoneal com uma seringa (definido como "volume 1"). Em seguida, meça o peso de um algodão limpo e seco e coloque o algodão na cavidade abdominal dos camundongos para absorver o líquido intraperitoneal residual. Por fim, meça novamente o peso do algodão.
   OBS: O ganho de peso do algodão é igual ao peso do líquido residual intraperitoneal. Em seguida, converta para o volume obtido (gravidade específica: 1 g/cm³; definido como "volume 2"). O volume final do dialisato é o volume 1 mais o volume 2.
5. Use 0,5 mL de amostra de dialisato (dialisato final) para medir a concentração de glicose. Esta é a concentração final de glicose do dialisato.
6. Calcule a ultrafiltração líquida usando a fórmula¹⁵:
   
7. Calcular a permeabilidade peritoneal utilizando a seguinte fórmula¹⁵:
   

4. Preparo tecidual do músculo da parede abdominal e fígado e análise histológica

1. Sacrificar os camundongos por punção cardíaca (flebotomia)^3,16.
2. Corte da parede abdominal (1 cm x 1 cm) e hepatectomia total. Fixe a parede abdominal e os tecidos hepáticos dos ratos durante a noite em formalina tamponada neutra a 10%.
3. Preparar cortes de parafina de 3 μm de espessura do músculo da parede abdominal e do fígado e realizar análise histológica seguindo relato publicado anteriormente¹⁷.
4. Avaliar o peritônio parietal da parede abdominal e o peritônio visceral das superfícies hepáticas dos camundongos utilizando morfometria¹⁸.
5. Realizar análises estatísticas usando estatística e software gráfico (consulte Tabela de Materiais). Expresse todos os dados como média ± DP e analise a significância estatística usando um teste t¹⁹. Defina valores com P < 0,05 como resultados significativos.

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Resultados

Na Figura 1A,B, o peritônio parietal da parede abdominal era marcadamente mais espesso e fibrótico pela coloração tricrômico de ^Masson17, indicando que no grupo exposto ao GC a fibrose peritoneal é mais grave do que no grupo controle com solução salina (NS). Na Figura 2A,B, o peritônio visceral das superfícies hepáticas também era marcadamente mais espesso e fibrótico, comprovando que no grupo GC-exposto a fi...

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Discussão

Neste estudo, um modelo de DP em camundongos é apresentado por injeção i.p. de GC, e os resultados mostraram fibrose peritoneal e deterioração funcional neste modelo, o que mimetizou a condição do paciente em DP.

Há várias etapas críticas no protocolo. Primeiro, para a realização de uma injeção i.p. de GC ou NS, a pele da parede abdominal do camundongo deve ser captada com fórceps para evitar lesão intraperitoneal induzida por punção. Em segundo lugar, durante a coleta do per...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline	Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan	-
10% neutral buffered formalin	Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan	00002A
Automatic biochemical analyzer	Hitachi Ltd., Tokyo, Japan	Labospect Series 008	for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O	Sigma-Aldrich, MO, USA	C9394	diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
Ethanol	Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA	BAKR8006-05	diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal)	Baxter International, Inc., IL, USA	FNB9896	Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assay	FUJIFILM Wako, Japan	461-32403
Xylazine 20	Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan	-
Zoletil 50	Virbac Laboratories, Carros, France	-