Análise e imagem de osteócitos

Resumo

Este estudo descreve o método para visualizar e desenvolver modelos tridimensionais (3D) de osteócitos dentro da rede lacunar-canalicular (LCN) para análise de dinâmica de fluidos computacional (CFD). Os modelos gerados usando este método ajudam a entender a mecanosensação dos osteócitos em ossos saudáveis ou doentes.

Resumo

Os osteócitos são as células ósseas que se acredita responderem a tensões mecânicas e tensão de cisalhamento de fluxo de fluido (FFSS), ativando várias vias biológicas em um processo conhecido como mecanotransdução. Modelos derivados de imagens confocais de redes de osteócitos são uma ferramenta valiosa para a realização de análises de Dinâmica de Fluidos Computacional (CFD) para avaliar tensões de cisalhamento na membrana dos osteócitos, que não podem ser determinadas por medição direta. A modelagem computacional usando essas imagens de alta resolução da arquitetura microestrutural do osso foi usada para simular numericamente a carga mecânica exercida no osso e entender a estimulação induzida pela carga dos osteócitos.

Este estudo elabora os métodos para desenvolver modelos 3D de osteócitos únicos usando imagens de microscópio confocal da Rede Lacunar-Canalicular (LCN) para realizar análises de CFD utilizando vários softwares de modelagem computacional. Antes da microscopia confocal, os ossos do camundongo são seccionados e corados com corante isotiocianato de fluoresceína (FITC) para marcar o LCN. Com resolução de 100x, as imagens Z-stack são coletadas usando um microscópio confocal e importadas para o software MIMICS (software de processamento baseado em imagem 3D) para construir um modelo de superfície do LCN e dos processos dendríticos dos osteócitos.

Essas superfícies são então subtraídas usando uma operação booleana no software 3-Matic (software de otimização de dados 3D) para modelar o espaço fluídico lacunar ao redor do corpo celular do osteócito e o espaço canalicular ao redor dos dendritos contendo fluido lacunocanalicular. A geometria volumétrica do fluido 3D é importada para o software ANSYS (software de simulação) para análise CFD. O ANSYS CFX (software CFD) é usado para aplicar carga fisiológica no osso como pressão de fluido, e as tensões de cisalhamento da parede nos osteócitos e processos dendríticos são determinadas. A morfologia do LCN afeta os valores de tensão de cisalhamento detectados pela membrana celular dos osteócitos e pelos processos celulares. Portanto, os detalhes de como os modelos baseados em imagens confocais são desenvolvidos podem ser valiosos para a compreensão da mecanosensação dos osteócitos e podem estabelecer as bases para estudos futuros nessa área.

Introdução

Postula-se que os osteócitos regulam a massa óssea em resposta ao exercício físico¹. A deformação da membrana dos osteócitos e seus processos dendríticos, devido à carga mecânica, os submete ao FFSS, que é detectado pelos osteócitos e desencadeia a sinalização intracelular ^2,3,4. A microestrutura óssea sofre deterioração ou alterações em sua morfologia lacunar-canalicular devido ao envelhecimento ou doenças ósseas, como osteoporose e diabetes, e em condições como deficiência de perlecan, que causa comprometimento da mecan-responsividade dos osteócitos ^5,6. Essas mudanças na arquitetura óssea fazem com que os osteócitos experimentem diferentes níveis de FFSS e cepas ^7,8. É importante ressaltar que o FFSS experimentado pelos osteócitos em resposta à carga mecânica é difícil de quantificar in vivo porque eles estão embutidos na matriz óssea calcificada.

A modelagem confocal baseada em imagens é uma técnica poderosa para superar as limitações do estudo de osteócitos inacessíveis em seu ambiente natural, replicando modelos computacionais do LCN ^9,10. Processar e modelar a rede interconectada de LCN em 3D tem sido um desafio. Existem várias técnicas de imagem, como microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura (MEV), seccionamento de face de bloco serial e microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focalizado em série (FIB/SEM)^2,11,12. Uma técnica valiosa foi desenvolvida para visualizar o osso 13,14,15 e gerar modelos de osteócitos 3D por meio de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). O CLSM foi escolhido aqui para modelagem computacional em vez de outras técnicas de imagem devido à sua capacidade de obter imagens de todo o volume da lacuna e da maioria dos canalículos em 3D^16,17. A geometria do LCN pode ser gerada usando CLSM para Análise de Elementos Finitos de Osteócitos (FEA) para prever deformações ósseas. No entanto, a análise de fluidos para prever o FFSS experimentado por osteócitos é mais complicada, pois requer modelagem da membrana celular do osteócito e seus dendritos dentro do LCN para permitir a modelagem do estreito espaço lacunar-canalicular, no qual o fluido intersticial se move¹⁸.

Neste protocolo, o corante isotiocianato de fluoresceína (FITC) é aplicado a seções ósseas espessas não descalcificadas antes da microscopia confocal para marcar o LCN dentro do osso, e as membranas dendríticas dos osteócitos são modeladas com base em dados de imagem do LCN. O espaço lacunar-canalicular é simulado usando modelagem computacional, e a carga fisiológica devido à atividade física é modelada usando uma abordagem CFD. Os osteócitos são submetidos a um gradiente de pressão de fluido no software CFD para analisar o perfil de fluido dentro do LCN e medir o FFSS nas membranas do osteócito e dendrítica. Além disso, uma abordagem FEA pode medir tensões ou tensões de osteócitos aplicando carga mecânica compressiva.

Uma técnica de modificação da geometria também foi desenvolvida para modificar as microestruturas derivadas de imagens de osso jovem e saudável, a fim de simular a morfologia lacunar-canalicular alterada em animais idosos ou com doença óssea. As alterações da microestrutura óssea incluíram a redução do número de canalículos com o envelhecimento, a redução da área do espaço lacunar-canalicular para modelar o que acontece na deficiência de perlecan e aumentá-la para modelar os efeitos do envelhecimento, e a redução da área da parede canalicular e dendrítica para modelar o osso diabético ^5,6. A técnica de modificação da geometria nos permite comparar FFSS experimentados por osteócitos em ossos com diferentes microestruturas, como jovens versus idosos ou ossos em animais saudáveis versus doentes.

No geral, a modelagem baseada em imagens confocais é uma ferramenta valiosa para simular a morfologia dos osteócitos no osso saudável, bem como nas alterações associadas ao envelhecimento/doença na morfologia dos osteócitos. Além disso, os parâmetros morfológicos dos osteócitos, como área de superfície e volume do espaço lacunar-canalicular, podem ser medidos e comparados em vários ossos para prever respostas celulares à tensão mecânica.

Protocolo

Os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Missouri, Kansas City (UMKC), e em conformidade com as diretrizes federais relevantes.

1. Processo de preparação óssea

1. Colete fêmures de camundongos C57BL6 fêmeas de 4 meses e 22 meses e fixe-os em paraformaldeído frio a 4% em PBS por 24 h a 4 ° C com balanço suave, depois enxágue-os em PBS e armazene-os em etanol a 70% antes de incorporá-los.
   NOTA: O volume do fixador deve ser cerca de 20x o volume do tecido
2. Incorpore os ossos rapidamente em um acrílico de polimerização rápida (Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
   NOTA: É importante usar uma resina de polimerização rápida para esta etapa (~10 min). O objetivo é apoiar o tecido ósseo durante a seccionação usando a serra diamantada, mas sem que a resina penetre no LCN, o que impediria a penetração da mancha FITC.
3. Corte fatias transversais grossas de 300 μm de espessura de um local padronizado acima do terceiro trocanter usando uma serra diamantada e armazene-as a 4 ° C em etanol a 70% antes da coloração FITC.
4. Polir as seções usando uma lixa de grão 600, 800 e 1200 até obter uma espessura final de ~ 90-100 μm.
   NOTA: A obtenção da espessura adequada foi garantida usando um paquímetro digital.
5. Enxágue as seções em etanol 70%, 95% e 100% por 5 min cada.
6. Manchar-os em FITC a 1% em etanol 100% por 4 h em temperatura ambiente (RT) no escuro com agitação moderada.
7. Lave as seções em etanol 100% por 30 min com agitação suave no escuro. Em seguida, seque-os ao ar durante a noite no escuro.
8. Para montar, coloque a seção em uma gota de mídia de montagem em uma lâmina de microscópio de vidro. Use uma pinça para posicionar a seção o mais plana possível contra a lâmina, evitando gerar bolhas de ar e usando a resina circundante para manipular a amostra. Monte uma lamínula na amostra.

2. Microscopia confocal

1. Use um microscópio confocal para obter imagens de fatias de osso coradas com FITC.
2. Use uma objetiva de óleo de 100 x 1,44 NA com um zoom digital de 1,7 e um tamanho de passo de 0,126 μm para coletar pilhas Z detalhadas de 400 planos Z a 1024 x 1024 pixels, resolução de pixel de 0,089 μm.
3. Use um laser de 488 nm para excitação, com uma janela de coleta de emissão de 496-596 nm. Colete as pilhas de imagens usando as configurações de compensação para corrigir a perda de sinal com o aumento da profundidade da imagem.
4. Aumente a precisão e a resolução das imagens usando técnicas de coleta de imagens, como sobreamostragem e aumento da média da linha. Além disso, colete as imagens com uma resolução de 5x, 20x e 100x dos cortes transversais dos cortes do fêmur, conforme mostrado na Figura 1.
   NOTA: A imagem de baixa resolução (5x) na Figura 1 mostra a área completa da seção transversal do fêmur, com três regiões selecionadas para campos de imagem de 100x.
5. Use as 100x Z-stacks para a modelagem computacional de osteócitos.

3. Modelagem computacional

1. Importe as imagens 100x coletadas, no formato TIFF, para o software ImageJ para construir uma sequência de imagens do LCN na direção Z.
2. Importe as pilhas Z para o software de processamento baseado em imagem 3D para construir uma máscara do LCN depois de definir a orientação da imagem.
3. Limite a imagem original dos camundongos jovens e idosos entre 30.012-45.677 unidades Hounsfield e 15.000-46.701 unidades Hounsfield, respectivamente, para se assemelhar ao LCN. Ajuste o Limite no menu da seção para alterar os limites de intensidade de pixel para inclusão em uma máscara.
4. Corte uma lacuna com seus canalículos como a região de interesse (ROI) da pilha usando a operação Crop Mask . Defina o ROI de modo que ele circunde a lacuna no centro do cubo e todos os seus canalículos conectados se estendam para os lados do cubo. Envolva a lacuna em um cubo maior imaginário com comprimentos laterais de 21 μm, 14 μm e 19 μm.
5. Como o modelo é criado a partir de várias partes, execute uma operação de crescimento de região para selecionar as regiões de pixel conectadas, remover ruído e remover manchas para gerar um LCN uniforme.
6. Converta a máscara lacunar-canalicular em um objeto usando a operação de peça calculada no software de processamento baseado em imagem 3D.
7. Construa as membranas osteócitas e dendríticas reduzindo o volume do LCN usando a operação de suavização. Realizar esta operação várias vezes para obter uma espessura lacunar e canalicular de 0,75 μm e 0,08 μm, respectivamente ^9,18.
8. Exporte os objetos (formato STL) como a última etapa no software de processamento baseado em imagem 3D.
9. Importe duas camadas do LCN e das membranas dendríticas dos osteócitos para o software de otimização de dados 3D para gerar uma malha de volume.
10. Utilize a ferramenta Assistente de correção no software para identificar problemas de malha em cada peça. Verifique a qualidade da malha na seção de diagnóstico do Assistente de Correção após cada operação.
11. Remova as peças normais invertidas, triângulos de interseção e contornos ruins usando a operação Correção automática no Assistente de correção.
12. Substitua os triângulos sobrepostos manualmente definindo novos ou automaticamente através da operação Preencher furo normal .
13. Melhore a qualidade da malha usando operações que incluem filtragem de triângulos agudos, arestas pequenas e cascas pequenas.
14. Depois de melhorar a qualidade da malha, combine duas superfícies do LCN e das membranas dendríticas dos osteócitos em uma superfície (espaço fluídico lacunar-canalicular) que pertence a ambas as partes usando um conjunto não múltiplo.
15. Crie um modelo volumétrico do espaço lacunar-canalicular usando a operação Remesh e, em seguida, exporte-o como um arquivo STL. Ajuste a escala do objeto para ficar em micrômetros na seção de exportação.

4. Técnica de modificação de geometria no software de processamento baseado em imagem 3D e software de otimização de dados 3D

NOTA: A técnica de modificação da geometria é usada para modelar mudanças na morfologia dos osteócitos, como densidade e diâmetro canalicular e espessura lacunar-canalicular devido ao envelhecimento ou doença óssea.

1. Escolha o osteócito jovem como modelo base e modifique-o para construir outros modelos distintos de osteócitos aplicando alterações morfológicas.
2. Gere um modelo de osteócitos com diferentes densidades canaliculares do modelo base, alterando o limite da imagem no software de processamento baseado em imagem 3D.
   1. Selecione um limite inferior para reduzir a intensidade da luz da imagem e obter uma lacuna com menos canalículos. A vantagem da técnica de limiar é que a forma e o tamanho da lacuna permanecem os mesmos, e apenas a influência da densidade canalicular é estudada. A Figura 2 mostra o modelo envelhecido simulado gerado a partir do osteócito jovem usando a técnica de modificação da geometria.
3. Desenvolver modelos de osteócitos com diferentes espessuras de espaço lacunar-canalicular ou diâmetros dendrito/canalicular no software de processamento baseado em imagem 3D e software de otimização de dados 3D. Construa modelos de osteócitos maiores ou menores por meio de operações de Envolvimento ou Suavização , respectivamente. A Figura 3 mostra seis modelos de osteócitos com geometria alterada desenvolvidos a partir do osteócito jovem.

5. Análise de CFD

NOTA: Depois de gerar os modelos volumétricos de osteócitos, várias etapas, incluindo geometria, malha e configuração, são conduzidas no módulo CFX do software de simulação.

1. Crie um Fluxo de Fluido no software de simulação para preparar os modelos para a análise CFD.
2. Importe as geometrias baseadas em imagens confocais desenvolvidas para a seção de geometria do CFX, conhecida como ANSYS SpaceClaim (ferramenta de modelagem 3D). Defina as dimensões da unidade para nanômetros na configuração.
3. A geometria aparece como duas facetas do LCN e dos processos dendríticos dos osteócitos. Clique em Faceta no menu superior e remova os erros geométricos, como interseções, arestas afiadas ou superconectadas e vértices, aberturas ou furos para cada faceta.
4. Clique em Subtrair no menu Faceta para reduzir a faceta menor e os processos dendríticos dos osteócitos da faceta maior, o LCN, para obter um único corpo de espaço lacunar-canalicular. Em seguida, clique com o botão direito do mouse na faceta gerada e converta-a de facetas em um domínio sólido sem mesclar faces. A Figura 4 mostra a área de secção transversa do modelo de osteócitos jovens, que representa o espaço lacunar-canalicular.
5. Clique na malha e selecione elementos tetraédricos lineares usando um tamanho de elemento de 0,06 μm. Refine a malha com um estudo de convergência de malha para ter elementos suficientes no minúsculo sistema dendrítico para garantir que os resultados sejam independentes do tamanho da malha.
6. Selecione a superfície e escolha os canalículos na parte superior do cubo imaginário como entradas de fluido. Selecione os canalículos nas outras cinco faces como saídas de fluido usando a seleção de caixa .
7. Exporte a malha (formato de arquivo fluente) à medida que ela carrega mais rápido na configuração na próxima etapa.
8. Crie outro fluxo de fluido no software de simulação e importe a malha fluente para a seção de configuração do CFX. Defina duas condições de limite de entradas e saídas para as faces pré-selecionadas como entradas/saídas usando a opção Inserir limite .
9. Para imitar as condições fisiológicas, exercer uma pressão de entrada de fluido de 300 Pa e 0 Pa nas entradas e saídas, respectivamente^19,20. Trate as superfícies restantes como paredes com uma condição antiderrapante nesse fluido que tem velocidade zero na interface das paredes. O fluido flui das entradas ao redor dos dendritos e do corpo celular dos osteócitos e sai dos outros canalículos designados como saídas.
10. Trate o fluido laminar intersticial como água⁹, escolhida na biblioteca de materiais. Defina as seções Transferência de calor, Combustão e Radiação térmica como Nenhuma, pois nenhuma transferência de calor é definida no problema. Selecione o modo Turbulência como a característica do fluido no LCN, que é um fluido laminar⁹.
11. Execute o software usando Precisão Dupla e Início Direto como o tipo de envio. Monitore a massa e o momento até que os resíduos caiam e se tornem constantes. Após a convergência da solução, meça os dados FFSS usando a seção CFD-post do software CFD.

6. Pós-processamento CFD

1. Para descrever o FFSS experimentado por osteócitos e seus dendritos, insira um novo contorno na seção de resultados do software CFD. Crie um contorno FFSS escolhendo o cisalhamento da parede nas membranas dendríticas dos osteócitos como a variável no domínio.
   NOTA: Para mostrar melhor o FFSS alto nas membranas dendríticas, o intervalo de FFSS é definido como Especificado pelo usuário para modificar os valores mínimos/máximos do FFSS.
2. Insira um contorno de velocidade aerodinâmica dentro do domínio lacunar-canalicular a partir das entradas. Defina a amostragem para igualmente espaçada e selecione o número de pontos como 2500. Uma seção de animação no software CFD exibe com precisão em 3D como as partículas de fluido fluem dentro dos espaços lacunares-canaliculares usando o gráfico de velocidade aerodinâmica.
3. Use a ferramenta Calculadora de Função no software CFD para analisar a magnitude do FFSS ou velocidade com base em parâmetros geométricos, especialmente onde existem vários modelos de osteócitos (ou seja, jovens vs. idosos). Meça o volume e a área de superfície do espaço lacunar-canalicular como parâmetros geométricos, juntamente com valores máximos, mínimos ou médios de FFSS.

Resultados

Este protocolo descreve como desenvolver modelos de osteócitos derivados de confocal para investigar a quantidade de tensão de cisalhamento de fluxo de fluido a que um osteócito e seus processos dendríticos são submetidos devido à carga mecânica. Um camundongo C57BL6 idoso e um jovem foram selecionados para construir modelos de osteócitos baseados em imagens confocais jovens e envelhecidos. Seis outros modelos de osteócitos simulados foram gerados a partir do mesmo modelo de ost...

Discussão

Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para visualização e modelagem computacional dos osteócitos. Antes da imagem confocal, é realizado o processo de preparação óssea para seccionamento e coloração de amostras ósseas. Imagens confocais de aumento de 100x são importadas para vários softwares para desenvolver modelos computacionais de osteócitos e do espaço lacunar-canalicular. Uma análise CFD é conduzida por último nos modelos baseados em imagens confoca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S