Isolamento e cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano com um método inovador livre de xenogênicos para terapia humana

Resumo

Os produtos xenogênicos (químicos ou derivados de animais) introduzidos nas etapas de preparação/manipulação da terapia celular estão associados a um risco aumentado de reatividade imunológica e transmissão patogênica em pacientes hospedeiros. Aqui, um método completo livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é descrito.

Resumo

Considerando o crescente impacto da terapia com células-tronco, preocupações de biossegurança têm sido levantadas em relação à potencial contaminação ou transmissão de infecção devido à introdução de produtos derivados de animais durante a manipulação in vitro . Os componentes xenogênicos, como colagenase ou soro fetal bovino, comumente usados durante as etapas de isolamento e expansão celular podem estar associados aos riscos potenciais de reatividade imunológica ou infecção viral, bacteriana e príon nos pacientes receptores. Seguindo as diretrizes de boas práticas de fabricação, a dissociação química do tecido deve ser evitada, enquanto o soro fetal bovino (FBS) pode ser substituído por suplementos livres de xenogenes. Além disso, para garantir a segurança dos produtos celulares, é importante a definição de métodos mais fiáveis e reprodutíveis. Desenvolvemos um método inovador, completamente livre de xenogenes, para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano sem alterar suas propriedades em comparação com os protocolos padrão cultivados com colagenase FBS. Aqui, células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) foram isoladas do tecido adiposo abdominal. A amostra foi picada mecanicamente com tesoura/bisturi, microdissecada e dispersa mecanicamente em placa de Petri de 10 cm e preparada com incisões de bisturi para facilitar a fixação dos fragmentos de tecido e a migração de hASCs. Seguindo as etapas de lavagem, os hASCs foram selecionados devido à sua aderência plástica sem digestão enzimática. Os hASCs isolados foram cultivados com meio suplementado com lisado plaquetário humano livre de heparina a 5% e destacados com um substituto de tripsina livre de animais. Seguindo as instruções das boas práticas de fabrico (BPF) sobre a produção de produtos celulares destinados à terapia humana, não foram utilizados antibióticos em nenhum meio de cultura.

Introdução

Nas últimas décadas, a crescente demanda por tratamentos terapêuticos inovadores deu origem a esforços significativos e investimentos em recursos no campo da medicina translacional¹. Os produtos à base de células estão associados a riscos determinados pela fonte celular, pelo processo de fabricação (isolamento, expansão ou modificação genética) e pelos suplementos não celulares (enzimas, fatores de crescimento, suplementos de cultura e antibióticos), e esses fatores de risco dependem da indicação terapêutica específica. A qualidade, a segurança e a eficácia do produto final podem ser profundamente influenciadas pelos elementos acima indicados². A terapia com células-tronco requer adesão aos princípios de biossegurança; os riscos potenciais de transmissão patogénica com produtos derivados de animais em cultura de células podem ser problemáticos, e o ensaio exaustivo de qualquer produto introduzido no fabrico é essencial³.

O método tradicional de isolamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) envolve uma digestão enzimática realizada com colagenase seguida de etapas de lavagem por centrifugação⁴. Embora o isolamento enzimático seja geralmente considerado mais eficiente do que outras técnicas mecânicas em termos de rendimento celular e viabilidade, os componentes derivados de animais usados, como a colagenase, são considerados mais do que minimamente manipulados pela Food and Drug Administration dos EUA. Isso significa que há um risco significativamente aumentado de reações imunes ou transmissão da doença, limitando a tradução da terapia com hASC para ambientes clínicos ^5,6.

A digestão à base de tripsina é outro protocolo enzimático para isolar ASCs. Diferentes técnicas foram descritas com pequenas modificações em termos de concentração de tripsina, velocidade de centrifugação e tempo de incubação. Infelizmente, esse método não é bem descrito, e existe uma falta de comparação na literatura, particularmente com os protocolos de isolamento mecânico⁷. No entanto, em termos de traduzibilidade da abordagem, a tripsina tem as mesmas desvantagens da colagenase.

Métodos alternativos de isolamento para obtenção de ASCs, baseados em forças mecânicas e sem adição enzimática, envolvem centrifugação em alta velocidade (800 x g ou 1.280 x g, 15 min) dos fragmentos de tecido adiposo. Em seguida, o pellet é incubado com um tampão de lise de hemácias (5 min), seguido de outra etapa de centrifugação a 600 x g antes da ressuspensão em meio de cultura. Apesar de um maior número de células ter sido isolado nos primeiros dias em comparação com os métodos de explante, um estudo prévio mostrou menor ou ausente proliferação após a segunda semana de cultura⁸.

Além disso, a manipulação adicional com meio adicionado xenogênico, como o soro fetal bovino (FBS), que é utilizado como suplemento de fator de crescimento para cultura celular, está associada a um risco aumentado de reatividade imunológica e exposição a infecções virais, bacterianas ou priônicas do paciente hospedeiro ^9,10. Reações imunes e desenvolvimento de erupções cutâneas urticariformes já foram descritas em indivíduos que receberam várias doses de células-tronco mesenquimais produzidas com FBS¹¹. Além disso, a FBS está sujeita à variabilidade lote a lote, o que pode ter impacto na qualidade do produto final¹².

De acordo com as diretrizes de boas práticas de fabricação (BPF), a dissociação do tecido enzimático deve ser evitada e a FBS deve ser substituída por suplementos livres de xenogenes. Essas etapas, aliadas a protocolos mais confiáveis e reprodutíveis, são essenciais para subsidiar a aplicação da terapia celular ^3,13.

Nesse contexto, o lisado plaquetário humano (hPL) tem sido sugerido como um substituto para a FBS, uma vez que é um suplemento livre de células, contendo proteínas e enriquecido com fator de crescimento, e foi introduzido anteriormente entre produtos à base de células de grau clínico como aditivo de meio de crescimento para cultura e expansão celular in vitro ^14,15. Como o hPL é um produto derivado de humanos, é frequentemente utilizado como substituto da FBS durante a cultura in vitro de hASCs destinadas a aplicações clínicas, reduzindo assim os problemas relacionados às reações imunológicas e infecções relacionadas à traduzibilidade da FBS^15,16.

Apesar dos custos de produção mais elevados, já foi demonstrado que, em comparação com a FBS, o hPL suporta a viabilidade celular para muitos tipos de células, aumenta a proliferação, retarda a senescência, garante a estabilidade genômica e conserva o imunofenótipo celular mesmo em passagens celulares tardias; todos esses elementos sustentam a mudança para esse suplemento cultural¹¹.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo padronizado para isolar e cultivar hASCs com um método completo livre de animais, sem modificar a fisiologia celular e as propriedades da caule em comparação com as hASCs clássicas cultivadas em FBS (Figura 1).

Protocolo

Os hASCs foram isolados do tecido adiposo abdominal de uma mulher saudável que foi submetida à reconstrução mamária usando retalhos autólogos abdominais (retalhos perfuradores epigástricos inferiores profundos, [DIEP]) no Hospital Universitário de Lausanne, CHUV, Lausanne, Suíça. A parte descartada do retalho e do tecido adiposo foi obtida após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os protocolos foram revisados e aprovados pelo Departamento de Biobanco DAL do hospital (número 314 GGC) e comitês de ética de acordo com a Declaração de Helsinque.

NOTA: Todas as etapas devem ser executadas sob um exaustor de fluxo laminar e com condições assépticas. Luvas e jalecos de laboratório para proteção individual devem ser sempre usados, e todas as superfícies devem ser lavadas com biocidas apropriados. O excesso de tecido deve ser descartado adequadamente como resíduo biomédico.

1. Materiais necessários e preparação das soluções culturais

1. Para isolamento, expansão e criopreservação, obtenha-se os seguintes instrumentos: tesoura estéril; bisturis estéreis; pinças estéreis; uma placa de Petri de 10 cm; Tubos de 15 mL; Balões T25; uma câmara de Burker; crioviais; um recipiente de congelamento de células; um microscópio óptico com objetivos de ampliação de 4x e 10x; e uma centrífuga de balde oscilante.
2. Para imunofenotipagem, obtenha-se os seguintes instrumentos e reagentes: tubos FACS, solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS); Meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM); hPL; sulfeto de dimetilo; e tripsina livre de animais.
3. Prepare o meio de cultura completo suplementando DMEM com hPL livre de heparina a 5%. Conservar o meio a 4 °C até 3 semanas e utilizar sempre quente (entre a temperatura ambiente e os 37 °C). Seguindo as diretrizes GMP para a produção de medicamentos celulares destinados à terapia humana, não adicione antibióticos ao meio de cultura.
4. Preparar meio de congelamento contendo 20% de hPL e 10% de sulfeto de dimetilo em DMEM.

2. Isolamento de hASCs da amostra de tecido adiposo

1. Processar a amostra de tecido adiposo dentro de 6 h após a sua obtenção. Antes de prosseguir para o método de isolamento mecânico livre de xenogênicos estabelecido, lave o tecido 2x com PBS por 10 minutos até que o tecido conjuntivo e o sangue sejam liberados.
2. Armazenar a amostra de tecido adiposo obtida da cirurgia abdominoplástica em PBS a 4°C até o processamento e, em qualquer caso, não mais de 24 h, a fim de não prejudicar a viabilidade do hASC.
3. Corte o tecido adiposo em pedaços menores de aproximadamente 1^cm2 com tesoura estéril.
4. Com bisturi, microdissecar cada peça em pequenos fragmentos com diâmetros <5 mm e dispersar cinco deles em uma placa de Petri de 10 cm (Figura 2A).
5. Para anexar cada fragmento, use o bisturi para criar incisões na superfície do plástico, arrastando cada fragmento até que esteja firmemente preso à placa de Petri. Use uma pinça para ajudar a manipular o fragmento (Figura 2B).
6. Adicionar suavemente 10 mL de meio de cultura completo para cobrir todos os fragmentos sem separá-los.
7. Incubar as placas de Petri a 37 °C e 5% de CO₂. Os hASCs migrarão para fora do tecido e serão selecionados devido à sua aderência plástica sem digestão enzimática.
8. Até a confluência celular, monitore a expansão do hASC sob um microscópio óptico com ampliação de 4x uma vez por dia. À medida que os hASCs começam a sair do tecido, eles aparecem como pequenos aglomerados ao redor dos pedaços de tecido com uma morfologia típica semelhante a fibroblastos. Os hASCs são selecionados devido à sua capacidade de aderir à superfície plástica. A cada 72 h, remova o máximo de meio possível e substitua-o por meio fresco completo para remover os detritos celulares.
9. Deixe os fragmentos de tecido no lugar até a primeira passagem das células, que geralmente ocorre após 7 dias.

3. cultura de hASC após a fase de isolamento

1. Quando a cultura de hASC atinge 70% a 80% de confluência, os hASCs estão prontos para serem destacados e expandidos para serem usados em outros experimentos ou armazenamento a longo prazo.
2. Com pinças estéreis, remova e descarte todos os pedaços de tecido da placa de Petri. Retire e descarte o meio exaurido, tomando cuidado para não tocar nos hASCs para não desprendê-los.
3. Lave cuidadosamente as células uma vez com 10 mL de PBS. Adicionar 1 ml de tripsina 1x livre de animais e deixar a placa de Petri na incubadora a 37 °C durante 5 min.
4. Verifique sob um microscópio óptico a uma ampliação de 4x se todas as células se desprenderam; caso contrário, deixe a placa de Petri por mais 2 minutos na incubadora e, eventualmente, bata suavemente na superfície de plástico para suportar o desprendimento celular.
5. Pare a ação da tripsina adicionando 2 mL de meio completo e colete todas as células em um tubo de 15 mL.
6. Para remover qualquer tripsina restante, centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 minutos. Rejeitar o sobrenadante, suspender as células com 5 ml de meio completo e transferir a suspensão celular para um novo balão T25. Mantenha os hASCs em cultura e expanda-os até que seja necessário.

4. Investigação do imunofenótipo por citometria de fluxo

1. Quando a cultura de hASC atingir 70%-80% de confluência, desanexe os hASCs conforme descrito anteriormente na seção 3.
2. Após a coleta das células, suspenda-as em 1 mL de meio completo e conte uma alíquota com o contador de células sob um microscópio óptico com ampliação de 10x.
3. Centrifugar os hASCs a 300 x g durante 5 minutos e suspendê-los a 1 x 10⁶ células/ml de tampão FACS. Transferir 100 μL da suspensão contendo 1 x 10⁵ células para um tubo FACS. Use um tubo FACS para cada antígeno investigado, mais um para cada controle isotípico.
4. Coloração das células com 100 μL dos seguintes anticorpos diluídos em tampão FACS: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, marcado com FITC), anti-CD105 (1:200, IgG1, marcado com PE); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-labeled); anti-CD45 (1:66, IgG1, marcado com FITC); e controles isotípicos para cada fluoróforo, IgG1 FITC-marcado (1:1.000) e IgG1 PE-marcado (1:50).
5. Incubar as amostras durante 1 h no escuro com agitação a 4 °C. Centrifugar os tubos a 300 x g durante 5 min, eliminar o sobrenadante e suspender as células em 500 μL de tampão FACS.
6. Avaliar o imunofenótipo celular com um instrumento de citometria de fluxo, registrando 50.000 eventos para cada tubo dentro do portão selecionado para excluir detritos celulares. Calcule a porcentagem de células expressas como a diferença em relação ao controle isotípico específico.

5. Ensaio de proliferação de hASC

1. Quando a cultura de hASC atingir 70%-80% de confluência, desprenda os hASCs conforme descrito na seção 3.
2. Após a coleta das células, suspenda-as em 1 mL de meio completo e conte uma alíquota com o contador de células sob um microscópio óptico com ampliação de 10x.
3. Semear 5 x 10² hASCs em 200 μL de meio completo em placas transparentes de 96 poços. Semeia as células em replicações técnicas, com um poço para cada ponto de tempo.
4. Aos 3 dias após a semeadura, comece a detectar a proliferação celular usando um kit de ensaio de proliferação seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, substitua o meio de cultura por 100 μL de meio fresco adicionado a 20 μL de reagente de ensaio por poço. Incubar os hASCs por 2,5 h a 37 °C, 5% de CO₂ para desenvolvimento de reagentes e, em seguida, detectar a absorvância a 490 nm com um espectrofotômetro.
5. Expresse a proliferação de hASC como a porcentagem de absorvância após a remoção da absorvância em branco.

6. Criopreservação e armazenamento dos hASCs

1. Desprenda as células conforme descrito na secção 3 e conte uma alíquota com o contador de células sob um microscópio óptico com uma ampliação de 10x.
2. Centrifugar as células a 300 x g durante 5 minutos e eliminar o sobrenadante. Suspender as células com mistura de congelação a uma densidade de 1 x 10⁶ hASCs/ml e transferir 1 ml da solução celular para uma criovial.
3. Coloque os criovios a -80 °C num recipiente de congelação que diminua a temperatura em 1 °C/min e, em seguida, mova os criovios para azoto líquido para armazenamento a longo prazo.

Resultados

Aplicando o método de isolamento detalhado acima, os hASCs foram obtidos com sucesso a partir de amostras de tecido adiposo abdominal sem o uso de colagenase. Além disso, os hASCs foram expandidos em condições livres de xenogenea, na presença de hPL e sem quaisquer outros componentes de origem animal. Os resultados a seguir corroboram o protocolo e são obtidos a partir de hASCs cultivadas em paralelo com hPL e com FBS como condição controle.

Após o aparecimento inicial do cluster, os ...

Discussão

As células-tronco derivadas de tecido adiposo têm atraído o interesse da pesquisa translacional na última década devido à sua abundância, métodos de isolamento rápidos e acessíveis, alta taxa de proliferação in vitro/in vivo e propriedades de caule/diferenciação^18,19,20. Como resultado, as hASCs são consideradas um excelente candidato para estratégias baseadas em células em medicina regenerativ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013