Síntese Direta de Nanopartículas de Ouro EM-Visíveis em Células para Análise de Localização de Proteínas com Ultraestrutura Bem Preservada

Resumo

O presente protocolo descreve uma tecnologia de marcação por microscopia eletrônica clonável para detecção de proteínas marcadas com metalotioneína em células usando uma nova técnica de síntese de nanopartículas de ouro baseada em mecanismo de supressão de autonucleação.

Resumo

Analisar a localização precisa de moléculas de proteínas em células com resolução ultraestrutural é de grande importância para o estudo de vários processos fisiológicos ou patológicos em todos os organismos vivos. Portanto, o desenvolvimento de tags clonáveis que podem ser usados como sondas de microscopia eletrônica é de grande valor, assim como proteínas fluorescentes têm desempenhado um papel crucial no campo da imagem óptica. O mecanismo de supressão da autonucleação (ANSM) foi recentemente descoberto, o que permite a síntese específica de nanopartículas de ouro (AuNPs) em etiquetas ricas em cisteína, como metalotioneína (MT) e proteína anticongelante (AFP).

Com base no ANSM, foi desenvolvida uma tecnologia de marcação por microscopia eletrônica que permite a detecção específica de proteínas marcadas em células procarióticas e eucarióticas com uma eficiência de marcação sem precedentes. Este estudo ilustra um protocolo para a detecção de proteínas de fusão de MTn (uma variante modificada de MT sem resíduos reativos a aldeídos) em células de mamíferos com ultraestrutura bem preservada. Neste protocolo, o congelamento a alta pressão e a fixação por substituição do congelamento foram realizados com fixadores não aldeídos (como ácido tânico, acetato de uranila) para preservar a ultraestrutura quase nativa e evitar danos à atividade do tag causados pela reticulação de aldeídos.

Uma reidratação simples em um passo foi usada antes da síntese de AuNP baseada em ANSM. Os resultados mostraram que as proteínas marcadas tiveram como alvo várias organelas, incluindo as membranas e o lúmen do retículo endoplasmático (RE), e matrizes mitocondriais foram detectadas com alta eficiência e especificidade. Esta pesquisa fornece aos biólogos um protocolo robusto para abordar uma enorme gama de questões biológicas no nível de molécula única em contextos ultraestruturais celulares.

Introdução

Na era pós-genômica, o desenvolvimento da proteína fluorescente verde (GFP) como repórter de molécula única para microscopia de luz revolucionou o campo da pesquisa moderna em ciências da vida ^1,2. Por décadas, a microscopia eletrônica (ME) tem sido uma poderosa ferramenta para observar intuitivamente a ultraestrutura celular com resolução nanométrica³; no entanto, a identificação precisa e a localização de moléculas proteicas permanecem desafiadoras.

A técnica de marcação EM mais comumente usada é a imunomicroscopia eletrônica (EIM), que é baseada na reação antígeno-anticorpo. No entanto, embora muitas técnicas tenham sido desenvolvidas no campo da marcação de EIM, incluindo EIM pré-embutida e IEM pós-incorporação (em seções de resina ou criossecções hidratadas), ela ainda sofre de baixa eficiência de marcação (<10%)^4,5, que está relacionada à preparação da amostra e à qualidade dos anticorpos. Para superar essas limitações, o desenvolvimento de tags codificadas geneticamente tem grande potencial de aplicação.

Dois tipos principais de tags EM foram exaustivamente explorados nos últimos anos. Um tipo é o método de coloração DAB, que utiliza tags como APEX2 para oxidar 3,3'-diaminobenzidina (DAB) a polímeros osmiofílicos para visualização de EM6,7,8,9,10,11,12. Ele permite a marcação de proteínas de alta abundância em regiões subcelulares, mas não é adequado para contagem de molécula única. O outro tipo utiliza proteínas ligadoras de metais, como ferritina 13 e metalotioneína (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^, para gerar depósitos metálicos elétron-densos em situ para visualização EM. Apenas este último tem potencial real para visualização e contagem de molécula única. O tamanho molecular da ferritina é muito grande (~450 kD) para ser usado como uma etiqueta promissora, enquanto o pequeno tamanho (~5 kD) da MT e sua capacidade de ligar vários íons através de suas 20 cisteínas têm atraído grande atenção. Vários laboratórios têm tentado rotular proteínas purificadas de fusão de MT ou células que expressam MT incubando diretamente com Au⁺. Essas tentativas provaram inicialmente que os tags MT podem se ligar a íons ouro para formar sinais de alto contraste, mas nenhum realmente conseguiu a identificação efetiva de proteínas individuais em células, e eles não são amplamente aplicáveis 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

A técnica de síntese de AuNP baseada em ANSM, que envolve a síntese de AuNPs de tamanho 2-6 nm diretamente em tags ricos em cisteína (por exemplo, MT, as variantes MTn e MTα, AFP) como marcadores elétron-densos para visualização EM, é a primeira abordagem confiável e aplicável para marcação de proteínas e detecção de molécula única em células^24,25,26. Ele permite a síntese específica de AuNPs em proteínas isoladas de fusão de tags e alcançou uma eficiência de marcação sem precedentes em células procarióticas (E. coli) e eucarióticas (S. pombe) não fixas ou quimicamente fixadas. No entanto, a implementação do mesmo protocolo em sistemas mais avançados, como células de mamíferos ou mesmo tecidos, envolve desafios adicionais, como a homeostase redox intracelular mais complexa e a estrutura celular mais frágil.

Este estudo apresenta uma tecnologia de marcação EM clonável, que combina a nova técnica de síntese de AuNP baseada em ANSM para marcação de etiquetas ricas em cisteína (MT) codificadas geneticamente com o método de preparação de amostra HPF/FSF-reidratação-HPF/FSF, permitindo a identificação inequívoca de uma única molécula de proteínas marcadas na membrana de RE, lúmen de ER e matriz mitocondrial em células HeLa. O método atual combina as características de alta eficiência de rotulagem, uma alta relação sinal-ruído, marcação de molécula única e forte universalidade, e este método tem amplas perspectivas de aplicação na pesquisa em ciências da vida.

Protocolo

Todos os insumos utilizados neste experimento estão listados na Tabela de Materiais. O fluxo de trabalho passo a passo do protocolo atual é mostrado na Figura 1.

1. Cultura celular em discos de safira

1. Transfira discos de safira de 3 mm x 0,16 mm para um tubo de centrífuga de 2 mL contendo 1 mL de etanol e sonicate em um limpador ultrassônico por 10 min.
2. Queime cada disco de safira em uma chama de lâmpada de álcool até que não haja depósitos visíveis na superfície.
   NOTA: Através do método acima, os discos de safira podem ser reciclados muitas vezes.
3. Rotular um lado de cada disco de safira com um número usando uma caneta resistente a solventes (Figura 1A).
   NOTA: A caneta marcador utilizada precisa ser testada para determinar se é resistente aos solventes acetona e metanol com antecedência para evitar a perda de marcas.
4. Coloque os discos de safira rotulados na parte inferior de um prato de cultura de 35 mm com o lado rotulado virado para cima.
5. Esterilizar a placa de cultura celular com discos de safira sob luz UV por 30 min.
6. Vire os discos de safira com uma pinça (o lado rotulado virado para baixo) e esterilize sob luz UV por mais 30 minutos. Agora, o prato de cultura contendo os discos de safira está pronto para a cultura celular.
   NOTA: Os discos de safira também podem ser esterilizados por autoclavagem.
7. Semeando as células nos discos de safira preparados acima, e crescer até 80%-90% de confluência em uma incubadora celular a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO₂ (Figura 1B).
   NOTA: Linhagens celulares HeLa estáveis expressando tags MTn foram geradas conforme descrito em Jiang et ^al.26.

2. Congelamento de alta pressão (HPF)

CUIDADO: Nitrogênio líquido é usado neste experimento. Ao trabalhar com nitrogênio líquido, use procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual para evitar congelamento e asfixia.

1. Preparar a máquina de congelação de alta pressão pelo menos 2 h antes da experiência, de acordo com as instruções do fabricante.
2. Transfira os carreadores de alumínio HPF tipo A (recesso: 0,025/0,275 mm) para um tubo centrífugo de 2 mL contendo 1 mL de etanol e sonicate em um limpador ultrassônico por 10 min.
3. Secar os suportes em uma placa de Petri coberta com papel de filtro qualitativo (velocidade média).
4. Mergulhe os transportadores pré-limpos em 1-hexadeceno.
   NOTA: BSA não é recomendado como um crioprotetor no experimento atual, pois irá interferir com a síntese subsequente de nanopartículas de ouro.
5. Use pinças finas para pegar um disco de safira com células da placa de cultura; Toque a superfície rotulada com papel filtro qualitativo (velocidade média) para remover o excesso de meio.
   NOTA: A condutividade térmica da água é muito baixa, e muita água residual afetará o efeito de congelamento. Retenha o mínimo de água para evitar que as células sequem.
6. Monte o disco de safira no suporte da amostra HPF e tampe rapidamente o disco com um suporte de alumínio de 0,025 mm de profundidade contendo 1-hexadeceno (Figura 1C).
7. Aspirar o excesso de solução com papel de filtro qualitativo (velocidade média).
8. Carregar o porta-amostras para congelamento a alta pressão (Figura 1D).
   NOTA: O processo de carregamento da amostra precisa ser o mais rápido possível (dentro de 1 min) para minimizar as alterações fisiológicas devido a mudanças na temperatura, umidade, pH e teor de oxigênio.
9. Descarregar o conjunto porta-discos de safira sob nitrogênio líquido em uma criocaixa de espuma e armazenar o conjunto em criovial em nitrogênio líquido antes de usar.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os espécimes em crióvios podem ser armazenados em um dewar de nitrogênio líquido por anos.

3. Fixação por congelamento-substituição (FSF) e reidratação (Figura 1E)

1. Encha a máquina automatizada de substituição por congelamento (AFS) com nitrogênio líquido e resfrie a câmara a -90 °C.
   CUIDADO: Nitrogênio líquido é usado neste experimento. Ao trabalhar com nitrogênio líquido, use procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual para evitar congelamento e asfixia.
2. Preparar 2 mL de ácido tânico 0,01% (p/v) em acetona (solução FSF 1) em um recipiente redondo de polipropileno de 20 mm (Figura 1E) em uma capela de fumaça e congelá-lo em nitrogênio líquido.
3. Carregue os espécimes (os conjuntos porta-discos de safira) no recipiente com a solução FSF congelada 1 sob LN2 usando um par de pinças pré-resfriadas.
4. Transfira o recipiente para a câmara AFS pré-resfriada para processamento FSF a -90 °C.
5. Manter os espécimes a -90 °C durante 1 h; Em seguida, separe os discos de safira dos suportes com pinças pré-resfriadas e verifique se os lados marcados dos discos de safira estão voltados para baixo.
   NOTA: As pinças devem ser suficientemente pré-arrefecidas para evitar alterações de temperatura. Os discos de safira devem ser facilmente separados.
6. Manter a -90 °C por mais 8-10 h; em seguida, aqueça a -60 °C dentro de 3 h.
7. Substitua a solução FSF 1 no recipiente por acetona pré-resfriada e incube por 1 h. Repita esta acetona lave 2x.
8. Aquecer a -30 °C dentro de 3 h. Durante este período, preparar e pré-resfriar 2 mL de acetato de uranila a 0,01% em acetona (solução FSF 2, diluída de acetato de uranila a 10% em metanol) em um tubo de centrífuga de 2 mL.
   CUIDADO: O acetato de uranila, usado no experimento atual, é radioativo e altamente tóxico; Deve ser manuseado de acordo com procedimentos de segurança adequados e eliminado como resíduo químico perigoso.
9. Substitua a acetona pela solução FSF 2 e incube a -30 °C durante 3 h.
10. Substitua a solução FSF 2 no recipiente por acetona pré-resfriada e incube por 30 min a -30 °C. Repita esta acetona lave 2x.
11. Aquecer de -30 °C a 4 °C dentro de 2 h.
12. Substitua a acetona por 2 mL de tampão HEPES 0,2 M contendo 1 mM de CaCl 2 e 1 mM de MgCl₂ em pH 5,5.
13. Troque o tampão uma vez e incube à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4 °C durante a noite.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui por uma noite ou continuado por pelo menos 6 h até que os espécimes sejam congelados novamente na etapa 5.

4. Síntese de AuNP baseada em ANSM para células de mamíferos (Figura 1F)

1. Lave com tampão PBS-A 3x por 5 min de cada vez.
2. Transfira os discos de safira para uma placa de cultura de 35 mm contendo 1 mL de tampão PBS-A à temperatura ambiente.
   NOTA: Mantenha sempre os lados marcados dos discos de safira virados para baixo e evite sobrepor os discos de safira e esfregar as células.
3. Preparar a solução redutora adicionando 4,28 μL de 2-mercaptoetanol num tubo de centrifugação de 2 ml contendo 1 ml de tampão PBS-A e misturando bem num exaustor.
   CUIDADO: O 2-Mercaptoetanol é tóxico e tem um odor pungente; deve ser manuseado de acordo com os procedimentos de segurança adequados.
4. Substitua o tampão PBS-A na placa de cultura por 1 mL de solução redutora e incube por 1 h à temperatura ambiente.
5. Prepare o precursor de ouro antes de usar.
   1. Adicionar 80 μL de HAuCl₄ 10 mM em ddH 2 O em um tubo centrífugo de₂mL contendo 1 mL de solução redutora e imediatamente vórtice.
      NOTA: A solução pode ficar turva.
   2. Adicionar 80 μL de 500 mM de D-penicilamina em ddH2O na solução acima e imediatamente vórtice.
      Observação : a solução pode ficar clara novamente.
6. Substitua a solução na placa de cultura por 1 ml de solução precursora de ouro preparada no passo 4.5 e incube durante 2 h a 4 °C.
   NOTA: Um mililitro do precursor de ouro é suficiente para reagir com aproximadamente 1 × 10⁶ células (confluentes em uma placa de 35 mm). Maiores volumes do precursor são necessários quando as AuNPs se tornam significativamente menores.
7. Pesar 0,0038 g de NaBH 4 em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicionar 1 mL de ddH₂O gelado e vórtice para fazer 100 mM de NaBH₄ fresco imediatamente antes do uso.
8. Adicionar 20-100 μL de NaBH₄ a 100 mM à solução do passo 4.6, agitar imediatamente para misturar bem e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
   NOTA: Prepare 100 mM NaBH₄ na hora para uso imediato. Depois de adicionar o NaBH₄, a cor da solução gradualmente ficará vermelha e depois se aprofundará. Se nenhuma mudança de cor for observada, isso indica em grande parte que o experimento falhou.
9. Substitua a solução por 2 ml de tampão PBS-A para parar a reação.
   NOTA: Parar a reação dentro de 30 min é crítico, pois uma reação prolongada irá quebrar gradualmente as AuNPs.

5. Congelamento a alta pressão e fixação por substituição por congelamento (Figura 1C-F)

NOTA: Os espécimes são HPF e FSF novamente, e o procedimento é quase o mesmo descrito anteriormente na seção 2 e seção 3 com algumas modificações.

1. Preparar tetróxido de ósmio a 1% e acetato de uranila a 0,1% em acetona (solução FSF 3, diluída a partir de tetróxido de ósmio a 4% em acetona e acetato de uranila a 10% em metanol).
   CUIDADO: Tetróxido de ósmio e acetato de uranila são produtos químicos altamente tóxicos; Devem ser manuseados de acordo com procedimentos de segurança adequados e eliminados como resíduos químicos perigosos.
2. Carregue os espécimes (os conjuntos porta-discos de safira) no recipiente com a solução FSF 3 congelada sob LN2 usando um par de pinças pré-resfriadas.
3. Transfira o recipiente para a câmara AFS pré-resfriada para processamento FSF a -90 °C e execute o programa FSF da seguinte forma: manter a -90 °C por 8-10 h; em seguida, aquecer a -60 °C dentro de 3 h; manter a -60 °C durante 3 h; em seguida, aquecer a -30 °C dentro de 3 h; manter a -30 °C durante 3 h; em seguida, aqueça a 4 °C dentro de 2 h.
4. Quando a temperatura atingir 4 °C, transferir os espécimes para a exaustora e manter à temperatura ambiente por 15 min.
5. Lave com acetona 3x por 15 min de cada vez.
6. Manter em acetona à temperatura ambiente durante pelo menos 2 h.

6. Infiltração, incorporação e polimerização de resina

1. Preparar a mistura de resina epóxi de acordo com as instruções do fabricante antes de usar.
   CUIDADO: A resina epóxi utilizada no experimento atual é tóxica antes da polimerização; deve ser manuseado de acordo com os procedimentos de segurança adequados. A resina não polimerizada deve ser descartada como resíduo químico perigoso ou polimerizada antes do descarte.
2. Transfira os discos de safira para cápsulas de embutição de fundo plano e infiltre-se com resina por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente.
   NOTA: Mantenha os lados marcados dos discos de safira virados para baixo.
3. Polimerizar o espécime a 60 °C em estufa durante, pelo menos, 18 h.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui após a polimerização. Os blocos de amostras polimerizadas podem ser armazenados em um recipiente seco por anos.

7. Seccionamento ultrafino

1. Aparar cuidadosamente os blocos de amostra polimerizados usando uma navalha para expor os discos de safira.
2. Mergulhe as pontas do bloco com discos de safira em nitrogênio líquido por vários segundos e descongele à temperatura ambiente. Repita a ação de congelamento-descongelamento várias vezes para separar os discos dos blocos.
   NOTA: Evite o congelamento prolongado, pois isso pode rachar os blocos da amostra. Retirar suavemente os discos de safira com uma lâmina, evitando força excessiva, que pode danificar as amostras.
3. Aparar a face do bloco para uma forma trapezoidal para secção ultrafina (Figura 1G).
4. Obter cortes ultrafinos de 70-100 nm com um ultramicrótomo (Figura 1H).
5. Escolha as seções em grades hexagonais de cobre de 200 malhas.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui após a secção. As seções em cintas podem ser armazenadas em um recipiente seco por anos. Se desejado, os cortes nas grades podem ser corados com acetona de uranila a 2% para obter melhor contraste de membrana. A coloração de chumbo deve ser evitada, pois mascarará os sinais das partículas de nanoouro.

8. Imagem de TEM (Figura 1I)

1. Examine as seções ultrafinas em grades de cobre usando um microscópio eletrônico de transmissão. Normalmente, um intervalo de ampliação de 11 kX a 30 kX é adequado para visualizar AuNPs em células, e um valor de desfocagem apropriado é necessário para garantir que AuNPs de 2-3 nm sejam visíveis.

Resultados

A técnica de síntese de AuNP baseada em ANSM é uma ferramenta extremamente útil para marcar e detectar proteínas marcadas com MT com TEM²⁶. Para validar sua robustez em células de mamíferos, três linhagens celulares estáveis expressando EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn ou Mito-acGFP-MTn em células Hela foram geradas. KDEL é uma sequência canônica de retenção/recuperação do retículo endoplasmático C-terminal (RE), que mantém a proteína de fusão EGFP-MTn-KDEL dentro do lúmen do RE...

Discussão

O estudo apresenta aqui uma robusta tecnologia de marcação EM clonável para a visualização de moléculas de proteína em molécula única dentro do ambiente celular com resolução ultraestrutural. As AuNPs sintetizadas diretamente em etiquetas ricas em cisteína codificadas geneticamente fornecem localização inequívoca e precisa das proteínas-alvo. A técnica de congelamento a alta pressão e substituição por congelamento preserva de forma excelente a ultraestrutura das amostras biológicas. Em conjunto, a te...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400