Extração de DNA livre de células de espécimes de humor vítreo e aquoso para diagnóstico e monitoramento de linfoma vitreorretiniano

Resumo

Um procedimento para extrair DNA livre de células do humor vítreo e aquoso para realizar estudos moleculares para o diagnóstico de linfoma vitreorretiniano é estabelecido aqui. O método oferece a capacidade de extrair simultaneamente o DNA do componente celular da amostra ou reservá-lo para testes auxiliares.

Resumo

O linfoma vitreorretiniano (LVV) representa um linfoma agressivo, frequentemente categorizado como linfoma primário de grandes células B difuso do sistema nervoso central. Para o diagnóstico da LVR, são coletados espécimes como humor vítreo e, mais recentemente, humor aquoso. Os testes diagnósticos para VRL nesses espécimes incluem citologia, citometria de fluxo e teste molecular. No entanto, tanto a citopatologia quanto a citometria de fluxo, juntamente com o teste molecular usando DNA celular, necessitam de células inteiras intactas. O desafio está no fato de que o humor vítreo e aquoso normalmente tem baixa celularidade, e muitas células são destruídas durante a coleta, armazenamento e processamento. Além disso, esses espécimes apresentam dificuldades adicionais para testes moleculares devido à alta viscosidade do humor vítreo e ao baixo volume do humor vítreo e aquoso. Este estudo propõe um método para extração de DNA livre de células de espécimes vítreos e aquosos. Essa abordagem complementa a extração de DNA celular ou permite que o componente celular desses espécimes seja utilizado para outros métodos diagnósticos, incluindo citologia e citometria de fluxo.

Introdução

O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo associado ao linfoma difuso primário de grandes células B do sistema nervoso ^central1,2,3. A VRL é tipicamente fatal devido ao seu envolvimento no sistema nervoso central ^1,2. Embora rara^1,4, a VRL frequentemente apresenta sintomas semelhantes à uveíte posterior e outras doenças vitreorretinianas4,5. Consequentemente, os pacientes que apresentam s....

Protocolo

O presente protocolo segue as diretrizes de cuidados humanos e com aprovação do comitê de revisão institucional (IRB) da Universidade de Michigan. Para tal, obteve-se a dispensa do termo de consentimento livre e esclarecido junto ao CEP. Não há critérios relevantes de inclusão ou exclusão para os pacientes envolvidos.

1. Separação de componentes celulares e livres de células

NOTA: Três tipos de amostras podem ser recebidas para testes diagnósticos de VRL: vítreo (não diluído; líquido de vitrectomia coletado antes do início da infusão), vítreo diluído dentro de uma bolsa de fita (

Discussão

O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo de grandes células B ^1,2,3 cujos sintomas podem mimetizar outras doenças vitreorretinianas4,5. O teste molecular do humor vítreo e, mais recentemente, aquoso tornou-se um método crítico para fazer o diagnóstico de VRL ou descartá-lo. No entanto, esses fluidos são muito baixos em volume e muitas vezes têm b.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010