Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Resumo

Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.

Resumo

O trato gastrointestinal (GI) desempenha uma série de funções essenciais para a vida. Defeitos congênitos que afetam seu desenvolvimento podem levar a distúrbios neuromusculares entéricos, ressaltando a importância da compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal. Neste estudo, apresentamos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias pós-fertilização para obtenção de células vivas viáveis que podem ser usadas para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq). Este protocolo baseia-se na dissecção manual do intestino do peixe-zebra, seguida de dissociação enzimática com papaína. Posteriormente, as células são submetidas à triagem celular ativada por fluorescência, e células viáveis são coletadas para scRNA-seq. Com esse método, conseguimos identificar com sucesso diferentes tipos de células intestinais, incluindo células epiteliais, estromais, sanguíneas, musculares e imunes, bem como neurônios entéricos e glia. Portanto, consideramos ser um recurso valioso para o estudo da composição do trato gastrointestinal na saúde e na doença, utilizando o peixe-zebra.

Introdução

O trato gastrointestinal (GI) é um sistema complexo que desempenha um papel vital na saúde geral e bem-estar. É responsável pela digestão e absorção de nutrientes, bem como pela eliminação de resíduos ^1,2. O trato gastrointestinal é composto por múltiplos tipos celulares, incluindo células epiteliais, células musculares lisas, células imunes e sistema nervoso entérico (ENS), que se comunicam estreitamente para regular e manter a função intestinal adequada ^3,4,5. Defeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal podem ter efeitos de longo alcance em vários aspectos, como absorção de nutrientes, composição da microbiota, eixo intestino-cérebro e ENS, levando a vários distúrbios neuromusculares entéricos, como a doença de Hirschsprung e a pseudo-obstrução intestinal crônica ^6,7. Esses distúrbios são caracterizados por dismotilidade intestinal grave causada por alterações em várias células-chave, como as células intersticiais de Cajal, as células musculares lisas e a ENS ^6,8,9. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal ainda são pouco compreendidos.

O peixe-zebra é um valioso organismo modelo para estudar o desenvolvimento e a disfunção gastrointestinal devido ao seu rápido desenvolvimento embrionário, transparência durante os estágios embrionário e larval e tratabilidade genética 10,11,12,13,14. Numerosas linhagens transgênicas de zebrafish expressando proteínas fluorescentes estão disponíveis. Um exemplo dessa linhagem é o peixe-zebra tg(phox2bb:GFP), comumente usado para estudar a ENS, pois todas as células phox2bb+, incluindo os neurônios entéricos, são marcadas^15,16. Aqui, usando a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), apresentamos um método de isolamento intestinal de larvas 5 dias pós-fertilização (dpf) para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) (Figura 1).

Protocolo

Toda a criação e experimentos de zebrafish foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais do Erasmus MC e legislação de bem-estar animal. O uso de larvas de peixe-zebra aos 5 dias após a fertilização se enquadra na categoria de experimentos que não exigem aprovação ética formal, conforme descrito pelos regulamentos holandeses.

1. Obtenção de 5 dias pós-fertilização (dpf) de larvas selvagens e tg(phox2bb:GFP)

1. Montar a reprodução de zebrafish selvagem e coletar 50 ovos em meio E3 tamponada com HEPES (doravante denominado E3) em uma placa de Petri de 15 cm. Use esses peixes como um controle negativo para a classificação de células ativadas por fluorescência (FACs).
2. Montar a reprodução do zebrafish tg(phox2bb:GFP) e coletar aproximadamente 300 ovos em E3 em uma placa de Petri de 15 cm.
3. Manter os ovos fertilizados em E3 (máximo de 50 ovos/prato) em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h, em incubadora a 28,5 °C.
4. Em 1 dpf, remova os óvulos não fertilizados e deixe os fertilizados se desenvolverem até 5 dpf.
5. Selecione larvas tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.

2. Dissociação de larvas inteiras selvagens

1. Anestesiar larvas de 5 dpf com 0,016% de tricaína.
2. Pique 30 peixes-zebra em pedaços pequenos usando uma lâmina de barbear em uma placa de Petri contendo 1 mL de solução de tripsina-EDTA 10x.
3. Transferir o peixe-zebra picado para um tubo de microcentrífuga com um volume total de 2 mL de solução de tripsina-EDTA 10x e deixar no gelo por 3 h. Pipetar para cima e para baixo com uma pipeta P1000 a cada hora para estimular a dissociação.

3. Isolamento intestinal

1. Colocar 6-10 larvas de 5 dpf anestesiadas com Tricaína a 0,016% seguidas, em placa de agarose a 1,8% (0,45 g de agarose em 25 mL de E3), sob microscópio de dissecção
2. Coloque um pino de inseto na cabeça do peixe-zebra.
3. Remova todo o E3 restante usando um tecido.
4. Isole o intestino usando outro pino de inseto, sem perturbar quaisquer outros órgãos. Certifique-se de que a gema é removida (Figura Suplementar S1A).
5. Uma vez isolado, inspecione o intestino e remova todo o material não intestinal (por exemplo, pele, gordura, fígado), se necessário.
6. Coletar o intestino com uma pinça e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga, contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), sobre gelo.
   OBS: Um mínimo de 244 intestinos deve ser isolado, mantendo-se o tempo total de dissecção em 3 h. Isso é viável com duas pessoas trabalhando em paralelo.

4. Dissociação intestinal

1. Imediatamente após a dissecção de todos os intestinos, centrifugar o tubo de microcentrífuga a toda velocidade (13.800 × g) por 30 s.
2. Remova o PBS/10% FCS, mas deixe uma pequena quantidade (~100 μL) para evitar que os intestinos sequem. Adicionar 500 μL de 2,17 mg/mL de papaína em HBSS contendo CaCl₂ e MgCl_2, para dissociar as células.
3. Ativar papaína com 2,5 μL de cisteína (1 M).
4. Incubar as vísceras em banho-maria a 37 °C durante 10 min. Pipetar para cima e para baixo na metade do caminho (após 5 min) para estimular a digestão enzimática do tecido.
5. Transfira as células para um tubo FACS usando um filtro celular de 35 μm, pré-umedecido com 0,5 mL de PBS/10% FCS.
6. Lave o filtro adicionando um total de 2 mL de PBS/FCS a 10% em passos de 0,5 mL.
7. Centrifugar a 700 × g durante 5 min a 4 °C.
8. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 300 μL de PBS/10% FCS.
9. Adicionar 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar as células mortas (1:1.000) e incubar por 5 min para permitir sua exclusão durante a FACS.

5. Enriquecimento FACS

1. Use a amostra wildtype para definir as portas da população de células classificadas registrando 3.000 células no citômetro de fluxo (Figura suplementar S1B-E).
2. Use um bocal de 100 μm, ajuste a precisão de classificação na pureza e coloque o tubo de coleta contendo 200 μL de PBS/5% FCS, na máquina FACS.
3. Carregar a suspensão celular das vísceras e classificar células vivas (DAPI-negativas), unicélulas no tubo de coleta (Figura 2C), excluindo-se duplos (Figura 2B) e células mortas (Figura 2C).
   NOTA: Para o peixe-zebra tg(phox2bb), a proporção de células GFP⁺ é verificada apenas para referência, pois todas as células vivas individuais são classificadas.
4. Mantenha o tubo de coleta no gelo após a triagem celular.
5. Conte a suspensão celular com um hemocitômetro, incluindo uma verificação de viabilidade com azul de tripano. Se a viabilidade for de pelo menos 80%, continue com o próximo passo.
6. As células agora estão prontas para processar para scRNAseq (ou seja, plataforma 10x Genomics Chromium). Use aproximadamente 20.000 células por amostra.

Resultados

Com este protocolo, obtivemos sucesso no isolamento e dissociação de intestinos inteiros de larvas de 5 dpf. Usando papaína como enzima de dissociação, aumentamos significativamente a viabilidade celular, permitindo a captura de 46.139 eventos envolvendo células únicas viáveis (6,4% de todas as células) de 244 intestinos isolados (Figura 2A). Larvas inteiras selvagens foram usadas como controle para garantir que o processo de triagem fosse otimizado, permitindo a identificação e t...

Discussão

Aqui, apresentamos um método para isolamento e dissociação do intestino de larvas de 5 dpf de zebrafish usando FACS. Com este método, diferentes tipos celulares intestinais foram coletados e analisados com sucesso por scRNA-seq, utilizando a plataforma 10x Genomics Chromium. Selecionamos a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), pois queríamos uma indicação de que células viáveis do ENS também seriam isoladas (Figura 2D). No entanto, é importante notar que este método pod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154