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Resumo

A cirurgia de bypass duodenal-jejunal (DJB) pode melhorar o metabolismo da glicose e reduzir a resistência à insulina. Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de mouse estável e confiável de DJB.

Resumo

A prevalência de obesidade e diabetes tipo 2 é um sério problema de saúde global. A obesidade é um importante fator patogênico no diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer. A cirurgia bariátrica oferece uma opção de tratamento eficaz e de longo prazo para obesidade e diabetes. A gastrectomia vertical (SG) e o bypass gástrico em Y de Roux (BGYR) são amplamente reconhecidos como as cirurgias bariátricas mais populares. Além disso, várias cirurgias bariátricas exploratórias demonstraram efeitos terapêuticos promissores. O bypass duodenal-jejunal (DJB), especificamente adaptado para diabéticos com baixo índice de massa corporal, mostrou resultados metabólicos benéficos. No entanto, seus benefícios metabólicos independentes do peso não são totalmente compreendidos devido a modelos animais limitados. Neste artigo, descrevemos os protocolos de cuidados otimizados e as técnicas cirúrgicas para a realização da cirurgia DJB em camundongos diabéticos obesos induzidos por dieta (DIO). O uso de um modelo de camundongo contribui para uma melhor compreensão da natureza das alterações induzidas pela cirurgia de DJB, facilitando a prática clínica relacionada.

Introdução

A obesidade e o diabetes tipo 2 são as doenças crônicas mais comuns no mundo, e sua prevalência está aumentando entre os jovens1. A cirurgia bariátrica é o tratamento mais eficaz para obesidade e diabetes, facilitando a estabilidade da glicose no sangue a longo prazo, além de melhorar as complicações associadas à obesidade 2,3. Existem vários tipos de cirurgia bariátrica, classificadas por reduzirem o volume gástrico ou a absorção intestinal; estes incluem restritivo, malabsortivo e combinação 4,5.

O bypass duodenal-jejunal (DJB) foi desenvolvido pela primeira vez por Rubino e Marescaux, que demonstraram que o diabetes tipo 2 poderia ser aliviado conectando o duodeno e o jejuno, em vez de reduzir o volume gástrico 6,7. O DJB preserva todo o estômago e contorna todo o duodeno e jejuno proximal. O intestino é dividido em membros biliopancreáticos, digestivos e comuns 6,8. O DJB compartilha algumas semelhanças com as cirurgias bariátricas, incluindo bypass gástrico em Y de Roux (BGYR), minibypass gástrico, bypass biliopancreático, desvio duodenal e gastrectomia vertical com DJBmais 9. Comparado ao BGYR, o DJB não requer anastomose gastrointestinal, o que reduz o tempo operatório e melhora a taxa de sucesso do procedimento. O DBI é semelhante ao BGYR na melhora do metabolismo da glicose, mas não afeta o peso corporal10. Após a cirurgia de DJB, a entrega rápida de alimentos ao intestino delgado distal estimula a secreção do peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), resultando em melhora do metabolismo da glicose11,12.

O uso de modelos animais é essencial para a compreensão das vias metabólicas, celulares e moleculares. Modelos animais de cirurgia bariátrica têm contribuído para a compreensão dos potenciais mecanismos subjacentes à obesidade e ao diabetes13,14. No entanto, devido às diferenças fisiológicas entre as espécies, é impossível replicar perfeitamente as doenças humanas em modelos animais15. Entre os vários modelos animais disponíveis para fins de pesquisa, o modelo de camundongo com obesidade induzida por dieta (DIO) se assemelha mais à obesidade humana e à síndrome metabólica16. Os camundongos foram selecionados para a cirurgia de DJB para determinar a viabilidade da cirurgia e fornecer técnicas para pesquisas futuras. Este manuscrito fornece um resumo abrangente dos aspectos técnicos e detalhes experimentais da cirurgia DJB.

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Protocolo

Todas as etapas do protocolo descritas abaixo seguem as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral do Comando do Teatro Sul sob o número de aprovação 2020112501.

1. Preparação geral pré-operatória

NOTA: Trinta camundongos C57BL/6 machos de 6 semanas de idade foram comprados. Os camundongos foram alojados em um laboratório Specific Pathogen-Free (SPF) sob um ciclo claro/escuro de 12 h; temperatura de 22 ± 2 °C; e umidade, 55-65%. Os ratos tiveram acesso gratuito à água e foram alimentados com uma dieta de 60% de gordura por 6 semanas para induzir a obesidade. Uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina 40 mg/kg foi administrada por 5 dias para induzir diabetes17. Entre os trinta camundongos, vinte e dois camundongos foram rastreados para glicemia aleatória > 300 mg / dL e aleatoriamente designados para os grupos DJB (n = 15) e cirurgia simulada (n = 7). Oito camundongos foram excluídos do experimento devido à glicemia abaixo do padrão.

  1. Jejue os camundongos por 8 h antes da cirurgia. Retire a água 2 h antes da cirurgia.
  2. Administre solução de pentobarbital sódico a 1% (6 mL / kg) e buprenorfina (1 mg / kg) por via intraperitoneal. Toque os dedos dos pés ou caudas dos ratos com uma pinça e certifique-se de que os ratos não apresentem espasmos ou tremores óbvios. Sob anestesia adequada, os camundongos podem respirar livremente sem oxigênio suplementar.
  3. Colocar os ratinhos em decúbito dorsal sobre um quadro esterilizado e sob um estereomicroscópio. Aplique pomada para os olhos nos olhos. Use um cobertor elétrico para manter os ratos aquecidos durante todo o procedimento. Use procedimentos estéreis, incluindo aventais cirúrgicos, luvas estéreis e instrumentos autoclavados.
  4. Em camundongos controle simulado, faça as duas incisões respectivamente no duodeno 1 cm abaixo do piloro e no jejuno 5 cm abaixo do Treitz e, em seguida, suture as incisões.

2. Bypass jejunal duodenal: Procedimento cirúrgico

  1. Aplique a pasta depilatória do xifóide no abdômen para remover os pelos dessa região. Limpe o creme e certifique-se de que a pele esteja limpa. Esfregue a área três vezes com esfoliação alternada de soluções de iodo e álcool.
  2. Cubra o camundongo com um campo estéril, deixando a área operacional exposta, e faça uma incisão de 2 cm do xifóide ao abdômen.
  3. Use um afastador abdominal para expor a cavidade abdominal. Afaste a gordura abdominal usando um cotonete úmido e mova o fígado para o lado cefálico para expor totalmente o estômago e os intestinos.
  4. O estômago e o piloro estão abaixo do fígado, e o ligamento de Treitz está no duodeno distal. Dupla ligação do jejuno, 5 cm distal ao ligamento de Treitz com sutura de seda 6-0 (Figura 1A). Corte o jejuno no ponto médio das duas ligaduras e suture o coto jejunal com uma sutura de seda 10-0 (Figura 1B).
    NOTA: Evite torcer os vasos sanguíneos mesentéricos.
  5. Puxe a incisão jejunal proximal 5 cm ao longo do intestino até o jejuno para criar uma anastomose jejunal-jejunal. Alinhe os dois intestinos horizontalmente e, em seguida, use uma sutura de seda 10-0 para criar a anastomose lateral (Figura 1C).
    NOTA: Durante a cirurgia, mantenha o intestino úmido com solução salina para reduzir a perda de água. Isso evitará que o intestino se enrole e facilitará a sutura.
  6. Prenda ambas as extremidades do intestino e corte a incisão no mesmo comprimento (Figura 1D). Suturar a segunda camada da parede intestinal posterior com uma sutura contínua de espessura total.
    NOTA: O comprimento da incisão é de aproximadamente 0.5-0.6 cm e a distância da agulha é de ~0.5 mm.
  7. Prenda as duas extremidades do intestino e suture a parede anterior do intestino. Suturar a primeira camada da parede anterior com uma sutura contínua simples e a segunda camada com uma sutura horizontal em varo (Figura 1E-F).
    NOTA: Limpe o conteúdo intestinal com cotonetes para evitar infecção da cavidade abdominal.
  8. Puxe a incisão jejunal distal no duodeno 1 cm abaixo do piloro para criar uma anastomose duodenal-jejunal (Figura 1G). Suture-o usando o mesmo método das etapas 2.6-2.7 (Figura 1H-K).
    NOTA: Verifique a sutura no canto da anastomose para reduzir o vazamento da anastomose.
  9. Ligue o intestino com a micro pinça e corte o intestino com a micro tesoura. Ligar duplamente o duodeno com uma sutura de seda 6-0, a 2 mm da extremidade distal da anastomose duodenal-jejunal. Corte no ponto médio com microtesoura e suture o coto com uma sutura de seda 10-0 (Figura 1L).
    NOTA: Os vasos gastroduodenais ramificam-se perpendicularmente à cabeça do pâncreas e são adjacentes ao piloro, exigindo exploração cuidadosa dos vasos na seção transversal. A confluência do ducto colédoco e duodeno foi localizada, tomando cuidado para não danificar o pâncreas ou o ducto colédoco.
  10. Enxágue a cavidade abdominal com solução salina a 30 °C. Retorne o intestino para a cavidade abdominal. Suturar o músculo e a pele separadamente com uma seda 6-0. Em seguida, desinfete a pele com iodóforo.
  11. Após a cirurgia, injete solução salina a 30 °C (30 mL/kg) por via subcutânea nas costas para evitar a desidratação. Injete penicilina (10 mg / kg) por via intramuscular para prevenir a infecção.

figure-protocol-5868
Figura 1: Procedimento de bypass duodenal-jejunal. (A) Localização do jejuno 5 cm distal ao ligamento de Treitz. (B) Ligue duas vezes o jejuno com seda 6-0, cortada no meio da ligadura. (C) Anastomose jejunal-jejunal. (D) Faça uma incisão de 0,5-0,6 cm e suture a parede posterior. (E-F) Anastomose jejunal-jejunal completa. (G) Puxe o jejunal distal para o duodeno 1 cm abaixo do piloro. (H) Anastomose duodenal-jejunal. (I) Corte a anastomose duodenal-jejunal com uma incisão de 0,5-0,6 cm e suture a parede posterior com uma sutura contínua simples. (JK) Anastomose duodenal-jejunal completa. (L) A 2 mm da anastomose distal à duodenal-jejunal, ligar duas vezes o duodeno com seda 6-0 e cortar no meio da ligadura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Cuidados gerais pós-operatórios

  1. Após a cirurgia, coloque os ratos em um cobertor elétrico para evitar hipotermia. Permita que os ratos rastejem livremente até ficarem totalmente acordados antes de retornar às gaiolas.
  2. No dia pós-operatório, restrinja a comida e a água e injete 2 mL de solução salina por via subcutânea no dorso dos camundongos. No primeiro dia de pós-operatório, administrar 10 mL de glicose a 10% e uma bebida funcional (proporção de 1:1) sem alimentos e injetar 1 mL de soro fisiológico por via subcutânea.
  3. No segundo e terceiro dias de pós-operatório, alimentar os camundongos com uma mistura de 20 mL de glicose a 10% e uma bebida funcional. Após o quarto dia, dê aos ratos água pura e uma dieta rica em gordura. A alimentação de transição deve ser realizada de acordo com o estado de recuperação pós-operatória na seguinte ordem: solução, semilíquido ou alimento sólido.
  4. Analgesia pós-operatória: injete buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 12 h dos dias 1 a 3 e, em seguida, uma vez ao dia até o dia 5.
  5. Após a cirurgia, observe as condições de alimentação, atividade, fezes e cicatrização de feridas dos camundongos.

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Figura 2: O diagrama da cirurgia DJB. (A) Anastomose duodenal-jejunal. (B) Anastomose jejunal-jejunal. (C) Membro biliopancreático. (D) Membro digestivo. (E) Membro comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-8951
Figura 3: Anatomia da cirurgia de DJB. (A) Anastomose duodenal-jejunal. (B) Anastomose jejunal-jejunal. (C) Membro biliopancreático. (D) Membro digestivo. (E) Membro comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Avaliação pós-operatória dos parâmetros metabólicos

  1. Medição do peso corporal
    1. Jejue os camundongos por 8 h antes da medição. Pese os camundongos semanalmente na segunda-feira antes e depois da cirurgia por 8 semanas.
  2. Medição da ingestão alimentar
    1. Abriga um rato em cada gaiola. Meça a quantidade de alimento sólido em cada gaiola antes e depois de 24 h. A diferença entre os dois valores representa a ingestão alimentar diária.
  3. Medição aleatória da glicemia
    1. Às 8:00 da manhã da segunda-feira semanal de medição, colete uma gota de sangue da ponta da cauda do camundongo e aplique-a em uma tira de glicose inserida no glicosímetro.
  4. Teste oral de tolerância à glicose
    1. Oito semanas após a cirurgia de DJB, jejuar os camundongos por 8 h antes do teste oral de tolerância à glicose. Colete uma gota de sangue da ponta da cauda do rato e coloque-a em uma tira de glicose inserida no glicosímetro. Administre uma dose oral de 20% de D-glicose (2 g / kg). Meça os níveis de glicose no sangue em 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos após a gavagem.

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Resultados

Condições gerais
O tempo operatório médio para o procedimento de DJB foi de 84,5 ± 2,6 min. Quinze camundongos foram submetidos à cirurgia de DJB, nove camundongos sobreviveram. Conforme mostrado na Tabela 1, a maioria dos óbitos ocorreu durante a cirurgia ou nos 7 dias seguintes. As causas de morte pós-operatória foram sangramento (n=2) no 1º dia de pós-operatório, vazamento de anastomose (n=1) no 4º dia de pós-operatório, obstrução ...

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Discussão

Em 1953, Varco et al.18 realizaram a primeira derivação jejuno-ileal como início da cirurgia bariátrica. Desde então, inúmeras cirurgias bariátricas foram realizadas por cirurgiões. Essas cirurgias resultaram em perda de peso e melhora das complicações metabólicas 4,19,20. Além disso, em 1967, Mason e Ito21 realizaram o primeiro bypass ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por uma bolsa do Projeto de Planejamento de Ciência e Tecnologia da Província de Guangdong, na China (nº 202002020069).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Abdominal retractorF.S.T17000-03Colibri Retractor -3cm,retractor range 1.5cm/3cm long
1% sodium pentobarbital solutionGuangzhou Chemical Reagent Factory/ Dissolved 500mg of pentobarbital sodium powder in 50ml of normal saline to obtain 1% pentobarbital sodium solution.
Benzylpenicillin sodium for InjectionNorth China Pharmaceutical Company Ltd.F2062121Penicillin
BuprenorphineGuangzhou Chemical Reagent Factory/Analgesia
BuprenorphineGuangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd/Analgesic
Citric acid-sodium citrate bufferLEAGENER00522Buffer solution
Cotton budsHaoZheng Medical60220610Cotton swabs
Depilatory pasteVeetAAPR-S222Hair removal cream
Ear tagZEYASUS304Ear-mark
Electric blanketZOSENZS-CWDRTHeat pad
Electronic scaleWETTLER TOLEDO20060902-6Measure the weight
Enteral nutritional powderAbbott Laboratories/Nutrition powder
Eye ointmentGuangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd/Protect the eyes
GlucometerRoche6993788001Assess blood glucose
Graphpad Prism version 9.4.1GraphPad Softwareversion 9.4.1Software for statistical analysis
High-fat diet (High Fat [60FDC] Purified Rodent Diet)Dyets11225260kcal% High Fat Diet
Micro ForcepsJinzhong Medical18-1140Micro forceps
Micro needle holderJinzhong MedicalEMT-160-ZNeedle holder
Micro ScissorsJinzhong MedicalYBC010Micro scissors
Microscope cameraLAPSUNE 2000Video
Ophthalmic scissorsJinzhong MedicalY00030Surgical scissors
PentobarbitalGuangzhou Chemical Reagent Factory/Narcosis
Sodium chloride InjectionGuangzhou Otsuka Pharmaceutical Co., LtdB21L0301NaCl 0.9%
Stereo microscopeZEISSStemi 305Binocular stereomicroscope
StreptozotocinSigmaS110910-1gSTZ
Suture lineLINGQIAO SUTUREZS-LQPMRZ5/0Prolene 6/0,Prolene 10/0
Tissue forcepsJinzhong MedicalH1701Surgical forceps

Referências

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