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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter o vetor de expressão pVAX1-PRRSV introduzindo locais de restrição adequados na extremidade 3' das inserções. Podemos linearizar o vetor e unir fragmentos de DNA ao vetor um por um por meio da tecnologia de recombinação homóloga.

Abstract

A construção de vetores de expressão gênica é um componente importante do trabalho de laboratório em biologia experimental. Com avanços técnicos como o Gibson Assembly, a construção vetorial torna-se relativamente simples e eficiente. No entanto, quando o genoma completo do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV) não pode ser facilmente amplificado por uma única reação em cadeia da polimerase (PCR) do cDNA, ou é difícil adquirir um vetor de expressão gênica de comprimento total por recombinação homóloga de múltiplas inserções in vitro, a atual técnica de montagem de Gibson não consegue atingir esse objetivo.

Consequentemente, nosso objetivo foi dividir o genoma do PRRSV em vários fragmentos e introduzir locais de restrição apropriados no primer reverso para a obtenção de fragmentos amplificados por PCR. Depois de unir o fragmento de DNA anterior ao vetor por tecnologia de recombinação homóloga, o novo vetor adquiriu o local de clivagem da enzima de restrição. Assim, podemos linearizar o vetor usando o local de clivagem enzimática recém-adicionado e introduzir o próximo fragmento de DNA a jusante do fragmento de DNA a montante.

O local de clivagem da enzima de restrição introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a montante será eliminado e um novo local de clivagem será introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a jusante. Desta forma, podemos unir fragmentos de DNA ao vetor um por um. Este método é aplicável para construir com sucesso o vetor de expressão PRRSV e é um método eficaz para montar um grande número de fragmentos no vetor de expressão.

Introduction

Como uma técnica essencial para construir ferramentas experimentais baseadas em DNA para expressão em células procarióticas e eucarióticas, a clonagem molecular é um componente muito importante da biologia experimental. A clonagem molecular envolve quatro processos: a aquisição do DNA da inserção, a ligação da inserção no vetor apropriado, a transformação do vetor recombinante em Escherichia coli (E. coli) e a identificação dos clones positivos1. Até agora, vários métodos foram adotados para unir moléculas de DNA usando enzimas de restrição 2,3 e recombinação mediada por PCR 4,5,6. A recombinação homóloga, conhecida como tecnologia de clonagem contínua, é o grupo de métodos de clonagem que permite a inserção independente de sequência e sem cicatrizes de um ou mais fragmentos de DNA em um vetor. Essa tecnologia inclui clonagem independente de sequência e ligação (SLIC), Extrato de Clonagem de Ligação Contínua (SLiCE), In-Fusion e Gibson Assembly. Ele emprega uma exonuclease para degradar uma fita da inserção e um vetor para gerar extremidades coesivas e, seja reparo in vivo ou recombinação in vitro para unir covalentemente a inserção ao vetor, formando ligações fosfodiéster. A capacidade de unir uma única inserção a um vetor em qualquer sequência sem cicatrizes é muito atraente. Além disso, a tecnologia tem a capacidade de unir de 5 a 10 fragmentos em uma ordem predeterminada sem restrições de sequência.

Como uma das muitas técnicas de DNA recombinante, a técnica de montagem de Gibson, atualmente o método de clonagem mais eficaz 7,8, é um método robusto e elegante baseado em exonuclease para montar um ou vários fragmentos de DNA linearizados sem problemas. A reação de montagem de Gibson é realizada em condições isotérmicas usando uma mistura de três enzimas, a saber, exonuclease 5', polimerase de alta fidelidade e uma DNA ligase termoestável. As saliências de fita simples de 3 'criadas pela exonuclease 5'-3' contribuem para o recozimento de fragmentos que compartilham complementaridade em uma extremidade. A polimerase de alta fidelidade preenche efetivamente as lacunas nas regiões de fita simples recozidas adicionando dNTPs, e a DNA ligase termoestável sela os cortes para formar moléculas de DNA conjuntas8. Assim, este método técnico tem sido amplamente utilizado para a construção de vetores de expressão gênica.

A síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS) é uma doença viral que leva ao comprometimento reprodutivo e insuficiência respiratória em suínos causada pelo PRRSV em qualquer idadede 9 anos. A síndrome se manifesta como febre, anorexia, pneumonia, letargia, depressão e dificuldade respiratória. Além disso, sinais clínicos, incluindo descoloração vermelha/azul das orelhas, foram observados em algumas epidemias. Como membro da família arterivírus, o PRRSV é amplamente transmitido aos países produtores de carne suína por contato direto e troca de fluidos, incluindo urina, colostro e saliva. Devido à disseminação do PRRSV nos Estados Unidos, as perdas econômicas totais da indústria de suínos foram estimadas em aproximadamente US$ 664 milhões por ano, com base na escala de criação de 5,8 milhões de porcas e 110 milhões de suínos10,11. O relatório do Serviço de Inspeção de Saúde Animal e Vegetal mostra que 49,8% dos suínos não vacinados apresentam a presença de PRRSV no soro12 e baixos níveis de PRRSV em suínos infectados são excretados pela saliva, secreções nasais, urina e fezes13. Múltiplas estratégias foram implementadas para controlar a propagação do PRRSV 14,15,16. Além dos procedimentos de eliminação para criar populações completamente negativas para o vírus ou melhorar a biossegurança e o manejo, a administração de vacinas é um meio eficaz de controlar a PRRS.

O PRRSV é um vírus de RNA envelopado, de fita simples e de sentido positivo com um comprimento de aproximadamente 15 quilobases (kb). O genoma do PRRSV consiste em pelo menos 10 quadros de leitura abertos (ORFs), uma região curta de 5 'não traduzida (5' UTR) e uma cauda poli (A) no terminal 3 '( Figura 1A ) 17 . O genoma de um vírus de RNA de fita negativa não é infeccioso, enquanto o genoma de vírus de RNA de fita positiva é infeccioso. Existem duas estratégias principais de transfecção de RNA e DNA para gerar progênie viral18. No entanto, a clonagem do fragmento de comprimento total correspondente ao genoma do RNA é crucial para a construção de clones infecciosos. Devido à natureza longa e complexa do genoma do PRRSV, o genoma completo não pode ser facilmente obtido por PCR de uma só vez. Além disso, embora a síntese artificial de genes PRRSV seja uma solução eficaz, a síntese de fragmentos longos costuma ser cara. Assim, para obter o vetor de expressão de comprimento total PRRSV, tentamos criá-lo pelo método de recombinação homóloga de múltiplas inserções19,20. Infelizmente, não conseguimos obter o vetor de expressão gênica de comprimento total. Portanto, neste estudo, adicionamos locais de restrição apropriados ao primer reverso e obtivemos com sucesso o vetor de expressão pVAX1-PRRSV por várias rodadas de reações de recombinação homóloga. Além disso, este método também pode alcançar a deleção ou mutação de genes-alvo e unir eficientemente um grande número de fragmentos de DNA ao vetor de expressão.

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Protocol

1. Preparação do molde do gene PRRSV

  1. Descongele o estoque de vírus em 1 mL de reagente de extração de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Adicione 0,2 mL de clorofórmio e misture bem. Incubar por 3 min.
  3. Centrifugue a mistura durante 15 min a 12.000 × g a 4 °C.
    NOTA: A mistura é dividida em três fases, a saber, uma fase aquosa incolor, uma interfase e uma fase vermelha de fenol-clorofórmio.
  4. Pipetar a fase aquosa incolor e transferi-la para um novo tubo.
  5. Misture bem a fase aquosa com 0,5 mL de isopropanol e incube por 10 min a 4 ° C.
  6. Centrifugue por 10 min a 12.000 × g a 4 °C.
    NOTA: O fundo do tubo tem um precipitado de RNA branco.
  7. Use uma micropipeta para descartar o sobrenadante do tubo.
  8. Adicione 1 mL de etanol a 75% para ressuspender brevemente o pellet e o vórtice.
  9. Centrifugue por 5 min a 7.500 × g a 4 °C. Use uma micropipeta para descartar o sobrenadante do tubo.
  10. Seque o RNA por 5 min, adicione 20-50 μL de água livre de RNase para ressuspender o RNA e misture bem.
  11. Prossiga para realizar a transcrição reversa; configurar as reações para realizar a transcrição reversa, conforme mostrado na Tabela 1.
    NOTA: Para garantir uma transcrição reversa bem-sucedida, use modelos de RNA de alta qualidade.
  12. Use o cDNA resultante para PCR ou armazene-o a -20 °C.

2. Projeto de primer PCR

  1. Projetando o primer direto
    1. Abra o software e escolha Novo arquivo de DNA.
    2. Cole a sequência do gene PRRSV (GenBank: FJ548852.1) do NCBI no software. Clique em OK para gerar os arquivos de sequência.
    3. Analise a sequência e marque as junções do fragmento. Projete o primer de sequência específica direta dos fragmentos. Para a maioria dos casos, a temperatura de fusão preferível (Tm) está entre 55 °C e 62 °C, e o teor de GC é de 40-60%.
    4. Clique em Primers e escolha Add Primer.
    5. Cole a sequência específica e adicione sequências sobrepostas do vetor ao primeiro nucleotídeo 5' do primer de sequência específica. Perto de cada junção, escolha 20-40 pb para servir como a região de sobreposição entre os dois fragmentos adjacentes.
    6. Nomeie o primer direto que contém as saliências e a sequência específica (consulte a Figura Suplementar S1).
    7. Clique em Adicionar primer ao modelo.
  2. Projetando o primer reverso
    1. Analise a sequência e marque as junções de fragmentos no software. Projete o primer de sequência específica reversa dos fragmentos.
    2. Clique em Primers e escolha Add Primer.
    3. Cole a sequência específica e adicione o local de restrição ao primeiro nucleotídeo 5 'do primer de sequência específica.
      NOTA: Os sites de restrição adicionados devem estar ausentes do fragmento de inserção e do vetor, exceto para os vários sites de clonagem.
    4. Adicione sequências de vetores de saliência de 20-40 pb ao primeiro nucleotídeo 5 'do local de restrição.
    5. Nomeie o primer reverso contendo as saliências e a sequência específica (consulte a Figura Suplementar S1).
    6. Clique em Adicionar primer ao modelo.

3. PCR para amplificar fragmentos

  1. Configure seis reações de PCR individuais (Tabela 2): para o fragmento 1, use os primers P1 e P2 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 2, use os primers P3 e P4 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 3, use os primers P5 e P6 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 4, use os primers P7 e P8 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 5, utilizar os primers P9 e P10; e use os primers P11 e P12 para amplificar o fragmento 6 (ver Figura Suplementar S2).
    NOTA: Descongele, misture e centrifugue brevemente cada componente antes de usar.
  2. Execute o PCR usando o protocolo de três etapas na Tabela 2.
  3. Adicione 1 μL de tampão de carga de DNA 6x a 5 μL de produto de PCR, misture e centrifugue brevemente o conteúdo.
  4. Analise as amostras usando eletroforese em gel de agarose a 1%.

4. Purificação dos fragmentos de PCR

NOTA: Purificar os produtos de PCR de um gel usando um kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais) é importante para a construção do vetor.

  1. Adicione 9 μL de tampão de carga de DNA 6x a 45 μL de produtos de PCR, misture e centrifugue brevemente o conteúdo.
  2. Realize eletroforese em gel de agarose / goldview a 1% para separar os fragmentos de DNA.
    NOTA: Não reutilize o tampão de corrida TAE, pois seu valor de pH afetará a recuperação do fragmento de DNA.
  3. Após a separação adequada das bandas, use um bisturi afiado para extirpar cuidadosamente as bandas de DNA.
    NOTA: Minimize o tamanho da fatia de gel cortando o excesso de agarose.
  4. Pese a fatia de gel em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL, adicione um volume igual de tampão de ligação à fatia de gel (por exemplo, 0,3 mL a uma fatia de 0,3 g) e incube a 60 ° C por 7 min.
  5. Insira uma mini coluna em um tubo de coleta de 2 mL. Adicione 700 μL de solução de DNA/agarose da etapa 4.4 à mini coluna.
  6. Centrifugue a 10.000 × g por 1 min em temperatura ambiente. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
  7. Adicione 300 μL de tampão de ligação e centrifugue a 13.000 × g por 1 min em temperatura ambiente. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
  8. Adicione 700 μL de tampão de lavagem e centrifugue a 13.000 × g por 1 min em temperatura ambiente. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
  9. Gire a mini coluna vazia por 2 min na velocidade máxima para secar a matriz da coluna. Coloque a mini coluna em um tubo de microcentrífuga limpo de 1.5 mL.
  10. Adicione 20 μL de água deionizada diretamente no centro da membrana da coluna e deixe descansar em temperatura ambiente por 2 min. Centrifugue na velocidade de 13.000 × g por 1 min.
  11. Armazenar o ADN a -20 °C.

5. Preparação de um vetor linearizado

NOTA: Depois de preparar o plasmídeo, as enzimas selecionadas podem ser usadas para cortá-lo. A digestão longa ou digestão enzimática dupla é crucial para garantir a digestão de todo o DNA. Isso reduzirá o número de clones falso-positivos em experimentos subsequentes.

  1. Linearização pVAX1
    1. Preparar a mistura de reacção à temperatura ambiente pela ordem indicada (quadro 3).
      NOTA: O volume de água deve ser adicionado para manter o volume total de reação indicado. Aqui, 1 μg do plasmídeo foi digerido com enzimas na mistura de reação. Dependendo da concentração do plasmídeo, o volume do plasmídeo pode ser ajustado na mistura de reação.
    2. Misture delicadamente; então gire para baixo. Incubar a 37 °C num bloco de calor ou termóstato de água durante 60 min.
    3. Realize a purificação do gel semelhante à purificação dos fragmentos de PCR na seção 4 usando o kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Linearização pVAX1-F1
    NOTA: pVAX1-F1 é o vetor obtido da primeira rodada de recombinação de pVAX1 (NdeI e HindIII) e fragmento 1. pVAX1-F2 é o vetor obtido a partir da rodada de pVAX1-F1 (NdeI) e recombinação do fragmento 2. pVAX1-F3 é o vetor obtido a partir da rodada de recombinação de pVAX1-F2 (NdeI) e fragmento 3. pVAX1-F4 é o vetor obtido a partir da rodada de recombinação de pVAX1-F3 (NdeI) e fragmento 4. pVAX1-F5 é o vetor obtido a partir da rodada de pVAX1-F4 (EcoRV e Nto I) e recombinação do fragmento5.
    1. Para cada vector, preparar a mistura de reacção separadamente à temperatura ambiente, pela ordem indicada (quadro 3).
    2. Misture delicadamente; então gire para baixo. Incubar a 37 °C num bloco de calor ou termóstato de água durante 60 min.
    3. Realize a purificação do gel semelhante à purificação dos fragmentos de PCR na seção 4 usando o kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais).

6. Subclonagem para um novo vetor

NOTA: Boa eficiência de clonagem pode ser alcançada ao usar 50-200 ng de vetor e inserções.

  1. Configure a reação de clonagem e montagem perfeita do ExonArt (Tabela 4). Ajustar o volume total da reacção a 10 μL utilizando H2O desionizado esterilizado e misturar.
  2. Incubar a reação em um termociclador por 15-60 min a 50 °C. Armazene as amostras no gelo.
    NOTA: Estender a incubação em até 60 min pode aumentar a eficiência da montagem.
  3. Descongele células quimicamente competentes DH5α no gelo.
  4. Adicionar 10 μl do produto de montagem às células competentes; Em seguida, misture delicadamente pipetando para cima e para baixo.
  5. Coloque a mistura no gelo por 30 min.
  6. Choque térmico a 45 °C por 45 s e transfira os tubos para o gelo por 3 min.
  7. Adicione 900 μL de meio SOC ao tubo.
  8. Agitar o tubo a 225 rpm durante 1 h numa incubadora com agitação a 37 °C.
  9. Centrifugue a reação de transformação a 6.000 × g por 2 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de meio SOC fresco.
  10. Espalhar a suspensão de células transformadas numa placa LB separada com 50 μg/ml de canamicina.
  11. Incubar todas as placas durante a noite a 37 °C. Escolha colônias isoladas individuais de cada placa experimental.

7. Analisando os transformantes

  1. Escolha oito colônias em 20 μL de meio LB contendo 50 μg / mL de canamicina.
  2. Configure a reação de PCR da colônia e execute a PCR (Tabela 5).
    NOTA: Para a reação de PCR de colônia para o fragmento 1, use os primers P1 e P2 (consulte o Arquivo Suplementar 1); para o fragmento 2, use os primers P3 e P4 (consulte o Arquivo Suplementar 1); para o fragmento 3, use os primers P5 e P6 (consulte o Arquivo Suplementar 1); para o fragmento 4, use os primers P7 e P8 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 5, utilizar os primers P9 e P10; e use os primers P11 e P12 para detectar o fragmento 6 (ver Figura Suplementar S2).
  3. Adicione 1 μL de tampão de carga de DNA 6x a 5 μL do produto de PCR, misture e centrifugue brevemente o conteúdo.
  4. Analise os resultados usando eletroforese em gel de agarose a 1%.
  5. Selecione uma colônia positiva em 5 mL de meio LB contendo 50 μg / mL de canamicina e cresça durante a noite a 37 ° C.
  6. Obtenha o plasmídeo usando um minikit de DNA de plasmídeo (consulte a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  7. Visualize os resultados usando eletroforese em gel de agarose a 1%.

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Results

Neste artigo, apresentamos um sistema de recombinação in vitro para montar e reparar moléculas de DNA sobrepostas usando o primer reverso por meio de locais de restrição continuamente introduzidos (Figura 1B). Este sistema é um procedimento simples e eficiente que compreende a preparação do vetor linear e dos fragmentos de inserção contendo saliências introduzidas por PCR com primers com sequências de extensão 5' e locais de restrição apropriados; uma reacção isoté...

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Discussion

A técnica de montagem de Gibson é um método de clonagem molecular baseado em recombinação in vitro para a montagem de fragmentos de DNA8. Este método permite a montagem de vários fragmentos de DNA em um plasmídeo circular em uma reação isotérmica de tubo único. No entanto, um dos obstáculos para a técnica de Montagem de Gibson é a aquisição de longos fragmentos do cDNA. Os fragmentos longos são difíceis de amplificar com precisão por vários motivos. Por exemplo, os pr...

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo apoio financeiro dos fundos de iniciação à pesquisa de doutorado fornecidos pela China West Normal University (nº 20E059).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

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