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Resumo

Este protocolo descreve o método de emulsão invertida usado para encapsular um sistema de expressão livre de células (CFE) dentro de uma vesícula unilamelar gigante (GUV) para a investigação da síntese e incorporação de uma proteína de membrana modelo na bicamada lipídica.

Resumo

Os sistemas de expressão livre de células (CFE) são ferramentas poderosas em biologia sintética que permitem a biomimética de funções celulares como biossensoriamento e regeneração de energia em células sintéticas. A reconstrução de uma ampla gama de processos celulares, no entanto, requer a reconstituição bem-sucedida das proteínas da membrana na membrana das células sintéticas. Embora a expressão de proteínas solúveis seja geralmente bem-sucedida em sistemas CFE comuns, a reconstituição de proteínas de membrana em bicamadas lipídicas de células sintéticas provou ser um desafio. Aqui, é demonstrado um método para reconstituição de uma proteína de membrana modelo, receptor bacteriano de glutamato (GluR0), em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) como células sintéticas modelo baseado na encapsulação e incubação da reação CFE dentro de células sintéticas. Utilizando esta plataforma, é demonstrado o efeito da substituição do peptídeo sinal N-terminal de GluR0 por peptídeo sinal de proteorodopsina na translocação cotranslacional bem-sucedida de GluR0 em membranas de GUVs híbridos. Este método fornece um procedimento robusto que permitirá a reconstituição livre de células de várias proteínas de membrana em células sintéticas.

Introdução

A biologia sintética de baixo para cima ganhou interesse crescente na última década como um campo emergente com inúmeras aplicações potenciais em bioengenharia, administração de medicamentos e medicina regenerativa 1,2. O desenvolvimento de células sintéticas como pedra angular da biologia sintética de baixo para cima, em particular, atraiu uma ampla gama de comunidades científicas devido às aplicações promissoras de células sintéticas, bem como suas propriedades físicas e bioquímicas semelhantes a células que facilitam estudos biofísicos in vitro <....

Protocolo

Os reagentes e equipamentos utilizados para este estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Reações de CFE em massa na presença de pequenas vesículas unilamelares (SUVs)

  1. Preparação para SUV
    NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma hotte seguindo as instruções de segurança para trabalhar com clorofórmio.
    1. Prepare 5 mM de SUVs de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) em um frasco de vidro, transferindo 76 μL de solução estoque de POPC de 25 mg / mL dissolvida em clorofórmio.
    2. Enquanto gira suavemente o frasco de vidro, sopre um fluxo suave de argônio no frasco ....

Resultados Representativos

Antes do encapsulamento das reações CFE, duas variantes de GluR0-sfGFP contendo peptídeos sinais nativos e proteorodopsina (as sequências de peptídeos sinal são apresentadas na Tabela Suplementar 1) e o sfGFP solúvel foram expressos individualmente em reações em massa, e sua expressão foi monitorada pela detecção do sinal sfGFP usando um leitor de placas (Figura 2A). As proteínas de membrana foram expressas na ausência ou presença de SUVs de.......

Discussão

Praticamente qualquer processo celular que dependa da transferência de moléculas ou informações através da membrana celular, como sinalização celular ou excitação celular, requer proteínas de membrana. Assim, a reconstituição de proteínas de membrana tornou-se o principal gargalo na realização de vários projetos de células sintéticas para diferentes aplicações. A reconstituição tradicional mediada por detergente de proteínas de membrana em membranas biológicas requer métodos de geração de GUV, .......

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

A APL reconhece o apoio da National Science Foundation (EF1935265), dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-EB030031 e R21-AR080363) e do Escritório de Pesquisa do Exército (80523-BB)

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 nm polycarbonate filterSTERLITECH1270193
96 Well Clear Bottom PlateThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode ReaderAgilent11-120-533
Creatine phosphateMillipore Sigma10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner UnitYokogawaCSU-X1 
Density gradient medium (Optiprep)Millipore SigmaD1556Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supportsAvanti610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)Fisher Scientific05-408-129 
Folinic acid calcium salt hydrateMillipore SigmaF7878
GlucoseMillipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 camera AndorDU-897E-CS0 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrateMillipore SigmaG1501
Light mineral oilMillipore SigmaM5904
Magnesium acetate tetrahydrate Millipore SigmaM5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)Avanti610020
Olympus IX81 Inverted Microscope OlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olympus1-U2B933 
PEO-b-PBDPolymer SourceP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNAHomemadeN/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNAHomemadeN/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNAHomemadeN/A
POPC lipid in chloroform Avanti850457C
Potassium chlorideMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
Ribonucleotide Solution SetNew England BioLabsN0450
RNase Inhibitor, MurineNew England BioLabsM0314S
RTS Amino Acid SamplerBiotechrabbitBR1401801
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888
SpermidineMillipore SigmaS2626
SucroseMillipore SigmaS0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600ELITechGroupVAPRO 5600

Referências

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineeri....

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