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* Estes autores contribuíram igualmente
Este protocolo descreve o método de emulsão invertida usado para encapsular um sistema de expressão livre de células (CFE) dentro de uma vesícula unilamelar gigante (GUV) para a investigação da síntese e incorporação de uma proteína de membrana modelo na bicamada lipídica.
Os sistemas de expressão livre de células (CFE) são ferramentas poderosas em biologia sintética que permitem a biomimética de funções celulares como biossensoriamento e regeneração de energia em células sintéticas. A reconstrução de uma ampla gama de processos celulares, no entanto, requer a reconstituição bem-sucedida das proteínas da membrana na membrana das células sintéticas. Embora a expressão de proteínas solúveis seja geralmente bem-sucedida em sistemas CFE comuns, a reconstituição de proteínas de membrana em bicamadas lipídicas de células sintéticas provou ser um desafio. Aqui, é demonstrado um método para reconstituição de uma proteína de membrana modelo, receptor bacteriano de glutamato (GluR0), em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) como células sintéticas modelo baseado na encapsulação e incubação da reação CFE dentro de células sintéticas. Utilizando esta plataforma, é demonstrado o efeito da substituição do peptídeo sinal N-terminal de GluR0 por peptídeo sinal de proteorodopsina na translocação cotranslacional bem-sucedida de GluR0 em membranas de GUVs híbridos. Este método fornece um procedimento robusto que permitirá a reconstituição livre de células de várias proteínas de membrana em células sintéticas.
A biologia sintética de baixo para cima ganhou interesse crescente na última década como um campo emergente com inúmeras aplicações potenciais em bioengenharia, administração de medicamentos e medicina regenerativa 1,2. O desenvolvimento de células sintéticas como pedra angular da biologia sintética de baixo para cima, em particular, atraiu uma ampla gama de comunidades científicas devido às aplicações promissoras de células sintéticas, bem como suas propriedades físicas e bioquímicas semelhantes a células que facilitam estudos biofísicos in vitro <....
Os reagentes e equipamentos utilizados para este estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Reações de CFE em massa na presença de pequenas vesículas unilamelares (SUVs)
Antes do encapsulamento das reações CFE, duas variantes de GluR0-sfGFP contendo peptídeos sinais nativos e proteorodopsina (as sequências de peptídeos sinal são apresentadas na Tabela Suplementar 1) e o sfGFP solúvel foram expressos individualmente em reações em massa, e sua expressão foi monitorada pela detecção do sinal sfGFP usando um leitor de placas (Figura 2A). As proteínas de membrana foram expressas na ausência ou presença de SUVs de.......
Praticamente qualquer processo celular que dependa da transferência de moléculas ou informações através da membrana celular, como sinalização celular ou excitação celular, requer proteínas de membrana. Assim, a reconstituição de proteínas de membrana tornou-se o principal gargalo na realização de vários projetos de células sintéticas para diferentes aplicações. A reconstituição tradicional mediada por detergente de proteínas de membrana em membranas biológicas requer métodos de geração de GUV, .......
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
A APL reconhece o apoio da National Science Foundation (EF1935265), dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-EB030031 e R21-AR080363) e do Escritório de Pesquisa do Exército (80523-BB)
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
Filter supports | Avanti | 610014 | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |
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ISSN 2578-2614
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