Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de células endoteliais de camundongos de todo o pâncreas.

Resumo

O pâncreas é um órgão vital para manter o equilíbrio metabólico dentro do corpo, em parte devido à sua produção de hormônios metabólicos, como insulina e glucagon, bem como enzimas digestivas. O pâncreas também é um órgão altamente vascularizado, uma característica facilitada pela intrincada rede de capilares pancreáticos. Esta extensa rede capilar é composta de células endoteliais (CEs) altamente fenestradas importantes para o desenvolvimento e função do pâncreas. Assim, a disfunção dos CEs pode contribuir para a do pâncreas em doenças como diabetes e câncer. Assim, pesquisar a função dos CEs pancreáticos (CEPs) é importante não apenas para a compreensão da biologia do pâncreas, mas também para o desenvolvimento de suas patologias. Modelos de camundongos são ferramentas valiosas para estudar doenças metabólicas e cardiovasculares. No entanto, não existe um protocolo estabelecido com detalhes suficientes descritos para o isolamento de pECs de camundongos devido à população relativamente pequena de ECs e às abundantes enzimas digestivas potencialmente liberadas do tecido acinar que podem levar a danos celulares e, portanto, baixo rendimento. Para enfrentar esses desafios, criamos um protocolo para enriquecer e recuperar pECs de camundongos, combinando dissociação física e química suave e seleção mediada por anticorpos. O protocolo apresentado aqui fornece um método robusto para extrair CEs intactos e viáveis de todo o pâncreas do camundongo. Este protocolo é adequado para vários ensaios a jusante e pode ser aplicado a vários modelos de camundongos.

Introdução

O pâncreas, fundamental para o controle metabólico e a homeostase, é um órgão altamente vascularizado. O pâncreas tem funções endócrinas e exócrinas, controlando a regulação da glicose no sangue e das enzimas digestivas, respectivamente. Esses dois compartimentos estão ligados entre si pela extensa rede de vasos sanguíneos pancreáticos, facilitando a troca e o transporte de oxigênio, hormônios e enzimas. Criticamente, essa densa rede capilar penetra na ilhota de Langerhans, um aglomerado de células reguladoras de hormônios dentro do pâncreas responsável por sua função endócrina, consistindo nas células alfa (α) secretoras de glucagon, nas células beta (β) secretoras de insulina e nas células delta (δ) secretoras de somatostatina ^1,2. Embora as ilhotas representem apenas 1-2% da massa pancreática, elas recebem 20% do fluxo sanguíneo total³, destacando a importância da vasculatura das ilhotas. Os capilares pancreáticos são constituídos principalmente por células endoteliais (CEs) altamente fenestradas, que são circundadas por pericitos murais. Esses CEs capilares desempenham um papel vital no desenvolvimento, maturação e (des)função das ilhotas e formam conversas cruzadas íntimas com várias células endo e exócrinas⁴ (Figura 1).

A disfunção endotelial tem sido observada tanto no diabetes tipo 1 quanto no tipo 2, as condições mais comuns causadas pela disfunção das ilhotas pancreáticas ^5,6. Tanto a densidade microvascular quanto a morfologia das ilhotas podem ser alteradas no diabetes⁷. Além disso, o câncer de pâncreas, um tumor altamente agressivo que também pode se manifestar como diabetes, é caracterizado por alta densidade microvascular com má perfusão⁸. Dados os papéis estruturais e funcionais fundamentais dos CEs no tecido pancreático normal e doente, há uma necessidade pertinente de estudar os CEPs no desenvolvimento, fisiologia e patologia para desvendar os mecanismos que impulsionam a saúde ou as doenças.

Numerosos protocolos foram desenvolvidos para o isolamento de CEs de diferentes doenças murinas (por exemplo, cérebro ^9,10, pulmão¹¹, coração¹², fígado¹³, músculos esqueléticos¹⁴ e tecidos adiposos¹⁵) e humanas (por exemplo, cérebro¹⁶, tecido adiposo visceral^17,18, nervos periféricos¹⁹, pulmão 20,21,22 e artéria mesentérica²³) tecidos. Esses protocolos geralmente envolvem o uso de digestões enzimáticas (por exemplo, por colagenase, tripsina²⁴, dispase ^24,25 e liberase²⁶), seguidas por uma etapa de enriquecimento baseada em anticorpos. Além disso, esses protocolos tendem a depender de durações prolongadas de digestões em altas concentrações de enzimas com agitação vigorosa a 37 ° C (Tabela 1). Devido às características únicas do pâncreas, incluindo o fato de abrigar uma infinidade de enzimas digestivas endógenas, esses protocolos existentes não podem ser aplicados diretamente para isolar pECs. Primeiro, a composição da matriz extracelular (MEC) do pâncreas é diferente de outros tecidos. Embora a colagenase seja comumente usada para isolamento de EC, existem vários subtipos com diferentes capacidades de dissociação específicas do tecido, exigindo otimização. Em segundo lugar, e crucial para o isolamento de pEC, a liberação e ativação de enzimas endógenas pancreáticas podem dificultar significativamente o processo de isolamento. Para este fim, deve-se tomar cuidado para minimizar a ruptura das células acinares exócrinas (a fonte primária de zimogênios, proteases e RNase²⁷), que podem induzir mais danos celulares e resultar em baixa viabilidade celular e afetar a recuperação geral 27,28,29.

Para enfrentar esses desafios, adaptamos métodos de protocolos de isolamento de CE existentes e estabelecemos um novo protocolo adequado para isolamento de CE de pâncreas de camundongos. Especificamente, descrevemos aqui um fluxo de trabalho (Figura 2) usando colagenase Tipo I (normalmente implementada para isolamento de CE pulmonar), temperaturas de digestão mais baixas e sem agitação (para evitar a ativação de zimogênios pancreáticos) e suplementação de DNase 30,31,32 (para prevenir a apoptose induzida por DNA e melhorar a viabilidade celular, e um anticorpo para CD31 ³³ (PECAM1, um marcador pan-EC). O protocolo descrito produz populações de CE isoladas do pâncreas de camundongos que podem ser usadas para perfis de expressão gênica e ensaios de proteínas.

Protocolo

O isolamento tecidual foi realizado de acordo com o protocolo de estudo aprovado #17010 pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, Califórnia, EUA). Aqui, usamos Tie-2CreERT2; Rosa26-TdLinha de camundongos de tomate em fundo C57BL/6 com 8 a 12 semanas de idade. Nessa linha, os CEs são marcados com TdTomato quando induzidos com tamoxifeno, conforme descrito anteriormente³⁴. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para todas as idades de camundongos adultos com diferentes genótipos e origens genéticas.

1. Coleta de tecido (tempo estimado: 1-2 h)

NOTA: A estimativa de tempo é de 15 min/animal, recomenda-se no máximo 3 animais agrupados por amostras de dissociação.

1. Eutanásia dos animais por overdose de dióxido de carbono (CO₂), seguida de confirmação secundária de morte. Antes da dissecção, borrife todo o corpo com etanol a 70% (EtOH), desinfetando completamente a área de operação.
2. Estique e prenda os membros usando alfinetes. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma pequena incisão na linha média através da pele e do peritônio, começando na região abdominal inferior e estendendo-se em direção à região torácica.
3. Exponha a caixa torácica cortando o diafragma e levante a caixa torácica para expor o coração.
4. Insira uma agulha (25G-30G) conectada a uma seringa contendo PBS estéril gelada no ventrículo esquerdo do coração.
5. Inicie a perfusão injetando o PBS através do coração a uma taxa de 5 a 10 mL / min. Pare após injetar 10 mL ou até que o fígado e os rins fiquem descoloridos.
6. Após a perfusão, localize o pâncreas (abaixo do estômago e aderido ao duodeno)³⁵ (Figura 3A) e remova-o cuidadosamente com tesoura de dissecação e pinça.
7. Uma vez isolado, transfira o pâncreas para um tubo de 50 mL contendo 10 mL de PBS gelado + inibidor de tripsina 0,2 mg / mL, mantenha no gelo (Figura 3B).
   NOTA: O pâncreas de no máximo 3 camundongos pode ser agrupado nesta etapa e transferido para 1 tubo. As amostras podem ser mantidas no gelo por um tempo máximo de 2 h.

2. Preparação da colagenase (tempo estimado: 15-30 min)

1. Prepare soluções e tampões conforme descrito abaixo.
   1. Solução de dissociação: Adicione colagenase Tipo I em tubo de 50 mL a uma concentração final de 1 mg / mL em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS 1x (Ca²⁺, Mg²⁺; ver Tabela de Materiais) e 0,001 U / mL DNase I + 0,2 mg / mL de inibidor de tripsina.
   2. Solução de parada de dissociação: Adicione solução salina tamponada com fosfato (PBS 1x, sem Ca²⁺, Mg²⁺; o mesmo para todo o resto PBS neste protocolo; ver Tabela de Materiais), 5% de Albumina de Soro Bovino (BSA), 0,001 U / mL DNase I ou DMEM + 10% FBS + 0,001 MU / mL DNase I.
   3. Tampão de lavagem: Adicione PBS 1x, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 0,001 U / mL de DNase I + 0,05 mg / mL de inibidor de tripsina.
2. Dissolva completamente os tampões e filtre através de um filtro de 0,22 μm. Reserve e mantenha no gelo.

3. Digestão (tempo estimado: 40 min-1 h)

1. Remova o pâncreas do PBS gelado e coloque na placa de Petri em cima do gelo. Remova cuidadosamente o excesso de tecido (por exemplo, baço, gordura, detritos) com tesouras cirúrgicas e pinças (Figura 3C).
   NOTA: É crucial remover a gordura, pois o excesso de lipídios pode interferir na digestão dos tecidos.
2. Transfira o pâncreas de camundongo aparado para um tubo de 5 mL contendo 1 mL de solução de dissociação.
3. Mantenha o tubo no gelo e pique os tecidos pancreáticos com uma tesoura de dissecação em pedaços finos pipetáveis, por exemplo, 0,5 mm ou 1 mm. Transfira o lisado para um tubo de 50 mL e mantenha no gelo.
4. Adicione mais pâncreas ao tubo de 5 mL usado para picar inicialmente o tecido pancreático e adicione mais 1 mL de colagenase. Repita conforme necessário para várias preparações de pâncreas.
5. Adicione 2 mL de solução de colagenase ao tubo de 5 mL para remover qualquer tecido pancreático residual e transfira para o tubo de 50 mL. O volume total da colagenase deve ser de 5 mL para 3 pâncreas ou 3 mL para um único pâncreas.
6. Uma vez que todas as amostras tenham sido submetidas à dissociação mecânica, transfira os tubos de 50 ml contendo os lisados de tecidos homogeneizados para um banho-maria a 37 °C e incube durante 10 min.
   NOTA: Não agite vigorosamente ou agite vigorosamente a mistura de tecidos durante este processo, pois isso pode causar a ruptura dos tecidos acinares e a liberação de enzimas endógenas abundantes e DNA.
7. Retire os tubos do banho-maria e agite suavemente para misturar bem, e deixe em banho-maria por mais 10 min.
   NOTA: Não exceda 30 min em banho-maria a 37 °C para evitar a digestão excessiva.
8. Coloque os tubos no gelo e deixe o homogeneizado assentar por gravidade. Uma vez assentado, transferir o sobrenadante através de um filtro de 70 μm e adicionar 5 ml de solução de parada de dissociação.
9. Adicione mais 1 ml de solução de dissociação ao sedimento restante e triture com uma agulha 18G.
10. Passe o homogeneizado restante pelo filtro e lave com mais 5 ml de solução de parada de dissociação.
11. Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g durante 10 min, a 4 °C. Remover completamente o sobrenadante por aspiração e manter o sedimento celular no gelo.
12. Ressuspenda o pellet celular com 1 mL de tampão de lavagem e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
13. Pegue uma pequena alíquota do pellet de célula ressuspensa (10 μL) e misture com azul de tripano na proporção de 1:1 para contar as células usando um contador de células e medir a viabilidade.

4. Enriquecimento de células endoteliais (CE) (tempo estimado: 2-3 h)

1. Adicione 1 μL de anticorpo anti-CD31-biotina para cada 1 x 10⁷ células contadas e incube por 30 min a 4 ° C em um rotador (cerca de 5 μL por 3 pâncreas).
2. Adicione 20 μL de microesferas anti-biotina e incube por 40 min a 4 ° C em um rotador de tubo.
3. Configure um suporte magnético com o suporte do separador de coluna e aplique a coluna. Equilibre a coluna com 3 mL de tampão de lavagem.
4. Adicione sample à coluna e lave com um total de 9 mL de tampão de lavagem.
   NOTA: Se a concentração de células for alta, dilua as células com mais 2 mL de tampão de lavagem em um tubo separado. Adicione 1 mL de amostra de cada vez na coluna para evitar que a coluna entupa.
5. Remova a coluna do suporte da coluna e coloque em um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de tampão de lavagem à coluna. Use o êmbolo para empurrar as células para baixo na coluna e coletar a eluição (que contém EC enriquecido).
6. Centrifugar para baixo o escoamento e a fracção de eluição/EC a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Conte as células e meça a viabilidade como na etapa 3.13.
7. Valide o enriquecimento de EC via qPCR de frações de fluxo e EC. Use NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) como um marcador geral para células endócrinas e molécula de adesão plaquetária e endotelial (Pecam1) como um marcador para EC³³. Use 36B4 (Rplp0, fosfoproteína ribossômica ácida p0) como um controle interno para a normalização da expressão gênica.
   NOTA: As amostras coletadas podem ser usadas para análises de proteínas ou RNA nesta etapa.

5. Cultura de pECs

1. Preparar o meio M199. O suplemento M199 é médio a uma concentração final de 20% de soro fetal bovino (FBS) e 0,1% de penicilina-estreptomicina.
2. Cubra uma placa de cultura de células de 60 mm com colágeno tipo I (1 mg / mL em ácido acético 0,1 M) e deixe descansar por 30 min em temperatura ambiente.
3. Remova o colágeno tipo I e enxágue a placa com 1X PBS, duas vezes. Adicione 2 mL de meio M199 preparado e coloque a placa de cultura de células na incubadora de cultura de células padrão (5% CO₂, 37 ° C) por 5 min.
4. Uma vez que as células tenham sido isoladas, adicione células isoladas à placa de cultura de células M199 pré-aquecida. Mantenha as células em condições de cultura por aproximadamente 14 dias e troque o meio a cada 2-3 dias.

Resultados

Seguindo este protocolo, aproximadamente 2 x 10⁶ células vivas podem ser obtidas ao agrupar 3 pâncreas de camundongos e 750.000 células de um único pâncreas de camundongo. Para validar o enriquecimento da CE, realizamos as seguintes análises: 1) PCR quantitativo: em comparação com as amostras de fluxo contínuo (FT) (ou seja, as frações ligadas ao anticorpo não CD31), as frações de CE apresentaram níveis significativamente mais altos de Pecam1 (codifican...

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo para enriquecimento e isolamento dos pECs. Semelhante aos protocolos anteriores de isolamento de CE de outros tecidos ou órgãos, este protocolo consiste em três processos principais, a saber, dissociação física, digestão enzimática e enriquecimento de CE baseado em anticorpos. Para enfrentar os desafios únicos no processamento do pâncreas, introduzimos várias adaptações importantes e etapas críticas em nosso protocolo: 1) uma digestã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath