Imagem e quantificação da vasculatura hepática de camundongos usando ultrassom Doppler ultrarrápido

Resumo

A ultrassonografia Doppler ultrarrápida (UFUS) com alta resolução espacial (100 μm) e sensibilidade representa uma modalidade de imagem não invasiva adequada para obter uma visão qualitativa abrangente da vasculatura hepática. O UFUS também facilita as medições quantitativas da microvasculatura, com o objetivo de melhorar nossa compreensão dos mecanismos das doenças vasculares.

Resumo

A imagem in vivo não invasiva da vasculatura é uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos da doença em roedores. Para obter imagens de alta sensibilidade da microvasculatura usando métodos de ultrassom Doppler, as modalidades de imagem que empregam o conceito de imagem ultrarrápida são preferidas. Ao aumentar a taxa de quadros do scanner de ultrassom para milhares de quadros por segundo, torna-se possível melhorar a sensibilidade do fluxo sanguíneo para 2 mm/s e obter informações funcionais sobre a microcirculação em comparação com uma sensibilidade de cerca de 1 cm/s nos modos Doppler convencionais. Embora a imagem de ultrassom Doppler ultrarrápido (UFUS) tenha sido adotada na neurociência, onde pode capturar a atividade cerebral por meio do acoplamento neurovascular, ela apresenta maiores desafios ao obter imagens da vasculatura dos órgãos abdominais devido a movimentos maiores ligados à respiração. O fígado, posicionado anatomicamente sob o diafragma, é particularmente suscetível ao movimento fora do plano e ao movimento respiratório oscilante. Esses artefatos não apenas afetam adversamente a imagem Doppler, mas também complicam a análise anatômica das estruturas vasculares e o cálculo dos parâmetros vasculares. Aqui, apresentamos uma análise de imagem qualitativa e quantitativa da vasculatura hepática em camundongos por UFUS. Identificamos as principais estruturas vasculares anatômicas e fornecemos ilustrações gráficas da anatomia macroscópica hepática, comparando-a com uma avaliação anatômica aprofundada da vasculatura hepática com base em leituras Doppler. Além disso, desenvolvemos um protocolo de quantificação para medições robustas do volume sanguíneo hepático da microvasculatura ao longo do tempo. Para contemplar pesquisas futuras, a análise vascular qualitativa fornece uma visão abrangente e sugere uma terminologia padronizada para pesquisadores que trabalham com modelos de doença hepática em camundongos. Além disso, oferece a oportunidade de aplicar o ultrassom como um método complementar não invasivo para inspecionar defeitos vasculares hepáticos in vivo e medir alterações microvasculares funcionais profundamente dentro do órgão antes de desvendar anomalias de vasos sanguíneos nos níveis de escala de mícron usando coloração ex vivo em seções de tecido.

Introdução

Modelos pré-clínicos de camundongos são amplamente utilizados para estudar o início e a progressão da doença microvascular hepática ^1,2. O acompanhamento longitudinal é vantajoso, pois as alterações capilares sanguíneas ocorrem em um estágio inicial da doença, antes do aparecimento da inflamação e da fibrose, o que pode resultar em cirrose ao longo do tempo¹. Para investigar a progressão da doença, poderosas ferramentas de imagem são essenciais para visualizar e medir a função dos vasos sanguíneos in vivo. A ultrassonografia ultrarrápida com Doppler (OVNI) representa uma modalidade adequada devido ao seu baixo custo, portabilidade, simplicidade e capacidade em tempo real, mas também por ser um procedimento não invasivo e que economiza tempo³. Em comparação com a ultrassonografia Doppler convencional, que pode atingir uma resolução espacial semelhante, mas é restrita a grandes fluxos sanguíneos, a USNI permite detectar fluxo sanguíneo lento de até 2 mm/s a partir de 1 cm/s, permitindo sondar a contribuição de vasos muito menores⁴. O UFUS melhora a sensibilidade, o que é realizado por meio de transmissões de ondas planas com um grande campo de visão em uma única insonificação para aumentar a taxa de quadros e, portanto, o número de imagens de ultrassom disponíveis⁵. O elevado número de amostras temporais melhora o cancelamento do sinal proveniente do tecido e aumenta a detecção dos ecos refletidos pelos espalhadores de sangue, aumentando a sensibilidade sem a necessidade de agentes de contraste⁶. Ao estimar a energia dos ecos do espalhador de sangue por meio da estimativa do Power Doppler, obtém-se uma quantidade proporcional ao volume sanguíneo em cada pixel, mesmo que os vasos sanguíneos sejam muito pequenos para serem resolvidos na imagem⁷.

O UFUS oferece uma combinação favorável de resolução espacial e temporal, tornando-se uma ferramenta adequada para a avaliação qualitativa da arquitetura vascular hepática. Embora operar um scanner de ultrassom seja relativamente simples, é necessária uma compreensão abrangente da anatomia do fígado para navegar pela vasculatura hepática dos diferentes lobos do fígado em camundongos. Estudos recentes têm se concentrado em descrever a anatomia do fígado murino e a árvore vascular hepática usando a microtomografia computadorizada 3D (μ-CT)^8,9. Embora algumas das diferenças morfológicas entre fígados humanos e de camundongos estejam bem documentadas¹⁰, pesquisas realizadas em roedores geralmente adotam terminologias anatômicas relevantes para humanos, levando a alguma confusão no contexto de animais quadrúpedes. Mesmo a nomenclatura padronizada reconhecida, como Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), carece de informações suficientes sobre terminologias consistentes para estruturas vasculares hepáticas de roedores¹¹. Além do desafio de estruturas anatômicas mal documentadas em roedores, surgem dificuldades ainda maiores na interpretação das leituras de ultrassom, principalmente quando uma abordagem reprodutível é antecipada.

A obtenção de informações funcionais não invasivas sobre órgãos vivos em várias escalas espaciais apresenta desafios para imagens in vivo ³. Modalidades de imagem hepática de ponta, como TC, ressonância magnética e angiografia (MRI/MRA) ou Doppler convencional usando ondas focalizadas, são essenciais para avaliar a progressão da doença, mas falham em capturar a maioria das dinâmicas do fluxo sanguíneo, com exceção da imagem fotoacústica 12,13,14. O OVNI tem alta sensibilidade e pode detectar fluxo sanguíneo lento em pequenos vasos, que não se limitam a um fluxo maior que um centímetro por segundo ^4,15. Recentemente, desenvolvemos um método de imagem personalizado baseado em considerações anatômicas usando OVNIs, permitindo a medição confiável do volume sanguíneo hepático em um modelo de camundongo com expansão vascular¹⁶.

Neste protocolo, descrevemos o procedimento para imagens não invasivas de OVNIs do fígado usando uma plataforma de ultrassom disponível comercialmente originalmente desenvolvida para imagens cerebrais funcionais. Para agilizar o processo e melhorar a recuperação de informações, oferecemos uma ilustração abrangente do fígado de camundongo com nomenclatura anatômica e um método completo de análise. Além disso, fornecemos uma representação detalhada das leituras de imagem adquiridas como referência, indicando estruturas anatômicas comuns e pontos de referência para auxiliar na seleção do plano dependente do operador. Além disso, incluímos uma ilustração relevante de análises qualitativas e quantitativas da vasculatura hepática.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a legislação europeia (Diretiva 2010/63/UE) e diretrizes do governo holandês e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Centro Médico da Universidade de Leiden.

1. Preparação do mouse para imagens de OVNIs (Tempo ~ 10 min)

1. Preparação do setup de imagem
   1. Centrifugue o gel de transmissão de ultrassom em tubos de 50 mL a 100 x g por 3-5 min para evitar a formação de bolhas de ar.
   2. Ligue a almofada de aquecimento e aqueça até 35 °C. Encha o tanque de água impresso em 3D com água deionizada.
      NOTA: Bolhas de água ou pequenas partículas presentes na água podem perturbar a medição Doppler.
2. Anestesia do animal
   1. Pese o animal. Foram utilizados companheiros de ninhada machos e fêmeas com 8-16 semanas de idade com um peso corporal de 19-32 g. Prepare uma mistura anestésica de cetamina com uma dose de administração de 100 mg / kg e xilazina 10 mg / kg em NaCl a 0,9%. Prepare a mistura estéril e fresca todos os dias, pois a mistura não é estável e pode perder potência.
      NOTA: O peso corporal do animal preferido é entre 23-30 g.
   2. Desinfetar o local da injeção, ou seja, quadrante inferior direito ou esquerdo do abdômen, usando gaze e etanol a 70%. Injete 10 μL / g de peso corporal intraperitoneal (ip) com uma agulha de 27G e uma seringa descartável de 1 mL ou uma seringa de insulina de 30G.
   3. Coloque o animal de volta em uma gaiola em uma almofada de aquecimento sem fechar a tampa da gaiola. Iniciar temporizador.
      NOTA: A anestesia profunda deve durar aproximadamente 40 min. Se desejar uma sessão de imagem mais longa, considere o uso de anestesia reversível, como misturas de cetamina 60 mg / kg e medetomidina 0,4 mg / kg em NaCl a 0,9%, seguida de reversão com injeção subcutânea de atipamezol 1 mg / kg. A anestesia por injeção é preferível à anestesia inalatória devido à configuração de imagem.
   4. Verifique a eficácia da anestesia. Confirme se a anestesia está funcionando beliscando suavemente as patas traseiras após aproximadamente 5 min. Se o animal ainda reagir, espere mais 2-3 minutos para obter a anestesia completa.
   5. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento da córnea e traumas oculares quando o animal estiver dormindo profundamente. Verifique os reflexos novamente e inicie o procedimento somente quando o animal não mostrar reação ao beliscão.
3. Preparo da área de imagem (Figura 1)
   1. Apare a barriga do animal suavemente com um aparador veterinário enquanto ele é colocado em uma almofada de aquecimento. Execute o corte com muito cuidado, sem aplicar compressão no tórax ou abdômen.
   2. Aplique o creme depilatório por no máximo 2 min.
      CUIDADO: Não prolongue o tempo de incubação do creme depilatório, pois pode causar inflamação da pele. Isso não afeta apenas a qualidade da imagem, mas também pode causar desconforto para o animal.
   3. Retire o creme depilatório com alguns lenços de papel e limpe suavemente com água morna.
4. Posicione o animal e a configuração de imagem para medições Doppler (Figura 2A).
   1. Posicione o animal dorsalmente em uma almofada de aquecimento e prenda suavemente as patas com fita adesiva. Hidrate a pele com uma pequena quantidade de água morna.
   2. Aplique o gel de transmissão de ultrassom centrifugado diretamente na pele raspada usando uma seringa de 20 mL.
      NOTA: Bolhas de ar podem afetar a imagem Doppler e causar artefatos.
   3. Coloque o tanque de água impresso em 3D cheio de água acima do animal. Certifique-se de que a altura do tanque de água seja adequada para o animal, aproximadamente 1 mm acima dele, e não aperte o animal.
   4. Verifique se há ar entre o gel de transmissão de ultrassom e o termoplástico de polimetilpenteno (PMP) do tanque de água.

2. Operação da sonda e seleção do plano (Tempo ~ 10 min)

1. Inicie o software e crie uma sessão experimental no sistema. Inicie o software de digitalização.
   NOTA: O software de digitalização está integrado ao sistema.
2. Centralize os motores clicando em Sim na janela pop-up. Um sistema motorizado é usado para controlar remotamente a sonda por software de digitalização. Ao centralizar os motores, a sonda se moverá automaticamente em três direções, ou seja, verticalmente, lateralmente e girada. Certifique-se de que nenhum objeto atrapalhe a trajetória da sonda para evitar danos ao equipamento.
   NOTA: É crucial centralizar os motores; não fazer isso pode levar à disfunção do software.
3. Crie uma nova sessão experimental selecionando Sessão no menu. Preencha as informações necessárias no painel da sessão, incluindo Projeto, Assunto, Sessão, Nome de usuário, Comentário e Tag. Clique em Validar.
   NOTA: A sessão precisa ser criada antes de adquirir ou salvar dados de imagem. As informações da sessão podem ser alteradas durante o experimento, mas lembre-se de que isso também alterará o destino para salvar os dados.
4. Posicione a sonda. A sonda ultrassônica linear de 15 MHz com 128 elementos é conectada ao sistema através de um sistema motorizado composto por um módulo motor de quatro eixos, ou seja, três sentidos de movimento translacional e um rotacional.
   1. Vá para o menu Mover sonda e use o sistema de posicionamento controlado por computador para mover a sonda para a água no tanque de água impresso em 3D. Utilize os botões de controle indicados na posição da sonda para mover os motores, definindo os passos em mm para o movimento de translação (X, Y e Z) ou em ° para o movimento rotacional (R). Para evitar acidentes na direção Z, defina o limite Z em Segurança.
      NOTA: É crucial que os elementos da sonda estejam em contato com a água. No entanto, evite mover a sonda completamente para a água, pois isso pode danificar o equipamento. Se os motores não conseguirem alcançar a posição, um aviso Fora do espaço de trabalho será exibido.
   2. Salve as coordenadas como uma posição de referência clicando em Definir início. Não modifique translações e rotações simultaneamente porque R é relativo a X, Y e Z. Sempre clique em Definir Início antes de modificar R.
   3. Defina parâmetros de imagem e visualização. Vá para o menu Live view e clique em Reproduzir para selecionar o plano de interesse.
      CUIDADO: Inicie apenas uma visualização ao vivo ou uma aquisição quando os elementos da sonda de ultrassom estiverem cercados por um meio que corresponda à impedância acústica para garantir a vida útil do equipamento e evitar superaquecimento.
5. Escolha os parâmetros de imagem em Predefinição.
   1. Carregue uma sequência de ultrassom ultrassensível Doppler de 10 ms com o botão Load Sequence , por exemplo, 11 ondas planas compostas (ângulos de -10° a 10°) com uma tensão de imagem de 25 V e uma taxa de quadros Doppler de 10 ms.
      NOTA: Não há necessidade de usar uma sequência Doppler rápida (por exemplo, 10 ms) para obter imagens e filtrar os movimentos respiratórios do órgão durante a análise.
   2. Defina a profundidade de imagem entre 1 mm e 50 mm, com uma profundidade máxima de imagem de 50 mm. A configuração padrão é uma profundidade de 9 mm de 1 mm a 10 mm, com a profundidade recomendada entre 2 mm e 12 mm.
      NOTA: Dependendo do tamanho do animal e do tanque de água, a profundidade da imagem pode ser adaptada às necessidades específicas.
6. Selecione os parâmetros de visualização.
   1. Escolha Doppler para obter imagens da vasculatura.
      NOTA: A intensidade do pixel na UA representa o volume sanguíneo e deve ser comparada apenas ao usar a mesma sonda e sequência.
   2. Escolha Média para aplicar a média temporal para otimizar a relação sinal-ruído.
      NOTA: A média temporária das imagens aumenta a qualidade da imagem, mas reduz a taxa de quadros. Dependendo do objetivo, um trade-off adequado deve ser feito.
   3. Escolha Compactação de imagem: Logarítmica (alta), Raiz quadrada (intermediária) ou Linear (baixa). Como alternativa, adapte a faixa de contraste automaticamente ou manualmente usando controles deslizantes para opções de alto e baixo contraste.
      NOTA: Os dados não são afetados pela escolha da compactação da imagem; afeta apenas a exibição da imagem em tempo real.
   4. Selecione a escala do Mapa de Cores de preto para branco marcando a opção Cinza ou de preto-avermelhado para amarelo marcando Quente.
7. Seleção de plano (Figura 2B)
   1. Selecione o plano de imagem em pontos de referência anatômicos. Alterne entre a visualização do Doppler e do modo B para se familiarizar com a anatomia dos lobos e da vasculatura do fígado.
   2. Pare a visualização ao vivo clicando no ícone Parar .
   3. Vá para o menu Mover sonda para navegar na sonda e selecione um plano clicando em Definir Início para salvar as coordenadas como uma posição de referência. Certifique-se de que a árvore vascular esteja bem definida e visível com o mínimo possível de sinal fora do plano.
   4. Volte para o menu Visualização ao vivo e clique no ícone Parar .

3. Aquisição de varredura Doppler (Tempo ~ 20 min)

1. Inicie uma aquisição Doppler com uma taxa de quadros de 10 ms.
   1. Vá para o menu fUS 2D para visualizar as variações hemodinâmicas ao longo do tempo em uma posição específica (Figura 3). Para aumentar o contraste, administrar um bolus de 50 μL por via intravenosa (iv) microbolhas injetadas com uma concentração de 2 x 10⁸ microbolhas por mL na veia caudal.
   2. No toque em Predefinição, defina a duração total da gravação em segundos (30 s). Escolha um modo contínuo sem pausa entre as imagens, definindo Tempo entre imagens para 0 s.
   3. Pressione o botão Gravar para iniciar a aquisição 2D. A gravação pode ser cancelada pressionando o botão Parar . Os dados podem ser perdidos quando a aquisição é interrompida antes da conclusão.
2. Visualize e adapte a gravação adquirida.
   1. Modifique o contraste e o mapa de cores, se desejar, ao tocar em Visualização. Reproduza a gravação, se necessário, percorrendo os quadros com o controle deslizante, que está incluído na função Tempo.
3. Salve os dados.
   1. Forneça um nome para a gravação adquirida para salvar o arquivo em um formato .scan na pasta da sessão. Uma janela pop-up para salvar os dados é proposta automaticamente no final de cada gravação. Os dados são salvos automaticamente.
4. Inicie outra aquisição clicando na guia Predefinição e repita a partir da etapa 3.1.1.
5. Remova a configuração de imagem e cuide do animal.
   1. Vá para o menu Mover sonda para mover verticalmente a sonda para fora do tanque de água impresso em 3D. Remova a configuração e o gel ultrassônico e solte o animal.
   2. Eutanasiar o animal quando o desenho experimental atingir o ponto final; caso contrário, continue com as etapas a seguir.
   3. Aplique um pouco de creme hidratante na área da pele raspada do animal se as medições longitudinais forem pretendidas.
   4. Coloque o animal de volta na gaiola e deixe-o acordar da anestesia sob uma lâmpada de calor para evitar hipotermia. Monitore o animal durante a recuperação.
   5. Coloque o animal de volta no suporte da gaiola ventilado individualmente quando ele andar normalmente novamente. Termine os experimentos com animais de laboratório antes de analisar o conjunto de dados.

4. Análise quantitativa (Timing ~ 1 h)

1. Abra o script de análise gui_analysis.m disponível no Arquivo Suplementar 1.
2. Selecione a varredura e defina os parâmetros quantitativos nas configurações: 10 regiões de interesse (ROIs) com um tamanho de voxel de 2 x 2. Escolha 40 ms para cada quadro para realizar a integração Doppler.
3. Desenhe a periferia vascular do órgão; as 10 ROIs são automaticamente pré-posicionadas entre artérias claramente visíveis e podem ser ajustadas manualmente, se necessário (Figura 4A). Feche a caixa de diálogo flutuante quando estiver satisfeito com o posicionamento. Garanta uma aquisição estável (Figura 4B) para um cálculo robusto do volume sanguíneo, evitando aquisições afetadas por artefatos de movimento forte (Figura 4C).
4. Quantifique o volume sanguíneo hepático médio em UA do total de 10 ROIs, estimando automaticamente a média e o desvio padrão dos valores do quadro silencioso dentro do registro de 30 s (Figura 4D).
   NOTA: A tabela de dados de intensidades de ROIs pode ser copiada/colada diretamente em um arquivo de planilha.
5. Repita a análise para pelo menos dois planos adicionais, -0,3 mm e -0,6 mm, na direção caudal. Quantifique todos os dados de aquisição antes de realizar a análise estatística.
6. Verifique o desvio padrão das intensidades em toda a imagem e determine um ponto de corte como a média geral (μ) com 2 desvios padrão (2σ) para excluir objetivamente medições suscetíveis a artefatos de movimento (Figura 4E).
   NOTA: A média e o desvio padrão dos valores de quadro silencioso estimados em toda a imagem são fornecidos na primeira linha da tabela de dados.
   CUIDADO: Os artefatos de movimento impedem a quantificação robusta e devem ser identificados objetivamente com base na análise de toda a imagem temporal.
7. Tome a média de todo o volume médio de sangue hepático quantificado em 3 planos diferentes em 30 ROIs por animal na etapa 4.3 (Figura 4F). Aplique o teste ROUT 1% em um software de análise estatística para identificar ROIs discrepantes antes de calcular a média de 30 ROIs por animal. Para melhorar a estimativa do volume sanguíneo, registre planos adicionais por animal.
8. Para administrar o tratamento veicular, desinfetar o local da injeção, ou seja, quadrante inferior direito ou esquerdo do abdômen, utilizando gaze e etanol a 70%. Injete 20 μL de solução salina ou DMSO ip com uma agulha 27G e uma seringa descartável de 1 mL ou uma seringa de insulina 30G ou administre 100 μL de (hidroxipropil) metilcelulose por gavagem usando uma agulha de alimentação reutilizável 30G com ponta redonda. Plote os dados de 3 coortes que receberam solução salina ou DMSO por ip ou administração oral (po) de celulose (Figura 4G). Realizar análises de forma cega sem revelar a condição e/ou tratamento recebido.
   NOTA: A administração do veículo não tem impacto nas medições do volume sanguíneo.

Resultados

Seguindo o protocolo, a imagem da vasculatura hepática é facilitada com base na padronização das estruturas anatômicas e na terminologia correspondente (Figura 1). Para propor uma nomenclatura padronizada para pesquisadores usando modelos hepáticos pré-clínicos, exibimos esquematicamente o posicionamento hepático comum na cavidade abdominal de camundongos (Figura 1A), fornecemos o arranjo estrutural dos diferentes lobos hepáticos (Figura 1B) e especificamos a rede vascular arterial (Figura 1C). Equipado com experiência anatômica, a imagem in vivo do UFUS foi realizada utilizando um tanque de água impresso em 3D para reduzir os artefatos de movimento (Figura 2A). A impedância acústica foi corrigida com a introdução da sonda na água e aplicação de gel de transmissão de ultrassom diretamente na pele raspada do animal. Ao adotar essa configuração, a respiração e outros artefatos de movimento são reduzidos, pois a sonda não está em contato direto com o tórax e o abdômen em movimento do animal. Dessa forma, visualizamos a estrutura vascular dos lobos direito e esquerdo, que são facilmente acessíveis pela UFUS devido à sua localização superficial (Figura 2B). Outros lobos do fígado, como o lobo caudado e o lobo quadrado, estão situados mais profundamente no corpo, tornando mais difícil identificar anatomicamente a vasculatura hepática adequadamente pelo UFUS.

Tendo demonstrado a importância de indicações e interpretações anatômicas padronizadas e comumente aceitas das estruturas vasculares, realizamos várias varreduras com Doppler em vários planos para fornecer uma visão abrangente da vasculatura hepática visualizada pelo UFUS com contraste em camundongos (Figura 3). Delineamos a rede arterial hepática dos lobos hepáticos individuais, ou seja, lobos lateral esquerdo (LL), medial esquerdo (LM), lateral direito (RL) e medial direito (RM). Além disso, as principais artérias são rotuladas, como aorta abdominal (AA), artéria hepática (HAS), artéria hepática lateral esquerda (IHHA) e artéria hepática medial direita (RMHA). É importante observar que os lobos do fígado podem ser posicionados de forma ligeiramente diferente, dependendo da localização e do movimento peristáltico do intestino delgado (SM), bem como do estado do enchimento do estômago (S). Esta visão geral aprimorada por contraste de toda a vasculatura hepática de camundongo fornece um atlas vascular abrangente para imagens hepáticas in vivo por UFUS.

Uma seleção precisa dos planos anatômicos é crucial para obter uma leitura quantitativa derivada de um lobo hepático. Medições robustas do volume sanguíneo podem ser obtidas selecionando manualmente 10 regiões de interesse (ROI) por plano (Figura 4A). Para uma quantificação confiável do volume sanguíneo da microcirculação, é necessária uma aquisição estável com baixa variação nas intensidades médias da imagem. Isso é determinado com base no valor médio da imagem (MIV) de toda a imagem ao longo do tempo (Figura 4B), em contraste com uma gravação suscetível a artefatos de movimento significativos (Figura 4C). Para lidar com artefatos de movimento, a seleção automática de baixa MIV foi usada para quantificação confiável das medições do volume sanguíneo hepático (Figura 4D), plotando o desvio padrão de toda a MIV baixa temporal de uma imagem inteira (Figura 4E). Varreduras Doppler de vários planos por animal mostram intra e intervariabilidade aceitável dentro e entre camundongos de 3 coortes diferentes após tratamento atípico em 30 ROIs por animal com teste ROUT 1% (Figura 4F). Para melhorar a estimativa do volume sanguíneo por animal, recomenda-se registrar planos adicionais ou aumentar o número de ROIs selecionados por plano. Além disso, as leituras do volume sanguíneo podem ser usadas para monitorar o tratamento medicamentoso, visando especificamente a microvasculatura. Ao administrar o veículo por duas vias de administração, demonstramos que não há efeito nas medidas do volume sanguíneo hepático (Figura 4G). Esses resultados indicam que a deleção do gene ou a entrega do tratamento não é afetada pela administração do veículo, garantindo um desenho experimental robusto. No geral, um protocolo quantitativo objetivo e reprodutível é fornecido para pesquisas futuras para explorar defeitos vasculares hepáticos em vários modelos de camundongos.

Figura 1: Anatomia do fígado murino. (A) Visão geral esquemática do posicionamento do fígado na cavidade abdominal sob o diafragma do camundongo. (B) Descrição esquemática do fígado murino com quatro lobos hepáticos, ou seja, lobo esquerdo, quadrado, caudado e direito, e a tríade portal consistindo na veia porta, artéria hepática e ducto biliar. (C) Ilustração esquemática da rede arterial da vasculatura háptica. Identificação de artérias hepáticas (AH) e ramos (ramo) com nomenclatura latina fornecida. Abreviatura: HA = artéria hepática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ultrassom Doppler ultrarrápido (UFUS) da vasculatura hepática em camundongos. (A) Visão geral esquemática da configuração experimental para imagens in vivo não invasivas. (B) Ilustrações esquemáticas da direção da imagem e representantes associados do lobo medial direito e esquerdo, bem como do lobo lateral esquerdo, fotografados pelo UFUS. Abreviatura: AA = Aorta abdominal, LLL = Lobo lateral esquerdo, LML = Lobo medial esquerdo, RML = Lobo medial direito. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Ultrassonografia ultrarrápida com Doppler (OVNI) representativa da vasculatura hepática murina. Uma visão geral de toda a vasculatura hepática de um camundongo adulto fotografada em 3 posições, ou seja, lateral direita, medial e lateral esquerda, em 4 planos do crânio para o caudal. A referência está situada diretamente sob o diafragma visualizada em medial e 1 cm lateral à direita e à esquerda, com os mesmos planos na direção caudal. Abreviatura: AA = Aorta abdominal, HA = Artéria hepática, LLL = Lobo lateral esquerdo, LLHA = Artéria hepática lateral esquerda, LML = Lobo medial esquerdo, RLL = Lobo lateral direito, RMHA = Artéria hepática medial direita, RML = Lobo medial direito, SI = Intestino delgado, S = Estômago. Barra de escala de 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Medição quantitativa do volume sanguíneo hepático por ultrassom Doppler ultrarrápido (UFUS). (A) Representantes do lobo medial (ML) de camundongos de controle adultos C57BL / 6 do tipo selvagem no plano 1 selecionados sob o diafragma, correspondendo a 0 mm, plano 2 a -0,3 mm e plano 3 a -0,6 mm com uma seleção de 10 regiões de interesse (ROIs). Barra de escala 1 mm. Ilustração do Power Doppler de 30s com (B) aquisição estável (cinza) e (C) movimento do tecido (vermelho) com base nos valores médios da imagem em unidades arbitrárias (UA) de toda a imagem para avaliação quantitativa. (D) Reconhecimento automatizado de baixas intensidades (UA) para medição quantitativa do volume sanguíneo ao longo do tempo. (E) Desvio padrão (St. Desvio) de baixas intensidades plotado para identificar aquisições instáveis (vermelho) causadas por artefatos de movimento indicados por um corte da média geral (μ) do número (N) de animais de 3 coortes com 2 DP (2σ) avaliação do desvio padrão (DP) de baixas intensidades (UA) em condição fisiológica (cinza) em camundongos de controle do tipo selvagem C57BL / 6 adultos. (F) A quantificação das mudanças no volume sanguíneo medido in vivo ao longo do tempo, em média, em 3 planos, ou seja, 30 ROI no total por animal, é representada como intensidade de pixel (UA). Detecção de outliers pelo teste ROUT 1%. (G) Não há diferença entre o tipo de veículo de entrega e a via de administração. A coorte 1 (n=6) recebeu uma injeção intraperitoneal (ip) de solução salina, a coorte 2 (n=3) injeção ip de DMSO e a coorte 3 (n=6) administração oral (po) de celulose. ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Dunnett, ns P > 0,05. Abreviatura: A.U. = Unidades arbitrárias, DMSO = Dimetilsulfóxido, ip = Intraperitoneal, po = Administração oral, ROI = Região de interesse, St. Desvio = Desvio padrão, UFUS = Ultrassom Doppler ultrarrápido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Roteiro quantitativo de ultrassom Doppler ultrarrápido (UFUS) de medições de volume sanguíneo hepático. O script gui_analysis.m fornece uma interface gráfica para o posicionamento automático da região de interesse (ROI) para medições de volume sanguíneo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste protocolo, demonstramos como realizar imagens não invasivas de OVNI da vasculatura hepática de camundongos. Apresentamos uma descrição detalhada do procedimento de imagem, abrangendo o manuseio dos animais, a operação do scanner de ultrassom e a análise de dados para calcular as alterações do volume sanguíneo in vivo. Para facilitar a interpretação dos dados de ultrassom, fornecemos uma visão abrangente das estruturas anatômicas que podem ser claramente visualizadas pelo UFUS. Além disso, descrevemos um procedimento de quantificação padronizado para medições robustas de parâmetros vasculares. Alcançar uma resolução adequada é possível sem o uso de um agente de contraste, permitindo uma avaliação quantitativa segura e direta do volume sanguíneo hepático da microcirculação. Enfatizamos o uso de nomenclatura anatômica padronizada para evitar confusão e interpretações errôneas, principalmente ao avaliar medidas quantitativas da microvasculatura.

Imagens de OVNI da vasculatura murina foram relatadas anteriormente, principalmente no campo da neurociência⁷. A imagem cerebral não é afetada negativamente por artefatos de movimento, ao contrário do fígado, que é altamente suscetível ao movimento respiratório. Devido à sua posição anatômica sob o diafragma, a depilação na região abdominal deve ser realizada com muita delicadeza para evitar a introdução de respiração irregular, minimizando as forças físicas na região do tórax e abdômen. Além disso, atingir um grau adequado de anestesia é essencial para garantir a respiração oscilante regular, um fator que pode ser corrigido com relativa facilidade nas etapas de pós-processamento. A sensibilidade do UFUS foi aprimorada aqui aplicando um filtro de decomposição de valor singular (SVD) para remover artefatos de movimento⁶ e censurando ainda mais os quadros de alto movimento. Os filmes Power Doppler de alta taxa de quadros são adquiridos aqui a 10 ms para nos permitir visualizar e medir ainda mais o efeito do movimento respiratório em quadros que geraram picos de alto valor devido a artefatos de movimento. A taxa de respiração pode então ser identificada a partir do pico na transformada rápida de Fourier do sinal médio da imagem, e os quadros de pico correspondentes correspondentes ao alto movimento do órgão podem ser descartados.

A imagem Doppler de ultrassom reprodutível em um único animal ao longo do tempo, bem como entre animais de diferentes pesos corporais, ainda pode enfrentar várias limitações. Em primeiro lugar, o posicionamento do fígado pode ser influenciado por fatores como estômago altamente cheio e movimento peristáltico do intestino. Essa influência é particularmente pronunciada ao selecionar o lobo lateral esquerdo do fígado como referência. Portanto, recomendamos escolher o lobo lateral esquerdo apenas em animais maiores e preferir o lobo medial direito ou esquerdo em animais menores. Em segundo lugar, movimentos respiratórios pesados não oscilantes podem ocorrer em animais angustiados, resultando em artefatos de movimento que são difíceis de corrigir e, consequentemente, não podem ser usados para cálculo do volume sanguíneo. Assim, uma escolha adequada de anestesia, juntamente com uma dosagem adaptada ao peso corporal, é crucial. Por fim, o limite de resolução restringe a visualização da microvasculatura hepática, ou seja, vasos sanguíneos podem ser visualizados com diâmetros que variam até 100 mm³.

O uso de agentes de contraste foi recentemente proposto para adquirir uma imagem detalhada da vasculatura do camundongo rastreando microbolhas. Tal abordagem pode alcançar alta resolução espacial e fornecer medidas quantitativas da velocidade sanguínea¹⁷. No entanto, o rastreamento de microbolhas continua sendo altamente desafiador para mover órgãos internos, especialmente quando adquiridos em 2D.

Aqui, mostramos que as medidas estáveis do volume sanguíneo hepático obtidas por Doppler ultrarrápido podem ser adquiridas em camundongos controle de três coortes que receberam diferentes veículos administrados por injeções ip ou gavagem oral. Recentemente, essas medições de volume sanguíneo foram usadas com sucesso em um modelo de camundongo com doença hepática¹⁶. Para elaborar, a expansão vascular foi detectada em nível microscópico eletrônico e confirmada por medições quantitativas usando UFUS. Este estudo enfatizou a sensibilidade da avaliação in vivo para investigar defeitos vasculares em níveis funcionais e quantitativos, mesmo com uma angioarquitetura hepática preservada, o que é promissor para o diagnóstico clínico e monitoramento.

Em resumo, este protocolo serve como um guia para estudos qualitativos e quantitativos não invasivos da vasculatura hepática em camundongos. Também pode ser empregado para acompanhamento longitudinal devido ao seu procedimento não invasivo e simples. Além disso, tem o potencial de fornecer avaliações funcionais dos vasos sanguíneos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(Hydroxypropyl)methyl cellulose HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0.5% HPMC
Centrifuge ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Centrifuge Tubes 50 mL conical Sterile Polypropylene	CELLSTAR tubes	227 261
Cotton tips	Meditip Clean	G80215
Deionized water	in house
Depilatory cream	nearby drugstore
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML	sterile
Ethanol absolute	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Feeding needle, reusable	FST Fine Science Tools	18064-20
Forceps with fine tip Dumont #5 forceps	FST Fine Science Tools	11252-00
Gauze pads 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	Version 9
GUI analysis script	Inserm	gui_analysis.m	needs a 10 ms Doppler scan
Heating pad 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux Acculux	461265
Insulin syringe 30G 0.30 x 8 mm, 0.3 mL and 0.5 mL	BD Microfine + Demi	25636
Ketamine Anesketin	Dechra	REG NL 111764	100 mg/mL
Kimwipes KIMTECH low-lint wiper	ULINE	S-8115
Lab tape 19 mm x 50 m x 0.125 mm	Stokvis	M451
MATLAB software	MathWorks	Version R2022b
Moisturizing cream	nearby drugstore
Needle yellow 30G 0.3 x 13 mm	BD Microlance	304000
Ophthalmic ointment Oculentum Simplex	Added Pharma	220201
Paper tissues	in house
Permanent lab marker	VWR	52877-310
Physiological salt solution (NaCl 0.9%)	FRESENIUS KABI	B102986	sterile
Sharps disposable container Medical Dispo 2.5 L	APmedical	UN3291
Sterile safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 120.086
Syringe 1 mL	BD Plastipak	303172
Syringe 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
Timer	West Bend	40053
Trimmer	Exacta Aesculap	GT416
Ultrafast ultrasound platform	Iconeus &  INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus One prototype	with a 10ms sequence
Ultrasound transmission gel Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
Water tank 3D printed 10 x 10 x 1.5 cm polymethylpentene (PMP) 0.125 mm	GoodFellow Cambridge limited	ME311100/2	CAD file upon request
Xylazine Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 mg/mL