Gravações agudas de vários eletrodos de unidade única do tronco encefálico de camundongos com cabeça fixa

Resumo

Este protocolo descreve um método para obter gravações in vivo de neurônio único de alta densidade do tronco cerebral de camundongos com cabeça fixa. Essa abordagem é implantada para medir o potencial de ação disparado de neurônios no cinza periaquedutal ventrolateral - uma região do tronco encefálico inativa durante o sono REM (Rapid Eye Movement) - antes e durante a anestesia geral.

Resumo

As gravações baseadas em multieletrodos de silício são cada vez mais populares para estudar a atividade neuronal na resolução temporal dos potenciais de ação em muitas regiões do cérebro. No entanto, o registro da atividade neuronal de estruturas caudais profundas, como o tronco encefálico, usando sondas multicanal continua sendo um desafio. Uma preocupação significativa é encontrar uma trajetória para a inserção da sonda que evite grandes vasos sanguíneos, como o seio venoso sagital superior e o seio venoso transverso. Ferir essas veias grandes pode causar sangramento extenso, danos ao tecido cerebral subjacente e potencialmente a morte. Essa abordagem descreve o direcionamento de estruturas do tronco encefálico acoplando coordenadas anteriores com uma abordagem angular, permitindo que a sonda de registro penetre no cérebro abaixo de estruturas vasculares de alto risco. Em comparação com uma abordagem estritamente vertical, a abordagem angular maximiza o número de regiões cerebrais que podem ser direcionadas. Usando essa estratégia, o cinza periaquedutal ventrolateral (vlPAG), uma região do tronco encefálico associada ao sono REM, pode ser acessado de forma reprodutível e confiável para obter registros de unidade única e vários eletrodos em camundongos com cabeça fixa antes e durante a anestesia com sevoflurano. A capacidade de registrar a atividade neuronal no vlPAG e nos núcleos circundantes com alta resolução temporal é um passo à frente no avanço da compreensão da relação entre o sono REM e a anestesia.

Introdução

As gravações baseadas em multieletrodos de silício estão se tornando cada vez mais populares para medir a atividade neuronal em muitas regiões do cérebro com resolução de potencial de ação única 1,2,3,4. Na última década, a tecnologia de gravação de alta densidade cresceu consideravelmente. Os eletrodos de registro atuais à base de silício podem acomodar altas contagens de canais, fibras ópticas e dispositivos de registro de eletrocorticografia (ECoG) ^5,6. Além disso, o implante crônico desses eletrodos permite registros de longo prazo ^7,8.

Apesar dos recentes avanços tecnológicos, o direcionamento de estruturas caudais profundas, como o tronco cerebral, com sondas multicanais continua sendo um desafio. Ao direcionar estruturas do tronco encefálico, como o cinza periaquedutal ventrolateral (vlPAG), um obstáculo significativo é identificar uma trajetória de sonda que evite os principais vasos sanguíneos, por exemplo, o seio venoso sagital superior e o seio venoso transverso. A lesão dessas grandes veias pode causar sangramento extenso, danos ao tecido cerebral subjacente e até a morte ^9,10. Propomos direcionar as estruturas do tronco encefálico a partir de coordenadas anteriores em um ângulo, permitindo que a sonda de registro penetre no cérebro abaixo dessas estruturas vasculares de alto risco (ver Figura 1). Essa abordagem angular, em comparação com uma vertical, maximiza o número de regiões cerebrais acessíveis para gravação. Além disso, em circunstâncias experimentais em que as gravações de ECoG são desejadas, a abordagem anterior angulada oferece mais superfície craniana disponível para o implante do fone de ouvido ECoG, pois a janela de craniotomia para inserção da sonda é posicionada mais anteriormente^10,11.

Identificar os grupos de células e circuitos específicos responsáveis pelas alterações do sono REM induzidas pela anestesia continua sendo um dos principais objetivos da pesquisa em anestesia. Assim, o objetivo aqui foi acessar de forma reprodutível e confiável o vlPAG - uma região do tronco encefálico associada ao sono REM - para obter registros de uma única unidade e múltiplos eletrodos em camundongos com cabeça fixa antes e durante a anestesia com sevoflurano^12,13. Estudos anteriores usaram medições eletrofisiológicas de potencial de campo local (LFP) do vlPAG em camundongos acordados para identificar alterações no estado neural associadas à anestesia^14,15. No entanto, as medições de LFP são principalmente sensíveis à atividade sináptica, não aos potenciais de ação, dentro da área registrada¹⁶. Consequentemente, permanece uma compreensão limitada de como os anestésicos afetam diretamente os padrões de atividade neural produzidos pelos neurônios vlPAG. Aqui, um método é descrito para obter gravações de neurônio único de alta densidade do tronco cerebral de camundongos com cabeça fixa. Este método também pode ser adaptado para registrar a atividade de um único neurônio de várias outras estruturas profundas e posteriores do tronco encefálico.

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Protocolo

Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia (Charlottesville, Virgínia). Foram utilizados cinco camundongos C57BL/6J machos, com idade entre 3 e 7 meses, pesando 25-30 g. Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado aqui estão listados na Tabela de Materiais.

1. Implantação de placa de cabeça e fone de ouvido

1. Faça um fone de ouvido ECoG soldando fio de aço inoxidável revestido com perfluoroalcoxi (PFA) a um conector de 3 pinos (Figura 2A).
2. Identifique as coordenadas de inserção com base em um atlas estereotáxico^{de camundongo 17}. Usar o teorema de Pitágoras para calcular o ângulo e a profundidade de inserção da sonda - particularmente quando há pouca informação na literatura - é um ponto de partida razoável (Figura 1)¹⁸.
   NOTA: Em última análise, as coordenadas serão ajustadas por tentativa e erro. Para direcionar o vlPAG, as seguintes coordenadas foram usadas em camundongos adultos: anteroposterior (AP) -3,6 mm, mediolateral (ML) +0,5 mm, dorsoventral (DV) -4 mm. A sonda foi inserida em um ângulo de 20° (AP).
3. Induza a anestesia geral colocando o camundongo na câmara de indução (1,5% -3% de isoflurano em oxigênio). Uma vez anestesiado, posicione o mouse no quadro estereotáxico, colocando o nariz do animal no cone do nariz e estabilizando a cabeça com barras de cabeça.
4. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar danos à córnea. Use um sistema de controle de temperatura para manter a temperatura corporal em 37 °C.
5. Aplique creme depilatório ou raspe o pelo sobre o couro cabeludo e desinfete com iodopovidona e álcool 70%. Use a técnica asséptica "somente pontas" para manter um campo cirúrgico estéril.
6. Realize um teste de pinça do dedo do pé para verificar a profundidade da anestesia.
7. Administrar analgesia: carprofeno 2,5 mg/kg, administrado por via subcutânea nas costas.
8. Faça uma incisão no couro cabeludo de 5 mm para remover uma mancha circular de pele acima dos ossos parietal e occipital. Remova suavemente as meninges raspando-as com a lâmina do bisturi.
9. Use a lâmina do bisturi para cortar as inserções musculares e expor os ossos parietal e occipital¹⁹. Aplique peróxido de hidrogênio conforme necessário para controlar o sangramento e secar a superfície do crânio. É crucial aplicar cimento dental e resina no crânio seco para obter uma ligação forte.
10. Primeiro, identifique os pontos de referência bregma e lambda no crânio²⁰. Em seguida, ajuste a posição do cone do nariz para nivelar a posição ântero-posterior do crânio, garantindo que não exista mais de 100 μm de diferença de altura entre os dois pontos de referência.
11. Para nivelar a posição médio-lateral do crânio, escolha dois pontos opostos entre bregma e lambda, cada um a 1 mm da sutura sagital e verifique seu nível. Se houver mais de 100 μm de diferença de altura entre eles, ajuste a posição medial-lateral do crânio manipulando as barras da cabeça.
12. Meça a distância entre bregma e lambda e compare-a com a distância relatada no atlas estereotáxico de Franklin-Paxinos (geralmente 4,2 mm)¹⁷. Use a diferença entre as distâncias medidas e relatadas para dimensionar sua coordenada PA proporcionalmente. Marque as coordenadas da craniotomia no crânio com um lápis esterilizado.
    NOTA: Se a distância bregma-lambda medida for diferente de 4.2 mm, as coordenadas precisam ser dimensionadas proporcionalmente. Todas as coordenadas AP relatadas em um atlas estereotáxico correspondem a uma distância bregma-lambda padronizada. Como o tamanho do crânio de um rato é variável, é importante ajustar suas coordenadas de acordo.
13. Usando um micromanipulador estereotáxico, posicione a placa da cabeça diretamente no topo da sutura lambda e prenda-a ao crânio aplicando cimento dentário na placa da cabeça e ao redor dela (Figura 3A, B). Deixe pelo menos 10 min para o cimento secar.
14. Faça furos de rebarba (0,5 mm de diâmetro) para dois eletrodos corticais (córtex frontal e parietal) e para um que servirá como eletrodo de referência (cerebelo). Coloque as extremidades descascadas (0.5 mm) dos eletrodos de fio de prata revestidos dentro dos orifícios das rebarbas e prenda com resina ativada por luz ultravioleta.
15. Cubra completamente os fios de aço inoxidável revestidos com cimento dental para que nenhum fio fique exposto. Cubra a parte inferior e as laterais do fone de ouvido com cimento dental para que fique firmemente no lugar. Certifique-se de que as suturas bregma e lambda permaneçam visíveis quando o fone de ouvido estiver preso no lugar (Figura 2B).
16. Deixe o camundongo se recuperar por um mínimo de 7 dias, examine o animal e o local da cirurgia diariamente em busca de irregularidades. Administre analgésicos (Carprofeno 2,5 mg / kg, SC) conforme necessário.

2. Colocação e gravação da sonda de silício

1. Habitue o mouse ao equipamento de gravação e fixação da cabeça (pelo menos 1.5 h em dois dias separados) (Figura 2D).
2. No dia da gravação, coloque o camundongo na câmara de anestesia (Isoflurano 1,5%-3% em oxigênio).
3. Posicionar o mouse em uma moldura estereotáxica, ajustar o cone do nariz e as barras de cabeça conforme descrito em 1.3. Mantenha a anestesia (isoflurano 1,5% -3% em oxigênio) durante toda a cirurgia estereotáxica. Realize um teste de pinça do dedo do pé para verificar a profundidade da anestesia.
4. Aplique pomada oftálmica nos olhos e mantenha a temperatura corporal adequada.
5. Identifique bregma e lambda, garantindo que não exista mais de 100 μm de diferença de altura entre os dois marcos anatômicos.
6. Encontre e marque as coordenadas calculadas no crânio com um lápis estéril e, em seguida, crie um contorno da janela de craniotomia de 2 mm x 2 mm ao redor das coordenadas.
7. Realize um teste de pinça do dedo do pé para verificar a profundidade da anestesia.
8. Use uma broca de alta velocidade para criar uma janela de craniotomia de 2 mm x 2 mm. Aplique 0,5-1 mL de solução salina normal para evitar que a superfície do cérebro seque. Remova a dura-máter usando uma agulha de seringa e uma pinça fina.
   NOTA: Observe os vasos principais (seio sagital superior, seio transverso) para evitar sangramento excessivo (Figura 3).
9. Use uma broca de alta velocidade para criar um orifício de rebarba separado para o eletrodo de referência da sonda de silício, geralmente ~ 1-2 mm da janela craniana.
10. Aplique 0,2 mL de adesivo de silicone de baixa toxicidade no crânio para selar completamente a craniotomia, usando o aplicador anexado.
11. Deixe o mouse se recuperar por aproximadamente 1 h.
12. Fixe a cabeça do mouse no equipamento de registro de eletrofisiologia usando a placa de cabeça e os parafusos (Figura 2D).
13. Revestir a haste da sonda de silício com o corante fluorescente DiI (1:4 DiI:Etanol) para que a trajetória da sonda possa ser reconstruída após o experimento.
14. Monte a sonda no manipulador e defina o ângulo desejado. Para atingir o vlPAG, foi aplicado um ângulo AP de 15-20°.
15. Abaixe a sonda de registro até a superfície do cérebro dentro do centro da janela craniana. Primeiro, insira manualmente a sonda a uma profundidade de ~300 μm. Uma vez inserida nessa profundidade, abaixe lentamente a sonda automaticamente (por exemplo, 200 μm/min) até a profundidade desejada para minimizar o dano tecidual²¹ (Figura 2C).
    NOTA: A inserção manual da sonda é inicialmente recomendada. A inserção manual da sonda garante a capacidade de parar e retrair a sonda caso ela dobre na inserção inicial. Uma vez que a sonda penetra totalmente no tecido, geralmente é seguro continuar descendo a sonda no modo automático.
16. Aplique óleo mineral na superfície do cérebro dentro da janela de craniotomia para evitar que seque.
17. Deixe a sonda de gravação descansar por 10 minutos após a inserção.
18. Grave dados da sonda de silício e ECoG a 30kHz usando um controlador de gravação Intan.
19. 1-2 h após o registro, use a técnica de perfusão transcárdica para fixar o cérebro em paraformaldeído a 4%²².
    NOTA: Por causa do cimento, pode ser difícil remover a parte rostral do crânio. É por isso que é preferível extirpar o cérebro removendo as partes dorsais do crânio.
20. Decapite o rato, corte a pele seguindo a linha média do lado dorsal, do pescoço até a mandíbula inferior. Remova os músculos e tecidos ligados ao crânio, corte a mandíbula inferior para facilitar o acesso ao cérebro.
21. Se a perfusão for feita corretamente, o cérebro deve encolher um pouco, deixando espaço suficiente para inserir uma tesoura fina na parte dorsal do forame magno. Faça um corte medial, um corte lateral e um contralateral, com cerca de 1 mm de tamanho, no osso occipital.
22. Remova cuidadosamente a parte dorsal do crânio usando uma pinça oftálmica. Comece no osso occipital, remova todos os fragmentos do crânio até que toda a parte dorsal do cérebro esteja exposta.
23. Deslize uma micro espátula sob o cérebro, começando pelos bulbos olfativos para retirar o cérebro.
24. Uma vez perfundido e removido, o cérebro pode ser armazenado em paraformaldeído a 4% a 4 ° C por 24-48 h.

3. Histologia para reconstrução da trajetória da sonda

1. Corte o cérebro em seções coronais de 70 μm usando um vibratome.
2. Monte as seções em lâminas usando um meio de montagem DAPI que cora os núcleos das células. Cubra a lamínula e sele as lâminas com esmalte transparente.
3. Visualize as lâminas em um microscópio de fluorescência. Ajuste o contraste/brilho para que os rastros da sonda fiquem claramente visíveis. Certifique-se de que os tamanhos de arquivo de imagem tiff resultantes sejam inferiores a 10 MB, para que os códigos MATLAB sejam executados sem problemas. Reconstrua as trilhas da sonda usando um código MATLAB²³.

4. Análise de dados eletrofisiológicos

1. Analise os sinais neurais gravados da sonda de silício usando um software de detecção off-line e classificação automática (Kilosort)²⁴.
2. Classifique manualmente os clusters detectados com Phy como unidades múltiplas ou únicas²⁵. Classifique os clusters como unidades únicas quando eles têm uma forma de onda de pico fisiológico, mostram um período refratário no corlograma cruzado e uma distribuição normal de visualização de amplitude.
3. Importe dados de unidade única para o MATLAB e analise²³.

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Resultados

Cinco C57BL/6J machos foram implantados com fone de ouvido ECoG e placa de cabeça (Figura 4A). Após a recuperação, os camundongos foram habituados à fixação da cabeça e ao equipamento de registro de eletrofisiologia durante duas sessões de 1,5 h em dias separados ( Figura 4B ). Em seguida, foi criada uma janela de craniotomia de 2 mm x 2 mm (Figura 4C) e inserida uma sonda de silicone com o...

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Discussão

Os núcleos do tronco encefálico medeiam funções fundamentais como respiração, consciência e sono 26,27,28. A localização do tronco cerebral (profundo e posterior) apresenta um desafio no estudo de sua atividade neuronal in vivo usando técnicas padrão. Aqui, uma abordagem anterior angular é apresentada para permitir o registro reprodutível de unidade única em camundongos co...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation