Procedimentos de treinamento comportamental para realidade virtual fixa na cabeça em camundongos

Resumo

O artigo descreve os procedimentos experimentais para o paradigma de realidade virtual (VR) de pista linear comumente usado em camundongos, bem como determina a viabilidade de executar tarefas complexas de VR testando uma tarefa de discriminação de sinal em forma de Y.

Resumo

A realidade virtual (VR) combinada com a fixação da cabeça está sendo cada vez mais utilizada em estudos de neurociência comportamental, pois permite que ensaios comportamentais complexos sejam realizados em camundongos com a cabeça fixa. Isso permite registros comportamentais precisos, incorporando várias técnicas neurofisiológicas que requerem fixação da cabeça para minimizar o ruído do sinal relacionado ao movimento durante as gravações neurais. No entanto, apesar do uso crescente da RV, há poucos dados publicados sobre a metodologia detalhada de como implementá-la. Neste estudo, é desenvolvido um protocolo de treinamento pelo qual camundongos C57B16 / J machos e fêmeas são treinados para percorrer um corredor linear virtual, cujo comprimento é aumentado de 1-3 m em várias sessões de treinamento. Com base nessa base, este estudo investigou a viabilidade de camundongos realizarem comportamentos complexos em RV usando um paradigma de labirinto em Y. A tarefa exigia navegar até o braço com paredes pretas a partir do ponto de escolha no labirinto em Y. Após atingirem um critério de dois dias consecutivos igual ou superior a 70% de acerto, os camundongos evoluíram para uma discriminação sensorial cada vez mais difícil. Os resultados fornecem detalhes importantes sobre as metodologias úteis para o treinamento bem-sucedido de camundongos em RV e demonstram que os camundongos exibem capacidades de aprendizado ao navegar no labirinto em Y. A metodologia apresentada não apenas oferece insights sobre a duração do treinamento em ensaios baseados em RV, mas também ressalta o potencial de sondar comportamentos intrincados em camundongos, abrindo caminhos para investigações neurocientíficas mais abrangentes.

Introdução

As tarefas de realidade virtual surgiram como um poderoso método de avaliação comportamental em camundongos devido à fixação da cabeça, que permite a estabilidade mecânica que seria comprometida em camundongos que se comportam^livremente. Esse método permite artefatos de movimento reduzidos em registros eletrofisiológicos ^2,3 e imagens ópticas ^4,5,6,7. Também facilita comportamentos repetíveis⁸ e rastreamento ocular preciso⁹. Na configuração experimental, o mouse é fixado no lugar e situado no topo de uma esteira esférica com suporte de ar. Este aparato permite a intrincada exploração do comportamento visualmente guiado dentro do ambiente de RV. À medida que o mouse se move na esteira, sua locomoção é sincronizada perfeitamente com sua navegação na paisagem virtual, que é representada visualmente na tela ao redor do mouse.

O objetivo deste estudo é duplo: abordar os principais desafios da neurociência comportamental experimental e contribuir para o avanço das metodologias neste campo. Em primeiro lugar, apesar do aumento do uso da RV na pesquisa acadêmica 10,11,12, permanece uma notável ausência de metodologias abrangentes e protocolos de treinamento, dificultando a adoção dessa tecnologia por novos pesquisadores. O objetivo principal era preencher essa lacuna, delineando um regime de treinamento detalhado para o paradigma de pista linear, conforme descrito em estudos anteriores^{13 , 14 , 15} . Um sistema comercialmente disponível é usado para descrever esses procedimentos operacionais. Como isenção de responsabilidade, essas diretrizes de procedimento têm componentes específicos para este sistema; no entanto, para uma discussão sobre a generalização deste protocolo, consulte a discussão. O objetivo era delinear os procedimentos comportamentais, o cronograma típico para a realização desses procedimentos e a taxa de sucesso para treinar ratos para correr em uma pista linear simples.

Em segundo lugar, ainda há uma falta de documentação sobre a implementação de tarefas complexas de labirinto dentro desse paradigma em camundongos. Ensaios virtuais complexos foram desenvolvidos em ratos¹¹. No entanto, os camundongos têm acuidade visual reduzida em comparação¹⁶ e muitas vezes têm pior desempenho em tarefas complexas¹⁷. Embora algumas investigações tenham se concentrado em tarefas específicas, como acúmulo de evidências ou novidade espacial¹⁸, o foco aqui foi elucidar as metodologias de treinamento necessárias para que os camundongos se envolvam em paradigmas de tomada de decisão em ambientes de RV. Para enfrentar esse desafio, uma tarefa de discriminação de sinal foi elaborada em que os camundongos foram encarregados apenas de aprender a associar a cor / luminância (preto versus branco) do braço recompensado com a recompensa, alcançada selecionando o braço preto no ponto de escolha do labirinto em Y, com o braço correto randomizado em cada tentativa. Esta tarefa foi projetada para exigir interação com as pistas virtuais e fornecer informações sobre as habilidades de discriminação perceptiva dos camundongos.

Em resumo, este estudo aborda lacunas críticas no campo da neurociência comportamental experimental, fornecendo protocolos de treinamento abrangentes para o uso de paradigmas de RV em camundongos e elucidando metodologias para tarefas complexas de tomada de decisão dentro dessa estrutura. Ao alavancar insights de pesquisas anteriores e projetos experimentais inovadores, este estudo visa simplificar as práticas de pesquisa e avançar na compreensão dos mecanismos neurais subjacentes ao comportamento. As seções a seguir se aprofundarão nos procedimentos e resultados experimentais e discutirão as descobertas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos em estrita adesão aos protocolos estabelecidos pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIEHS, garantindo o cumprimento dos padrões éticos e diretrizes de bem-estar. Camundongos C57BL/6Tac, com aproximadamente 8 semanas de idade, foram utilizados para o estudo.

1. Cirurgia para implante de barra de cabeça

1. Preparação da cirurgia
   1. Obtenha a quantidade desejada de camundongos para sua coorte, idealmente alojando-os individualmente para minimizar a interferência com o implante da barra de cabeça, embora isso seja opcional¹⁹. Este estudo usou um tamanho de amostra de três camundongos machos e três fêmeas (inicialmente equilibrados, mas um macho foi excluído no início do treinamento depois de não conseguir correr na bola)
   2. Adquira os materiais especificados na Tabela de Materiais, ajustando-se de acordo com as especificidades do desenho do estudo.
   3. Após a aquisição dos ratos, designe identificadores individuais e aplique tatuagens na cauda ou perfuradores de orelha para garantir uma identificação inequívoca. Estabeleça um registro abrangente para registrar sistematicamente seus pesos conforme necessário para o procedimento de restrição de água.
2. Administração de anestesia
   1. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos estejam prontamente disponíveis, incluindo seringas apropriadas, uma almofada de aquecimento, metais (como pinças, microtesouras e hemostáticos), solução de iodo, lubrificante ocular e copos para solução salina e peróxido de hidrogênio. Para garantir condições estéreis, higienize todos os equipamentos cirúrgicos e esterilize todas as ferramentas cirúrgicas usando uma autoclave.
   2. Antes de prosseguir com a cirurgia, realize medições precisas do peso dos camundongos e ative a almofada de aquecimento a 34 °C. Registre todas as informações necessárias no caderno de laboratório/cirúrgico da instituição. Verifique a adequação dos níveis do tanque de oxigênio e isoflurano e confirme a disponibilidade de todos os materiais essenciais para facilitar procedimentos cirúrgicos ininterruptos.
   3. Limpe o camundongo e coloque-o em um nariz preso a um vaporizador projetado para pequenos animais que recebem isoflurano a 4% e uma taxa de fluxo de oxigênio de 3 L / min para induzir a anestesia. Use um sequestrante para capturar quaisquer gases residuais potencialmente nocivos (recomendado).
   4. Administre pomada veterinária oftálmica Petroleum nos olhos do camundongo enquanto ele estiver sob o nariz para evitar o ressecamento ocular. Aplique uma única gota em cada olho inicialmente e reaplique conforme necessário. Garanta a proteção constante dos olhos, mantendo sempre uma camada deste lubrificante com verificações periódicas.
   5. Prepare o local cirúrgico (Figura 1A) na cabeça do camundongo raspando a área onde o crânio será afixado na barra da cabeça.
   6. Posicione os incisivos do camundongo dentro do aparelho estereotáxico abaixo do nariz, ajustando a taxa de fluxo de oxigênio para 1 L/min e administrando 1%-2% de isoflurano do vaporizador. Garanta o fluxo adequado da anestesia ajustando as válvulas e alternando entre o nariz de indução e o aparelho estereotáxico de acordo. Estenda a pata traseira do mouse e aplique uma pressão firme no dedo do pé. Se o pé não apresentar uma resposta reflexiva de retirada, isso indica que a anestesia é eficaz. Repita a cada 15 minutos, juntamente com uma verificação da respiração.
   7. Prenda a cabeça do mouse no lugar prendendo barras de estabilidade cirúrgica dentro de seus canais auditivos, minimizando qualquer movimento potencial da cabeça durante a cirurgia.
   8. Antes de fazer incisões ou injeções, esterilize a área cirúrgica raspada no topo da cabeça, esfregando-a com um cotonete embebido em um anti-séptico de iodo. A partir desta fase, utilize luvas estéreis para manter as condições assépticas.
3. Administração de injeção
   1. Injetar por via subcutânea 0,05 mL de bupivacaína (analgesia local) com agulha 25G no local da incisão cirúrgica no couro cabeludo.
   2. Injetar subcutaneamente 1 mL de solução salina (hidratação) com agulha 25G em um lado da região interescapular.
   3. Injete por via subcutânea 0,05 mL de buprenorfina (analgesia de corpo inteiro) com uma agulha 25G no lado oposto da região interescapular.
4. Expondo o crânio
   1. Use uma microtesoura para criar uma incisão da pele acima das suturas interfrontal e internasal do crânio, começando logo acima da crista da sobrancelha e estendendo-se até atrás da incisura occipital (Figura 1A).
   2. Use hemostáticos para segurar as abas esquerda e direita da pele, expondo o crânio.
   3. Use um cotonete seco para remover o tecido conjuntivo do couro cabeludo entre as dobras cutâneas presas.
   4. Use um cotonete umedecido (mas não saturado) com água oxigenada para esfregar o couro cabeludo, garantindo a visibilidade das suturas e tomando cuidado para não deixar a água oxigenada entrar no tecido circundante.
   5. Repita as etapas 1.4.3 e 1.4.4, 2x-3x, até que o bregma e o lambda estejam claramente visíveis e o couro cabeludo esteja completamente limpo.
5. Implante de parafuso cirúrgico
   1. Prenda dois parafusos ao crânio, posicionando um parafuso posterior ao bregma e o outro anterior ao lambda (Figura 1B) para maximizar a área de superfície do adesivo dental e aumentar a estabilidade da barra da cabeça. Posicione a localização dos parafusos em alvos a uma distância especificada de bregma. Certifique-se de que um parafuso esteja posicionado à esquerda e o outro à direita (ou seja, Ântero-Posterior (AP) +1,00, Médio-Lateral (ML) -1,00 e AP -3,00, ML +3,00), garantindo que haja espaço adequado entre os parafusos para acomodar a colocação da barra de cabeça e ajustar as coordenadas e necessárias.
   2. Perfure as posições alvo, garantindo que a perfuração seja limitada ao osso do crânio e não penetre no tecido cerebral.
   3. Usando uma chave de fenda, aparafuse cerca de metade do parafuso no lugar. Repita para o segundo parafuso.
6. Fixação do implante da barra de cabeça
   1. Misture o cimento dentário e administre-o na parte inferior da barra da cabeça, concentrando-se na superfície côncava, e aplique ao longo da sutura interfrontal do crânio.
   2. Posicione a barra de cabeça sobre a sutura interfrontal para facilitar a ligação entre o cimento dentário na barra de cabeça e o da sutura. Segure-o firmemente no lugar com a mão no ângulo desejado por aproximadamente 5 min até que endureça. Aplique cimento dental adicional conforme necessário. (Figura 1C-E)
7. Recolocando a pele sobre a barra de cabeça
   1. Libere os hemostáticos e utilize uma pinça para reunir os dois retalhos cutâneos sobre a barra de cabeça fixada em cimento dentário seco. Use adesivo tecidual tópico para prender delicadamente a pele, aderindo lentamente as porções esquerda e direita do couro cabeludo sobre a barra da cabeça, começando no local da incisão anterior e terminando no local da incisão posterior.
   2. Deixe o adesivo tecidual tópico endurecer para confirmar que a área cirúrgica foi selada novamente antes de liberar o mouse das barras de estabilidade cirúrgica e do nariz.
   3. Transfira o mouse para uma gaiola alojada individualmente e coloque-o em uma almofada de aquecimento a 37.5 °C.
   4. Monitore cuidadosamente o mouse em busca de sinais de desconforto ou irregularidades respiratórias até que ele recupere a consciência. Não deixe o camundongo sem vigilância até que ele tenha recuperado a decúbito esternal, exiba estado de alerta e seja deambulatório.
   5. Após procedimentos cirúrgicos, permita que os camundongos passem por um período de descanso de 1 semana. Monitore os ratos diariamente para detectar e resolver quaisquer flutuações notáveis no peso. Forneça purê para os camundongos 3 dias após a cirurgia para ajudar na recuperação. Para evitar interferência com a barra de cabeça, aloje esses mouses individualmente.

2. Restrição de fluidos

NOTA: A restrição de água induz um estado de sede em camundongos, aumentando sua motivação para recompensas líquidas. No entanto, uma implementação meticulosa é necessária para garantir a preservação do bem-estar do camundongo²⁰.

1. À 1 semana do dia da cirurgia, estabeleça os pesos basais para camundongos.
2. Cole um segmento de uma pequena placa de Petri (60 mm x 15 mm) com o lado côncavo para baixo no chão da gaiola, colando uma placa de Petri menor (35 mm x 10 mm) côncava até o centro da superfície plana da placa de Petri colada no chão, com outra pequena placa de Petri (60 mm x 15 mm) côncava colada no topo da superfície plana da placa do meio para servir como reservatório de água (Figura 2).
3. Certifique-se de que a altura do prato superior evite a contaminação do material da cama, permitindo que os ratos tenham fácil acesso à água. Adicione o volume diário de água ao reservatório usando uma pipeta.
4. No dia 1, forneça aos camundongos uma dose de 15 ml de água por 100 g de massa corporal.
5. No dia 2, forneça aos camundongos uma dose de 10 mL de água por 100 g de massa corporal.
6. No dia 3, forneça aos camundongos uma dose de 5 mL de água por 100 g de massa corporal. Os camundongos devem receber uma ingestão mínima de 1 mL de água por dia durante todo o estudo, independentemente do peso corporal.
   NOTA: Os pesquisadores podem optar por administrar o volume mínimo uniformemente em todos os indivíduos, embora tais ajustes devam ser feitos com consideração cuidadosa.
7. Mantenha uma dosagem consistente durante toda a duração do estudo de alocação de água em 5 mL por 100 g de peso corporal (ou uma alocação uniforme de 1 mL de água, se preferir)
   NOTA: Os camundongos devem ter acesso ad libitum à água por 1-2 dias por semana quando os camundongos não estiverem realizando um experimento de RV (ou seja, durante o fim de semana). Isso facilitará a restauração de seus níveis naturais de hidratação. Nos casos em que os camundongos ficam abaixo de 90% de seus pesos basais registrados, eles devem ser transferidos para acesso à água ad libitum até atingirem 90% de seu peso basal. Os camundongos abaixo de 80% de seus pesos basais registrados devem ser eutanasiados eticamente.
8. Atrase a administração de sua dose diária de água pelo menos 30 minutos após a avaliação comportamental para mitigar possíveis interferências em seus comportamentos naturais de sede, essenciais para conduzir o experimento com precisão.
   NOTA: Fornecer recompensas líquidas imediatamente após um teste pode influenciar inadvertidamente o desempenho dos mouses, pois eles podem antecipar o recebimento de uma recompensa imediata, potencialmente comprometendo o envolvimento da tarefa. Portanto, atrasar o acesso à água após o teste evita a habituação à entrega imediata de recompensas e preserva a integridade da configuração experimental.

3. Configuração do sistema

1. Familiarização com o equipamento: Para os componentes de hardware e outras considerações dos sistemas comportamentais de RV, consulte as etapas abaixo.
   Consulte a seção de discussão para um exame da generalização do protocolo para configurações de sistema comparáveis.
   1. Exibição ou cúpula virtual totalmente imersiva: Esta exibição virtual fornece imersão completa para um animal em um ambiente virtual personalizável. O movimento dentro do ambiente virtual é sincronizado com o movimento na esteira esférica.
   2. Sistema de recompensa líquida: O sistema de recompensa líquida funciona através da entrega de reforço líquido (água ou água com açúcar) usando uma bomba peristáltica, que direciona a solução de recompensa através de um tubo metálico revestido de plástico que se estende até o mouse quando uma tarefa é executada com sucesso. Ele contém sensores que monitoram a quantidade de recompensas obtidas por um mouse durante um teste.
      1. Limpe o tubo de recompensa semanalmente usando álcool etílico ou um agente de limpeza alternativo. Para fazer isso, lave 2-5 mL do agente de limpeza através do tubo, semelhante à entrega de recompensa líquida, seguido de uma descarga comparável com um volume igual de água.
      2. Ao iniciar o experimento, determine a taxa de distribuição da recompensa líquida do tubo de recompensa, ativando-o por uma duração especificada e medindo o volume do líquido dispensado. Este procedimento permite a determinação da taxa de entrega de líquido da bomba peristáltica. Nesta investigação, foi utilizada uma taxa de dispensação de aproximadamente 0,0083 mL/s.
         NOTA: A maioria dos sistemas oferece configurações programáveis para a duração entre a execução do comportamento e a liberação da recompensa, permitindo o planejamento preciso do protocolo do estudo com base no volume de recompensa pretendido por tentativa. A quantidade utilizada foi considerada suficiente, pois permitia tempo adequado para o camundongo consumir a recompensa, e seu volume parecia ser motivador.
      3. Alguns protocolos podem exigir que o mouse lamba o bico de recompensa para iniciar a entrega da recompensa. Para o tipo de tarefas empregadas aqui, essa funcionalidade não foi empregada, oferece recompensas condicionadas apenas à execução bem-sucedida do comportamento desejado (ou seja, escolher o braço correto no labirinto em y). Isso ajuda a evitar falhas no início do treinamento, onde a tendência de lamber não foi suficientemente estabelecida e a lambida inicial é menos provável de ocorrer. Também pode permitir a medição da expectativa de recompensa, que é dissociável do desempenho de navegação em algumas condições¹¹.
      4. Enquanto alguns experimentos que usam restrição de fluidos optam pelo uso de água padrão através do tubo de recompensa, aqui usam água com açúcar (10% de sacarose v / v) como um estímulo motivacional adicional dentro do paradigma operante. Notavelmente, foi observado um desempenho aprimorado em várias coortes experimentais com a introdução de água com açúcar.
   3. Bola de isopor: Esta bola atua como uma esteira esférica. Quando amortecido com ar por baixo, treine os ratos para correr ou andar confortavelmente na bola. Posicione-o em cima de um suporte de bola equipado com sensores de rastreamento de movimento que coletam dados sobre distância e velocidade.
   4. Suporte de cabeça: Posicione o aparelho posteriormente ao mouse, garantindo o alinhamento visual com a tela VR ao prender a barra de cabeça ao suporte. Este aparelho é crucial para manter o mouse em uma posição fixa na cabeça, mitigando assim os artefatos de movimento, principalmente quando o sistema é utilizado junto com imagens ópticas ou técnicas eletrofisiológicas.
   5. Hardware de fluxo de ar: Configure o fluxo de ar de uma fonte de ar comprimido para a bola para a criação de um ambiente sem peso propício para ratos correndo na bola. Essa configuração requer um regulador de fluxo para garantir um controle preciso sobre a pressão do ar aplicada à esfera. A bola opera eficientemente dentro do ambiente sem peso com suprimento mínimo de ar. Portanto, durante a configuração do sistema, verifique a quantidade mínima de ar necessária para facilitar o movimento suave e desimpedido da bola dentro do suporte. Recomenda-se um fluxo entre 10-20 L/min.
2. Configuração do software: Para obter detalhes específicos sobre a operação do sistema, veja abaixo.
   NOTA: Muito parecido com o design dos videogames²¹, a arquitetura dos mundos virtuais integra elementos-chave, como um controlador externo, um ambiente navegável programável e um arquivo de programação contendo um diagrama de estado delineando funções dinâmicas. Esses componentes convergem sinergicamente para criar uma experiência interativa coesa para sujeitos envolvidos em estudos de pesquisa. A eficácia operacional do software depende da organização precisa dos arquivos dentro das pastas designadas. Esta explicação descreverá as principais etapas necessárias para preencher modelos pré-fabricados, permitindo ajustes fáceis nos arquivos existentes e salvando-os como novas versões. Essas novas versões formarão a base do estudo.
   1. Use os três arquivos a seguir juntos para configurar um cenário virtual operacional.
      1. Arquivos XML: Este formato de arquivo fornece aos usuários a capacidade de manipular a textura da foto de vários elementos, como céu, piso e paredes. Coloque os arquivos utilizados para as imagens na subpasta Dados da pasta VR. Usando estes, especifique as dimensões do labirinto e determine a posição inicial do mouse dentro do labirinto. Defina objetos 3D (dicas visuais) em determinados nós dentro do labirinto usando esses arquivos. Modifique esses arquivos usando um editor de texto.
      2. Arquivos XLSX: operam como os arquivos de comando que configuram todos os três tipos de arquivo (XML, XLSX e XAML) juntos para formar uma apresentação virtual coesa e interativa. Use esses arquivos para definir as rotinas experimentais que executam a RV e seus acessórios, como sensibilidade de ganho, quais dados são extraídos e quais arquivos são agrupados para um experimento.
      3. Arquivos XAML: O aplicativo de software fornece uma interface gráfica para a criação de cronogramas experimentais por meio da utilização de fluxogramas. Facilita a definição de parâmetros temporais para o teste, controles para teletransporte após a conclusão do teste e o tempo de ativação para saídas digitais dentro da estrutura do teste.
   2. Use os seguintes aplicativos para a aquisição de dados e controle do usuário do sistema enquanto ele estiver em operação.
      1. [aplicação] VR: Associado ao arquivo .XML que mostra a paisagem representativa, abra o arquivo para visualizar a paisagem virtual nos monitores no modo estático. Para interação dinâmica, abra a configuração emparelhada. XLSX no aplicativo de controle.
      2. Controle [aplicativo]: Associado ao arquivo .XSLX, abra este aplicativo para ver os dispositivos acessórios associados ao sistema. Pode-se estender e retrair manualmente o tubo de recompensa, dispensar recompensa líquida e visualizar a aquisição de dados em tempo real a partir daqui.
      3. [application] schedule designer: esse aplicativo fornece a capacidade de ajustar arquivos XAML para estabelecer um agendamento para o disparo de eventos dentro do experimento. Por exemplo, crie um gatilho personalizável para determinar a duração da distribuição de recompensas e definir a duração dos intervalos entre os testes para ratos.
3. Exemplo de inicialização: Comece decidindo como será o protocolo de estudo com base nos componentes ajustáveis das etapas 3.2.1.1-3.2.1.3. Depois que um protocolo operante for claramente definido, abra um dos experimentos de modelo que vieram predefinidos com o sistema de RV seguindo as etapas abaixo.
   1. Abra o aplicativo VR, que é aberto na subpasta Dados. Salve a paisagem virtual criada como um arquivo XML. Abra esse arquivo e a paisagem virtual deve aparecer nos monitores de RV.
   2. Abra o aplicativo Controle e navegue até o ícone Abrir pasta no canto superior direito da tela. Clique no ícone, que deve abrir a pasta Configs, onde o arquivo . A configuração experimental XLSX está localizada. Abra o arquivo . XLSX com o mesmo nome do arquivo .XML aberto no aplicativo VR. Os acessórios do sistema definidos, como a bomba e o motor para o dispositivo de recompensa extensível, agora são visíveis na guia de controle dentro do aplicativo.
   3. Inicie o teste experimental, pois a coordenação entre esses dois aplicativos permite a criação de uma paisagem virtual interativa. Em última análise, essa integração facilita o monitoramento de dados essenciais, incluindo distância no plano XY e a coleta de recompensas com carimbos de data/hora.
4. Aquisição de dados: extraia os dados comportamentais mais valiosos do sistema, que são dados posicionais e recompensas com carimbo de data/hora. Esses dados são salvos separadamente como arquivos de log.
   1. Dados de posição: Para adquiri-los, siga as etapas descritas abaixo.
      1. Para adquirir dados posicionais XY com carimbo de data/hora dos mouses, primeiro abra o arquivo de planilha do labirinto de aquisição de dados desejado. Na tabela 1, coloque o comando WriteVRAndCamInfoToFile em uma das células abaixo das outras na coluna A. Agora, os dados posicionais serão salvos como um arquivo CSV datado (chamado Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv) automaticamente na pasta de configurações após um teste.
      2. Para exportar os dados de posição após um teste, feche o aplicativo de controle e os dados serão salvos em um arquivo CSV datado. Este arquivo conterá todos os dados específicos de um determinado dia, portanto, tome cuidado para anotar manualmente quando cada sujeito foi colocado e retirado da bola. Abra o arquivo e importe-o usando o conjunto de caracteres Unicode UTF-8. A coluna A é rotulada como DateTime, clique com o botão direito do mouse na guia A e clique em Formatar células. Vá para a hora e clique na opção MM/DD/AAAA HH:MM: SS . Agora, cada evento do sistema será catalogado cronologicamente para posterior análise de dados.
   2. Dados de recompensa: Para adquiri-los, siga as etapas descritas abaixo.
      1. Os dados sobre a ativação da bomba (distribuição de recompensas) são salvos automaticamente como arquivos de log datados no sistema, portanto, não há necessidade de colocar um comando como se faria para os dados de posição. Para acessá-los, vá para a subpasta Arquivos de log da pasta configs.
      2. Repita a etapa 3.4.1 para dados de posição para os dados de recompensa para exportar os dados como um arquivo de planilha. Abra a pasta configs e selecione o arquivo de recompensa datado (chamado Corridor- MM.DD.YYYY ou Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY) quando visualizado na pasta. Isso fornecerá a data e a hora de quando os ratos adquiriram as recompensas, e pode-se usar isso em análises de dados adicionais, dependendo do paradigma que empregaram.

4. Tarefas comportamentais

NOTA: De acordo com metodologias estabelecidas em neurociência comportamental, as tarefas formuladas empregam uma técnica de aprendizagem associativa baseada em recompensa. Ao empregar recompensas imediatas para reforçar comportamentos específicos, os animais são treinados de forma eficaz para executar tarefas repetitivas, facilitadas pela capacidade de teletransporte da RV. Dentro de uma estrutura comportamental virtual, a funcionalidade de teletransporte oferece aos ratos a capacidade de se envolver em tarefas sem o estresse associado à manipulação física, reduzindo simultaneamente a duração da configuração necessária para tarefas análogas do mundo real. Durante as sessões de treinamento, use iluminação vermelha fraca no teto dentro do ambiente experimental. Essa precaução é recomendada devido à diminuição da sensibilidade perceptiva visual em camundongos à luz vermelha, o que mitiga a interferência potencial em sua percepção das telas de realidade virtual (VR), em oposição ao uso de luz branca²².

1. Habituation
   1. Comece a habituação à esteira esférica ao mesmo tempo que sua habituação à regulação de fluidos para associar o tubo de lambida à recompensa usando a motivação fisiológica corretamente cronometrada. Recomenda-se um período de habituação de três dias antes de iniciar o treinamento em pista linear.
   2. No^1º dia, manuseie os ratos por 5 min após a pesagem. Durante essa interação, é aconselhável segurar suavemente o implante da barra de cabeça enquanto os camundongos estão em sua gaiola, criando familiaridade com essa manipulação. Apresente-os à área onde a RV está alojada neste dia para permitir que eles antecipem o ambiente espacial em que os testes experimentais ocorrerão. Este dia inicial de habituação coincide com o início da regulação de fluidos de 15 mL por 100 mg de massa corporal.
   3. No^2º dia, que se alinha com a transição para a etapa de regulação de 10 mL por 100 mg de fluido de massa corporal, manuseie novamente os camundongos por 5 min. Continue segurando suavemente a barra de cabeça enquanto estiver na gaiola. Fixe a barra de cabeça no suporte enquanto permite que os ratos se familiarizem com a esteira esférica por 5 a 20 minutos, em uma pista de repetição infinita ou sem o programa de software ativado. Isso facilita sua adaptação à condição de cabeça fixa. Deve-se antecipar que os camundongos podem excretar resíduos durante esse período, que normalmente diminui em sessões sucessivas.
   4. No^3º dia, que corresponde ao último dia do paradigma de regulação de fluidos (5 mL por 100 mg de massa corporal), manuseie os camundongos por 5 min. Em seguida, prenda-os com segurança à esteira esférica com almofada de ar e apresente-os a recompensas líquidas através do tubo de recompensa.
      1. Apresentar o bico de lambida a ratos ingênuos irá confundi-los no início, portanto, certifique-se de que o mouse esteja ciente de que eles devem beber do tubo.
   5. Sem ser muito contundente, aplique as diretrizes de posicionamento do mouse abaixo e individualize o posicionamento do mouse na bola em relação ao tubo de forma a entregar a recompensa a eles de maneira confortável. Ao iniciar, certifique-se de que os ratos estejam bebendo do tubo; Isso ocorrerá na maioria dos camundongos naturalmente sob condições de restrição de água quando apresentados a líquido para beber.
2. Posicionando os mouses
   1. Pré-posicionamento: Antes de colocar o mouse na bola, estenda o tubo de recompensa centralizado com uma pequena gota de recompensa na ponta. Estenda o tubo de recompensa antes de posicionar o mouse na bola para evitar qualquer lesão potencial resultante de estender inadvertidamente o tubo muito para a frente quando o mouse estiver com a cabeça fixada. Eleve o tubo de recompensa 5-15 mm acima da esteira esférica, de modo que lamber o bico exija uma postura natural da cabeça voltada para a frente.
   2. Fixação da cabeça: Para fixar a cabeça do mouse, coloque-o no lado dominante do manipulador da esteira esférica. Em seguida, usando a mão dominante do manipulador, puxe o mouse pela barra de cabeça em direção à plataforma de fixação da cabeça. Coloque a barra de cabeça no slot destinado à fixação e, em seguida, usando a mão não dominante do manipulador, encaixe a barra de cabeça no lugar.
   3. Localização na bola: Individualize a colocação na esteira esférica para cada mouse, mas certifique-se de que eles atendam aos seguintes requisitos para garantir a motivação para provar a recompensa e minimizar os níveis gerais de estresse.
      1. Alinhe o plano sagital médio do mouse com o centro da esteira esférica. Nos casos em que a barra de cabeça não está reta, certifique-se de que o plano sagital mediano do mouse, em vez da barra de cabeça, esteja alinhado com o centro da colocação. Para maior clareza visual, consulte a Figura 3C.
      2. Certifique-se de que as patas traseiras do mouse não estejam a mais de 11 cm do ápice da esteira esférica e que a cabeça esteja atrás do ápice. Certifique-se de que todas as quatro patas estejam tocando a esteira e que o abdômen possa tocar a esteira quando o mouse estiver em repouso; Isso apoiará a marcha adequada e a estabilidade da bola para correr.
      3. Quando os ratos não correm, isso é chamado de recusa de bola. Se os ratos continuarem a congelar e não tentarem correr, eles provavelmente estão experimentando ansiedade excessiva e, como o investigador, optam por excluí-los do experimento. Neste estudo, um limite quantitativo de 5 dias de recusa da bola foi usado para determinar a exclusão dos dados.
   4. Viés lateral: Quando os ratos começam a se habituar à rotina de treinamento, eles favorecem um lado em detrimento do outro. Isso pode interferir no desempenho da tarefa, portanto, tome cuidado para garantir que qualquer preferência lateral não seja devido à assimetria na forma como o animal é montado na bola. A tarefa do labirinto em Y empregada aqui exige especificamente que o animal faça escolhas para a direita e para a esquerda para otimizar a entrega de recompensas, o que facilita a superação das preferências laterais.
   5. Bico de recompensa: Essa abordagem envolve uma manobra suave conhecida como método kiss it, em que o mouse é guiado em direção ao tubo de lamber estendido até que sua boca quase toque a ponta do bico, garantindo assim a entrega precisa da recompensa. Defina a duração do tubo de recompensa estendido para 1 s quando os ratos receberem recompensas, permitindo que o mouse tenha tempo adequado para consumir totalmente a gota. Individualize o posicionamento do bico de lambida para cada mouse, pois o tamanho e o posicionamento preferido para cada mouse individual podem ser diferentes. Certifique-se de que o tubo de recompensa permaneça centralizado em todos os testes para padronização de lambidas; O mouse deve sempre esperar receber a recompensa no mesmo local físico, independentemente do design do labirinto virtual.
      NOTA: Embora a determinação dessa duração fique a critério do investigador, esses achados indicam que esse período de tempo foi eficaz para facilitar a ingestão completa de recompensa pelo camundongo antes da retração do tubo. A Figura 3B exibe um exemplo de um posicionamento preferível para posicionamento.
   6. Trilha linear: Consistente com estudos anteriores que empregam metodologias semelhantes, use uma tarefa de trilha linear para investigar duas perguntas principais: o tempo necessário para treinar camundongos para atravessar um corredor reto e a taxa de sucesso prevista de aquisição de recompensa por camundongos.
      1. Certifique-se de que os camundongos tenham se adaptado ao paradigma de restrição de fluidos e ao hardware experimental.
      2. Realize uma sessão diária de 30 minutos para se mover ao longo de um corredor virtual linear começando com um comprimento de 1 m. Ao chegar ao final do corredor e receber a recompensa da gota de açúcar, teletransporte os ratos de volta ao ponto de partida.
      3. Determine um avanço baseado em critérios para labirintos mais longos (por exemplo, 1 m, 2 m, 3 m). Avance os ratos para o próximo comprimento do labirinto após atingir 2 dias consecutivos recebendo uma média de 2 recompensas por minuto (Figura 4A).
      4. Documente registros diários de dados com carimbo de data/hora relativos à recuperação de recompensa e a distância percorrida por camundongos na esteira esférica para análise posterior (Figura 4B-D).
      5. Para camundongos que recebem uma média de 2 recompensas por minuto nas trilhas lineares de 3 m, marque-os como proficientes no paradigma de trilha linear. Recomenda-se que os camundongos atinjam essa fase antes de progredir para tarefas comportamentais mais complexas que exijam tomada de decisão.
   7. Tarefas comportamentais complexas que exigem tomada de decisão (Y-Maze): Esta fase explora a viabilidade de progredir de uma tarefa comportamental simples para uma mais complexa que requer tomada de decisão. Para fazer isso, crie uma tarefa Y-Maze de discriminação de sinal planejada.
      1. Neste paradigma do labirinto em Y^23,24, certifique-se de que os ratos naveguem em direção a um ponto de escolha onde dois braços se estendem 45° em qualquer direção, como a forma de um Y. Desative a rotação do ponto inicial do labirinto até atingir o ponto de escolha, dois braços de cores variadas e, em seguida, ative-o dentro da zona de decisão para permitir que o mouse gire na direção desejada.
      2. Ao entrar no braço que leva à zona de recompensa, desative a rotação mais uma vez. Um braço preto representa o caminho correto, enquanto um braço branco representa o caminho incorreto. Use o braço preto e o braço branco como pistas para acomodar possíveis limitações na acuidade visual do camundongo, pois são facilmente distinguíveis, facilitando um exame do uso de informações visuais em sua forma mais simples.
      3. Treine os ratos para navegar em direção ao braço negro para obter uma recompensa de açúcar, com cada teste terminando com os ratos sendo teletransportados de volta ao local inicial. Incorpore no projeto experimental um embaralhamento aleatório do local da recompensa entre os lados esquerdo e direito, garantindo que os ratos associem a recompensa às pistas visuais e não ao lado específico.
      4. Use as mesmas etapas para configurar o labirinto em Y que o corredor linear. Espelhe os critérios de progressão no paradigma do labirinto em Y com os do corredor linear: cada tentativa dura 30 minutos e os camundongos precisam atingir um limite de recompensa predeterminado por 2 dias consecutivos. Um limite de 70% das recompensas adquiridas corretamente é recomendado com base no desempenho médio de coortes de pilotos anteriores no labirinto em Y; está acima do limite de chance (50%) e representa uma porcentagem razoavelmente atingível indicativa de camundongos compreendendo a tarefa (Figura 5A).
      5. Ao chegar ao ponto de escolha, certifique-se de que o mouse selecione um dos braços corretos ou incorretos. No final do braço, teletransporte-o de volta ao ponto de partida para repetir o labirinto dentro de um período de 30 minutos.
      6. Essa abordagem empregou uma abordagem inspirada na psicofísica visual, onde os labirintos ficaram progressivamente mais difíceis de distinguir. Siga a descrição abaixo para a progressão no paradigma do labirinto em Y.
         1. No labirinto em Y inicial, apresente braços pretos e brancos sólidos no ponto de escolha do labirinto. Se o camundongo escolheu corretamente o braço preto para 70% das tentativas por 2 dias consecutivos, progrida-o para um nível subsequente com tarefas de discriminação cada vez mais desafiadoras. Para conseguir isso, introduza gradualmente 10% adicionais da cor contrastante em cada braço em todos os níveis de progressão. Por exemplo, faça a transição do braço branco para ser composto por 90% de brancos e 10% de negros, e vice-versa, tornando a discriminação mais exigente a cada avanço.
            NOTA: A ideia de aumentar é que, se 50% de branco/preto puder ser alcançado, seria um controle eficaz, pois os braços seriam indistinguíveis. No entanto, o mais longe que os camundongos foram capazes de discriminar visualmente foi 80%:20% (Figura 5B).

Resultados

Este estudo piloto teve como objetivo delinear metodologias para o treinamento eficiente de camundongos em duas tarefas distintas: um corredor simples e uma tarefa complexa de tomada de decisão (a tarefa de discriminação visual do labirinto em Y). Esses dados serviram de base para o estabelecimento de diretrizes temporais para o treinamento comportamental em RV.

As etapas do procedimento iniciam-se com o traçado cirúrgico da barra de cabeça na Figura 1. Este implante serve para estabilizar o crânio do camundongo durante as avaliações comportamentais, aumentando assim a precisão das gravações neurais, principalmente quando empregado em conjunto com técnicas de eletrofisiologia ou imagem.

A Figura 2 e a Figura 3 ilustram os componentes de hardware e a configuração do sistema experimental. A Figura 2 detalha o sistema de distribuição de água, que utilizou um método de fonte de placa de Petri. Isso envolveu a fixação de uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm com o lado côncavo voltado para baixo no chão da gaiola, prendendo uma placa de Petri menor de 35 mm x 10 mm com o lado côncavo voltado para baixo no centro da placa maior e colocando outra placa de Petri de 60 mm x 15 mm com o lado côncavo para cima em cima da placa menor para servir como reservatório de água. A altura do prato superior foi cuidadosamente ajustada para evitar a contaminação por material de cama, garantindo que os ratos tivessem fácil acesso à água.

A Figura 3 apresenta as diretrizes de posicionamento do hardware e do mouse do sistema. A Figura 3A mostra a configuração de RV, que apresentava uma matriz de seis telas com uma esteira esférica posicionada centralmente. A Figura 3B mostra o posicionamento ideal do mouse na esteira, com a cabeça alinhada em uma posição natural e todas as quatro patas em contato com a superfície. A Figura 3C compara o posicionamento correto e incorreto do mouse em relação à barra de cabeça, enfatizando que o plano sagital mediano do mouse deve ser centralizado, em vez de se alinhar com a própria barra de cabeça.

A Figura 4 apresenta curvas de aquisição de recompensa em um gráfico de linhas, ilustrando os períodos de aprendizado esperados para corredores estreitos de 1 m, 2 m e 3 m em RV com base em parâmetros predefinidos para progressão. Ele descreve as velocidades médias dos camundongos nos respectivos comprimentos de trilha, demonstrando um aumento gradual na velocidade como evidência de aprendizado e melhoria de tarefas proporcionais ao aumento da dificuldade. Um gráfico de barras também é mostrado ilustrando o número médio de dias necessários para que os camundongos atinjam o critério para as trilhas lineares, bem como um gráfico de barras exibindo as velocidades médias para cada comprimento de trilha. Em seguida, os estágios progressivos da tarefa de trilha linear aprendida pelos camundongos também são ilustrados. Essas tarefas foram projetadas para replicar metodologias estabelecidas na literatura acadêmica, garantindo uma curva de aprendizado viável para camundongos, facilitando seu avanço através dos níveis.

Finalmente, a Figura 5 fornece dados relativos à tarefa Y-Maze. A figura ilustra a natureza progressiva da tarefa, começando com uma discriminação direta entre braços pretos e brancos sólidos. Este estágio inicial serve como um passo fundamental, estabelecendo a capacidade dos camundongos de distinguir entre pistas visuais contrastantes. Os níveis subsequentes da tarefa introduzem uma complexidade crescente, incorporando porcentagens adicionais da cor contrastante a cada braço, desafiando ainda mais as habilidades de discriminação dos camundongos. O aumento gradual da dificuldade da tarefa é exemplificado pela transição de braços sólidos pretos e brancos para braços compostos por 90% de uma cor e 10% da outra. Notavelmente, os dados apresentados na Figura 5 indicam que, embora a precisão da discriminação melhore a cada nível de progressão, alguns camundongos demonstram consistentemente um limiar de capacidade de discriminação visual, atingindo um máximo de 80% / 20% de discriminação branca / negra. Essa observação ressalta as limitações inerentes às habilidades de discriminação visual dos camundongos no contexto da tarefa Y-Maze, fornecendo informações valiosas sobre a viabilidade da tarefa e as capacidades cognitivas dos sujeitos. Posteriormente, são detalhados os estágios progressivos da tarefa de pista do labirinto em Y, que foram projetados para se alinhar às metodologias estabelecidas na literatura. Esses estágios garantiram uma curva de aprendizado viável para os camundongos, apoiando seu avanço gradual através dos níveis.

Figura 1: Instruções cirúrgicas para implante de barra de cabeça. (A) O local da incisão está marcado no crânio do camundongo. (B) Os parafusos devem ser implantados 1 mm à esquerda da sutura interfrontal ligeiramente abaixo do bregma e 3 mm à direita da sutura interfrontal ligeiramente acima do lambda. (C) A barra de cabeça deve ser colocada ao longo da sutura interfrontal. (D) Aplique cimento dentário sobre o implante da barra de cabeça. (E) Visualização real da barra de cabeça após a aplicação do cimento dentário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Sistema de distribuição de água usando um método de fonte de placa de Petri. Uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm foi fixada com o lado côncavo para baixo no chão da gaiola. Uma placa de Petri menor de 35 mm x 10 mm foi centralizada na placa maior, com outra placa de Petri de 60 mm x 15 mm colocada com o lado côncavo para cima para servir como reservatório. Essa configuração garantiu que a água permanecesse não contaminada pela cama e acessível aos ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Hardware do sistema e posicionamento das diretrizes do mouse. (A) Isso exibe a configuração de VR utilizada. Uma configuração de seis telas foi utilizada, com a esteira esférica colocada no meio. (B) Vista lateral do posicionamento ideal do mouse na esteira esférica. A cabeça do rato está em uma posição natural, enquanto todas as quatro patas estão na esteira esférica. (C) Vista superior do posicionamento correto versus incorreto do mouse em relação à barra de cabeça. Para o posicionamento correto, o plano sagital mediano do mouse deve ser centralizado e não a própria barra de cabeça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dados lineares da pista. (A) Os dados apresentados representam as recompensas diárias coletadas em cada período de teste de 30 minutos. Os ratos progrediram para comprimentos de trilha mais longos, uma vez que alcançaram uma média de 2 recompensas por minuto durante 2 dias consecutivos, totalizando 60 recompensas (limite). (B) À medida que os camundongos adquiriam proficiência na tarefa, suas velocidades exibiam um aumento gradual, indicativo da eficácia do reforço de recompensa. O gráfico ilustra a velocidade média diária de cada rato na pista em cm/s, retratando uma progressão linear no comportamento aprendido. (C) Este gráfico de barras ilustra a duração que cada mouse leva para adquirir proficiência em comprimentos de trilha individuais, com as respectivas médias e erro padrão representados para cada comprimento de trilha. (D) Este gráfico de barras demonstra o erro médio e padrão das velocidades médias diárias alcançadas por cada mouse em vários comprimentos de trilha. A progressão quase linear sugere um aprimoramento aprendido na velocidade de corrida. (E) Isso ilustra a progressão da tarefa de pista linear, que requer 2 dias consecutivos de teste de 60 recompensas antes de avançar para uma versão mais longa do labirinto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Dados do Y-Maze. (A) Isso mostra a distribuição das recompensas adquiridas em diferentes estágios da progressão do labirinto em Y. Esta análise se concentrou exclusivamente em um subconjunto de quatro camundongos que completaram todas as fases da trilha linear, garantindo assim uma representação equitativa dos participantes masculinos e femininos. (B) Esta representação visual ilustra os estágios da tarefa Y-Maze, em que os camundongos avançam ao atingir dois dias consecutivos de 70% de escolhas corretas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este estudo empregou uma abordagem abrangente para investigar as respostas comportamentais de camundongos em ambientes de RV, com foco na implementação de procedimentos cirúrgicos, protocolos de restrição de fluidos, configuração do sistema e tarefas comportamentais. Essas descobertas contribuem para o campo, fornecendo detalhes processuais, prazos para treinamento e taxas de sucesso. Isso permitirá uma adoção mais eficaz de procedimentos de RV em camundongos e facilitará o planejamento e a implementação para laboratórios interessados em usar esse procedimento em suas pesquisas.

O implante cirúrgico de barras de cabeça foi essencial para facilitar experimentos comportamentais de cabeça fixa em ambientes de RV. Seguindo cuidadosamente os protocolos estabelecidos e fornecendo cuidados pós-operatórios adequados, a integração bem-sucedida das barras de cabeça foi garantida, minimizando os efeitos adversos na saúde e no comportamento dos animais. Além disso, protocolos de restrição de líquidos foram implementados para regular a ingestão de água e manter os níveis de hidratação e sede entre os camundongos. O processo de aclimatação gradual e o acesso periódico à água foram cruciais para garantir o bem-estar dos animais, facilitando a execução de tarefas comportamentais.

A configuração do sistema comportamental VR envolveu a integração de componentes de hardware e software para criar ambientes virtuais imersivos para os mouses. A utilização de monitores virtuais totalmente imersivos, sistemas de recompensa líquida, bolas de isopor como esteiras esféricas e suportes de cabeça permitiram um controle preciso sobre as condições experimentais e a aquisição de dados. Tarefas comportamentais, incluindo os paradigmas de pista linear e labirinto em Y, foram cuidadosamente projetadas para investigar aspectos-chave do comportamento do mouse, como locomoção, tomada de decisão e processamento de recompensas.

Apesar dos melhores esforços para otimizar os procedimentos experimentais, vários desafios foram encontrados durante o estudo. A variabilidade nas respostas individuais do mouse e as questões técnicas relacionadas à integração de hardware e software representaram desafios para a coleta e análise de dados. Além disso, a dependência de protocolos de restrição de líquidos exigiu um monitoramento cuidadoso do estado de hidratação do animal e o ajuste dos procedimentos experimentais de acordo. Às vezes, os ratos lutavam quando colocados na bola, não bebiam do bico de recompensa ou congelavam e não conseguiam correr na bola. Embora alguns desses desafios possam ser temporários, é crucial monitorar os camundongos para garantir que eles não estejam enfrentando impedimentos em seu progresso. Os camundongos que não apresentarem avanço em comparação com seus pares devem ser retirados do estudo. Um experimento semelhante teve 4 de 55 camundongos removidos devido à sua incapacidade de aprender o paradigma²⁵. Os camundongos que exibiram imobilidade consistente na bola por 5 dias consecutivos foram excluídos do estudo após avaliações completas de seu peso, capacidade de acessar o bico de recompensa para beber e posicionamento na bola para garantir que nenhum problema subjacente estivesse presente. Nesses casos, fica a critério do pesquisador decidir qual estratégia adotar para retomar o estudo de forma eficiente.

Esses protocolos de treinamento foram projetados para desafiar progressivamente os camundongos, garantindo sua proficiência na execução de tarefas comportamentais. Os critérios para progressão da pista linear para o paradigma do labirinto em Y foram baseados na capacidade dos camundongos de atender aos limites de desempenho predeterminados, como alcançar dias consecutivos de testes bem-sucedidos e aquisição de recompensas. A implementação de protocolos de treinamento rigorosos nos permitiu avaliar as capacidades comportamentais e a adaptabilidade dos camundongos a tarefas cada vez mais complexas. Esses protocolos cuidadosamente estruturados fornecem uma estrutura robusta para pesquisadores no campo da neurociência comportamental, oferecendo uma abordagem sistemática para avaliar e treinar animais para diversos paradigmas experimentais. Ao delinear critérios claros de progressão, os pesquisadores podem avaliar com eficiência a curva de aprendizado de sujeitos experimentais e selecionar paradigmas de treinamento de acordo. Além disso, essa abordagem metodológica promove a reprodutibilidade e a padronização entre os experimentos, facilitando análises comparativas e avançando na compreensão dos processos cognitivos e mecanismos de aprendizagem em modelos animais.

Ao projetar um paradigma de RV para camundongos, é crucial reconhecer a variedade de abordagens disponíveis em relação à complexidade da tarefa e à progressão do treinamento. Este protocolo oferece uma ampla estrutura para a construção de um projeto experimental, mas cabe ao investigador adaptar aspectos específicos, como entrega de recompensa, controle de viés, tipo de estímulo, progressão da tarefa e parâmetros do sistema de acordo com as necessidades do estudo. Por exemplo, alguns estudos optam por uma abordagem mais simplificada, com foco no engajamento imediato da tarefa. Um exemplo é Krumin et al., que implementou uma tarefa única e consistente do labirinto em T, em vez de empregar um regime de aprendizado progressivo entre diferentes tarefas. Em contraste, outros estudos oferecem diversos componentes de desenho de ensaio, como estratégias de reforço de estímulos e pistas auditivas. O estudo utilizou o feedback auditivo como punição por tentativas incorretas e forneceu apenas água como recompensa por tentativas corretas²⁶. Por outro lado, Zhao et al. empregaram uma solução de sacarose a 10% como recompensa por tentativas corretas e não incorporaram nenhuma forma de punição por tentativas incorretas²⁷. Em vez disso, eles se concentraram em mitigar respostas incorretas por meio de métodos como o treinamento anti-viés, que envolvia aumentar a probabilidade de mudar a direção da sugestão da escolha anterior do animal e ajustar a ingestão diária de água para aumentar a motivação. Diferenças no desenho experimental, como a presença de pistas espaciais ao longo da tarefa, podem levar a interpretações variadas da codificação neural, como evidenciado por Zhao et al. encontrando seletividade celular do córtex parietal posterior explicada por trajetórias e preferências espaciais, em contraste com as sequências de ativação dependentes de escolha observadas por Harvey et al. ^27,28. É importante notar que o hardware específico usado incluía seis monitores LCD, um bico de lamber extensível e uma esteira de bola de isopor com almofada de ar. Há uma série de diferenças entre os sistemas de realidade virtual entre os laboratórios, incluindo o uso de projetores²⁹ versus monitores de computador, esteiras não esféricas³⁰ e bicos fixos¹⁰ versus bicos de lamber extensíveis.

Em conclusão, este estudo fornece informações valiosas sobre as respostas comportamentais de camundongos em ambientes de RV e demonstra a viabilidade de empregar tecnologia imersiva para investigar comportamentos complexos. Esforços de pesquisa futuros podem se concentrar no refinamento de protocolos experimentais, explorando mecanismos neurais subjacentes aos processos de tomada de decisão e traduzindo descobertas para aplicações clínicas. Ao continuar avançando na compreensão do comportamento do camundongo, os cientistas podem elucidar ainda mais os circuitos neurais e os processos cognitivos subjacentes a comportamentos complexos na saúde e na doença.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube