Aproveitando o poder das cargas de microRNA em pequenas vesículas extracelulares liberadas de seções do cérebro humano recém-congeladas

Resumo

Aqui, estabelecemos um protocolo usando quantidades mínimas de seções de tecido cerebral recém-congelado e um método de centrifugação de alta velocidade acessível, juntamente com cromatografia de exclusão de tamanho para obter pequenas vesículas extracelulares como fontes de biomarcadores de microRNA (miRNA) para distúrbios neurológicos.

Resumo

Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são mediadores cruciais da comunicação célula-célula, transportando diversas cargas como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos (microRNA, mRNA, DNA). A carga de microRNA sEV tem utilidade potencial como um poderoso biomarcador de doença não invasiva devido à capacidade do sEV de atravessar barreiras biológicas (por exemplo, barreira hematoencefálica) e se tornar acessível por meio de vários fluidos corporais. Apesar de numerosos estudos sobre biomarcadores de sEV em fluidos corporais, a identificação de subpopulações de sEV específicas de tecidos ou células continua sendo um desafio, principalmente no cérebro. Nosso estudo aborda esse desafio adaptando os métodos existentes para isolar sEVs de quantidades mínimas de seções congeladas do cérebro humano usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

Após aprovação ética, aproximadamente 250 μg de tecido cerebral humano recém-congelado (obtido do Manchester Brain Bank [Reino Unido]) foram cortados dos 3 tecidos doadores e incubados em solução de colagenase tipo 3/Hibernate-E, com agitação intermediária, seguida de centrifugação seriada e etapas de filtração. Em seguida, os sEVs foram isolados usando o método SEC e caracterizados seguindo as diretrizes do MISEV. Antes de isolar o RNA de dentro desses sEVs, a solução foi tratada com Proteinase-K e RNase-A para remover qualquer RNA extracelular não-sEV. A quantidade e a qualidade do RNA foram verificadas e processadas posteriormente para experimentos de qPCR e sequenciamento de RNA pequeno.

A presença de sEVs foi confirmada por meio de análise de rastreamento de nanopartículas de fluorescência (fNTA) e western blot para marcadores de superfície (CD9, CD63, CD81). A distribuição de tamanho (50-200 nm) foi confirmada por NTA e microscopia eletrônica. A concentração total de RNA dentro de sEVs lisados variou de 3-9 ng/μL e foi usada para quantificação bem-sucedida por qPCR para microRNAs candidatos selecionados. O sequenciamento de RNA pequeno em MiSeq forneceu dados de alta qualidade (Q >32) com 1,4-5 milhões de leituras por amostra.

Este método permite o isolamento e a caracterização eficientes de sEVs a partir de volumes mínimos de tecido cerebral, facilitando a pesquisa não invasiva de biomarcadores e é promissor para estudos equitativos de biomarcadores de doenças, oferecendo insights sobre doenças neurodegenerativas e potencialmente outros distúrbios.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são um dos principais atores da comunicação intercelular em todos os organismos multicelulares¹. EVs são partículas de membrana de bicamada lipídica derivadas de células que podem facilitar a transferência de uma variedade de cargas de carga, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, para as células receptoras. Os EVs podem ter uma ampla faixa de tamanho que varia de 30 nm a 1 μM. Os EVs pequenos (sEVs), definidos como vesículas ligadas a lipídios com diâmetro médio de <200 nm, têm a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica; portanto, eles têm sido implicados na disseminação e exacerbação de doenças neurodegenerativas e outras condições, como doença de Alzheimer (DA), demência frontotemporal (DFT), doença de Parkinson (DP) e cânceres ^2,3. Além disso, como os sEVs podem ser encontrados em uma variedade de biofluidos, como sangue, líquido cefalorraquidiano (LCR), saliva e até urina, seu uso benéfico pode abranger o campo de biomarcadores e diagnósticos não invasivos. Por exemplo, a pesquisa de DA pode apontar para o uso de proporções de proteínas patogênicas de biofluidos, como tau / Aβ, ou mesmo Aβ₄₂ / Aβ₄₀⁴.

Uma carga conhecida de sEVs é o microRNA (miRNA), um grupo de pequenas moléculas de RNA não codificantes de cerca de 22 nucleotídeos de comprimento que se ligam às regiões 3'-UTR do mRNA e geralmente regulam negativamente a expressão de proteínas. Envolvidos em muitos papéis celulares, os miRNAs também têm sido implicados na patogênese de várias doenças, incluindo cânceres e doenças neurodegenerativas. Cheng et al. conduziram uma análise de sequenciamento de alto rendimento de assinaturas de expressão de miRNA sEV derivadas do soro de pacientes com DA⁵. Uma vez acoplados aos registros de neuroimagem e fatores de risco conhecidos de idade, sexo e apresentação do alelo APOE ε4, os resultados foram encontrados para prever a DA com 87% de sensibilidade e 77% de especificidade. Além disso, a pesquisa identificou dois miRNAs de LCR regulados positivamente (miR-151a-3p, let-7f-5p) e 3 miRNAs regulados negativamente (miR-27a-3p, miR-125a-5p e miR-423-5p) que podem potencialmente diagnosticar DP em estágio inicial⁶. Com doenças patológicas, o estado patológico pode preceder certos sintomas característicos das doenças, enquanto na neurodegeneração, o acúmulo de características patológicas ocorre muito antes do declínio cognitivo.

Os microRNAs são potencialmente um biomarcador mais eficaz do que as proteínas, devido às suas diversas funções e regulação epigenética de ordem superior. Usando tecido cerebral, os pesquisadores podem identificar assinaturas específicas de miRNAs sEV (BDsEV) derivadas do cérebro para doenças e seus subtipos. Por exemplo, sEVs com marcadores neuronais e gliais podem apresentar diferentes cargas de miRNA, e a análise pode resultar em métodos mais precisos de detecção de doenças. Além disso, sugere-se que os BDsEVs desempenhem um grande papel na disseminação transsináptica de proteínas neuropatogênicas⁷. Relatórios anteriores sugeriram imunoprecipitação e ultracentrifugação com gradiente de densidade (gradiente de sacarose) para obter sEVs de tecido cerebral fresco congelado ^8,9. No entanto, essas abordagens requerem infraestrutura específica com métodos de ultracentrífuga e purificação a jusante para obter amostras de sEV de alta qualidade¹⁰. Relatórios mais recentes sugeriram várias modificações e melhorias na abordagem 11,12,13; no entanto, apesar disso, o isolamento e o estudo de microRNAs derivados de sEV de tecidos humanos ainda não são amplamente aplicados. A abordagem descrita neste protocolo visa fornecer um protocolo refinado e passo a passo para o estudo sEV derivado do cérebro para melhorar a acessibilidade a essa técnica. Estabelecemos um protocolo usando quantidades mínimas de tecido cerebral, a partir do qual isolamos sEVs puros usando cromatografia de exclusão de tamanho e mostramos dados de sequenciamento de última geração de alta qualidade da carga de microRNA desses sEVs.

Protocolo

O trabalho foi aprovado eticamente pelo Manchester Brain Bank (referência REC 09/H0906/52) e pelo comitê de ética da Universidade de Salford (ID do aplicativo: 3408).

1. Quebra da matriz intracelular usando colagenase em seções de tecido cerebral congeladas

1. Corte em fatias finas 250 mg de tecido cerebral congelado (fragmentos de cerca de 0,4 mm de espessura) usando um bisturi esterilizado em uma placa fria e adicione 2 mL de solução de colagenase tipo III / Hibernate-E 75 U / mL.
2. Incubar cada amostra em banho-maria a 37 °C durante 20 min. No ponto de 5 minutos, inverta cada amostra duas vezes para misturar; no ponto de 10 minutos, pipetar cada amostra três vezes suavemente usando uma tira descartável de plástico de 10 mL.
3. Coloque cada amostra no gelo e adicione 1x coquetel de inibidor de protease e 1x inibidor de fosfatase. Isso interrompe a reação enzimática e é o ponto final da digestão usando colagenase tipo III.
4. Centrifugue cada amostra de tecido cerebral a 300x g por 10 min a 4 °C. Recolher cada sobrenadante e centrifugar a 2000 x g durante 15 min a 4 °C.
5. Recolher novamente cada sobrenadante e filtrar através de um filtro de 0,22 μm. Centrifugar cada filtrado a 10 000 x g durante 48 min a 4 °C.
6. Recolher o sobrenadante e adicionar tampão de precipitação numa proporção de 2:1 para cada amostra. Incubar durante a noite a 4 °C.
7. Centrifugar cada amostra a 10 000 x g durante 96 min a 4 °C e ressuspender o sedimento em 100 μL de PBS livre de vesículas extracelulares (EV).

2. Preparação de colunas de cromatografia de exclusão de tamanho

1. Antes de usar, equilibre a coluna SEC pré-preparada à temperatura ambiente (RT) por 15 min.
   NOTA: A tampa inferior deve ser removida antes da tampa de rosca.
2. Após o equilíbrio, remova o tampão conservante do topo da coluna e lave a coluna duas vezes usando 250 μL de PBS sem EV. Cada lavagem PBS é deixada para entrar na coluna por gravidade.

3. Isolamento de pequenas vesículas extracelulares usando cromatografia de exclusão de tamanho

1. Adicionar o sedimento ressuspenso ao topo da coluna SEC e centrifugar a coluna a 50 x g durante 30 s. Descarte o fluxo.
2. Adicione 180 μL de PBS livre de EV ao topo da coluna SEC e centrifugue a coluna a 50 x g por 1 min, permitindo que os sEVs derivados do cérebro eluam da coluna.
   NOTA: A parte do protocolo detalhada acima está resumida na Figura 1.

4. Confirmação de pequenos marcadores de vesículas extracelulares por western blotting

1. Para lisar sEVs antes da análise de western blot (para garantir que todas as cargas de membrana e citosólicas sejam analisadas), dilua a amostra isolada de sEV 1:1 em lise e tampão de extração (1x inibidor de protease e 1x inibidor de fosfatase).
2. Agitar a amostra a 4 °C durante 30 min.
3. Centrifugar a amostra a 14 000 x g durante 15 min.
4. Coletar o sobrenadante de proteína e medir as concentrações de proteína usando um kit de ensaio de proteína.
5. Misture amostras com 4x tampão Laemmli e carregue 20 μg de proteína em cada poço contra uma escada de proteína pré-corada.
6. Uma vez resolvidas, transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm. Após a transferência, bloqueie a membrana por 2 h em 5% de BSA.
7. Incubar as membranas com anticorpos primários (Tabela 1) durante a noite.
8. Lave a membrana três vezes com tampão de lavagem (1% Tween20 em PBS) e core usando um anticorpo secundário anti-camundongo. Em seguida, lave três vezes com tampão de lavagem (1% Tween20 em PBS).
9. Siga as etapas acima no manuscrito antes de obter imagens das manchas.
10. Imagem usando substrato de peroxidase de rábano (HRP).

5. Confirmação de pequenas vesículas extracelulares por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)

1. Execute NTA para analisar a concentração e o tamanho de todas as partículas na amostra. Efectuar este procedimento diluindo cada amostra em PBS a um factor de diluição de 1:1000.
2. Injectar a amostra no instrumento NTA e ler a amostra no comprimento de onda de 550 nm. Nesta fase, use a quantidade de partículas para medir a quantidade de proteína por partícula (geralmente expressa em femtograma) conforme recomendado nas diretrizes do MISEV.
3. Em seguida, para NTA fluorescente, dilua a máscara celular laranja (CMO) (cora todas as partículas biológicas dentro de uma amostra) em PBS por um fator de diluição de 1:1000. A partir disso, diluir o corante CMO usando a amostra sEV por um fator de diluição de 1:10 - Incubar esta etapa de diluição no escuro por 30 min a 4 ° C.
4. Diluir a segunda diluição da OCM com PBS por um factor de diluição de 1:1000.
   NOTA: A diluição final do corante CMO deve ser de 1:10 000 000.
5. Leia o CMO de cada amostra sEV em um comprimento de onda de 550 nm usando o instrumento NTA.
6. Para os anticorpos fluorescentes de tetraspanina (ver Tabela de Materiais), em primeiro lugar, diluir cada anticorpo respectivo em PBS por um fator de diluição de 1:10. A partir daí, diluir cada um dos corantes utilizando uma amostra de sEV com um factor de diluição de 1:10 - Incubar a etapa de diluição no escuro durante 2 h a 4 °C.
7. Diluir a segunda diluição de anticorpos utilizando PBS com um factor de diluição de 1:1000.
   NOTA: A diluição final de cada anticorpo tetraspanina deve ser de 1:100 000.
8. Leia as leituras de anticorpos fluorescentes da amostra sEV em um comprimento de onda de 550 nm usando o instrumento NTA.

6. Confirmação de pequenas vesículas extracelulares por microscopia eletrônica de transmissão (MET)

NOTA: Este protocolo foi realizado pelo Biomedical Microscopy Facility da Universidade de Liverpool.

1. Em primeiro lugar, fixe as amostras de sEV usando glutaraldeído e core com acetato de uranila.
2. Através de uma série graduada de álcoois, desidratar a amostra pronta para TEM.
3. Amostras de imagens usando um microscópio eletrônico de transmissão adequado.

7. Tratamento com proteinase K e RNase A

1. A 50 μL de EVs isolados de derivados do cérebro, adicione 1 μL de 20 μg / μL de proteinase K e incube a 37 ° C por 30 min.
2. Pare cada reação adicionando 1x coquetel inibidor de proteinase e incube no gelo por 10 min.
3. Após a incubação, adicionar 1 μL de 10 μg/μL de RNase A a cada amostra e incubar a 37 °C durante 30 min.
   NOTA: Passe imediatamente para a seção 8.

8. Isolamento total de RNA de pequenas vesículas extracelulares

1. Para isolar o RNA total, adicione 700 μL de reagente de lise de recuperação de RNA de alta qualidade a 50 μL de amostra EV derivada do cérebro (BDsEV). Agitar cada amostra durante 1 h.
2. Adicionar 140 μL de clorofórmio, agitar vigorosamente cada amostra durante 20 s e deixar incubar em RT durante 3 min.
3. Centrifugar a amostra a 12 000 x g durante 15 minutos a 4 °C e recolher a interfase da amostra. Adicione 1,5x o volume de etanol 100%.
4. Adicionar 700 μL de colunas de isolamento de RNA de mistura de interfase/etanol e centrifugar a ≥8000 x g durante 15 s em RT.
   NOTA: Repita esta etapa usando todas as amostras de interfase / etanol.
5. À coluna, adicione 700 μL de tampão de lavagem e centrifugue a ≥8000 x g por 15 s. Descarte o fluxo.
6. Adicione 500 μL de buffer RPE e centrifugue novamente a ≥8000 x g por 15 s. Descarte o fluxo.
7. Adicione 500 μL de etanol a 80% e centrifugue a ≥8000 x g por 2 min. Descarte o fluxo.
8. Neste ponto, seque a membrana da coluna centrifugando as colunas em velocidade máxima (>8000 x g) por 5 min com a tampa aberta.
9. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta, adicione 14 μL de água livre de RNase diretamente à membrana da coluna e centrifugue a ≥8000 x g por 1 min para eluir o RNA total dos BDsEVs.
10. Quantificar o microRNA total com amostras usando um kit de ensaio de quantificação de miRNA, onde as amostras foram medidas em um fluorômetro de quantificação, selecionando o tipo de ensaio de miRNA.

9. Sequenciamento de RNA pequeno

1. Após a quantificação do miRNA dentro da amostra, sintetize uma biblioteca de cDNA usando o Small RNA-Seq Library Prep Kit.
   NOTA: Usando este protocolo, a geração da biblioteca incluiu quatro etapas: ligação do adaptador 3', purificação, ligação do adaptador 5' e transcrição reversa - onde, no final, uma biblioteca de RNA / cDNA é formada. Após a geração da biblioteca, a amplificação da PCR do endpoint ocorre com a adição de primers de índice (usados para fins de multiplexação), após o que as amostras são purificadas.
2. Para testar a qualidade do RNA, use um ensaio de aplicação de controle de qualidade detalhando o tamanho de cada preparação e a intensidade do pico.
3. Para testar a concentração de DNA, meça a quantificação do DNA em um fluorômetro de quantificação, selecionando o tipo de ensaio dsDNA.
4. Prepare as amostras para Small RNA Seq usando o kit de reagentes, após o que as amostras são carregadas na célula de fluxo.

Resultados

Para confirmar a presença de BDsEVs, foram utilizadas três técnicas: western blotting, NTA e TEM (Figura 3). Os resultados do Western blot (Figura 3A e Arquivo Suplementar 1) mostram a presença de todos os cinco marcadores positivos (CD9, CD63, CD81, Flot-1 e TSG101) e a ausência de Calnexina em sEVs (usado como controle negativo), confirmando que não há contaminação com conteúdo celular. Como esperado...

Discussão

Este protocolo modificado e aprimorado para isolar pequenas vesículas extracelulares derivadas do cérebro e sua carga de microRNA demonstra a viabilidade de usar o mínimo de tecido sem comprometer a qualidade e a quantidade dos produtos a jusante. No campo da descoberta de biomarcadores, a identificação de identificadores moleculares específicos para tipos de células e tecidos pode levar a meios mais acessíveis de testes diagnósticos não invasivos usando fluidos corporais. Al?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094