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Resumo

Aqui apresentamos um estudo estabelecido no iDiv Ecotron, câmaras de mesocosmo terrestre com condições ambientais controladas acima e abaixo do solo, para estudar os efeitos independentes e interativos da história da planta e da história do solo no funcionamento do ecossistema de comunidades de pastagens ao longo de um gradiente de diversidade de plantas.

Resumo

A perda global de biodiversidade tem motivado muitos estudos que variam experimentalmente a riqueza de espécies vegetais e examinam as consequências para o funcionamento do ecossistema. Tais experimentos geralmente mostram uma relação positiva entre a biodiversidade acima e abaixo do solo e o funcionamento dos ecossistemas terrestres. Além disso, essa relação tende a se fortalecer com o tempo, vista como um funcionamento aprimorado de diversas comunidades de plantas e um funcionamento reduzido de comunidades de plantas de baixa diversidade. Diferenças na montagem da comunidade multitrófica e interações bióticas em comunidades de plantas de alta versus baixa diversidade são hipotetizadas para afetar o desempenho da planta, alterando a estrutura e função da comunidade consumidora e impulsionando respostas plásticas ou microevolutivas de espécies de plantas nas comunidades de plantas. Para resolver essa complexa interação da história da comunidade, separamos esses efeitos em história da planta e do solo. A história da planta refere-se a todas as respostas no nível da planta às pressões de seleção abiótica e biótica passadas experimentadas em suas comunidades, enquanto a história do solo se relaciona a todas as propriedades abióticas e bióticas do solo desenvolvidas como um legado das interações planta-solo sob diversidade variável de plantas. Montamos um experimento de biodiversidade em um Ecotron, uma instalação de mesocosmo terrestre que permite controlar as condições ambientais acima e abaixo do solo, para testar se o fortalecimento da relação de funcionamento da biodiversidade e do ecossistema se deve à história do solo, à história das plantas ou a uma combinação de ambas. Estabelecemos um gradiente de diversidade de plantas consistindo de 1, 2, 3 e 6 espécies de plantas de pastagem e aninhadas fatorialmente com a história do solo e os tratamentos da história da planta para cada nível de riqueza de espécies de plantas. Resultados representativos demonstram o estabelecimento bem-sucedido de tratamentos-alvo no experimento Ecotron, observando os efeitos da história da planta e do solo no desenvolvimento inicial da planta e no crescimento final da planta. Além disso, fornecemos um estudo de caso para análise de dados de variáveis de resposta individuais. Descrevemos os objetivos e métodos de pesquisa para avaliar de forma abrangente as respostas multifuncionais aos tratamentos experimentais necessários para, em última análise, abordar a hipótese abrangente.

Introdução

Nas últimas três décadas, as crescentes preocupações com a perda de biodiversidade levaram a uma extensa pesquisa focada na manipulação experimental da riqueza de espécies de plantas para investigar seu impacto no funcionamento do ecossistema 1,2. Estudos experimentais têm demonstrado uma relação positiva entre a diversidade de plantas e o funcionamento do ecossistema1, que tende a aumentar com o tempo 3,4,5,6,7,8,9. Esta é uma descoberta significativa, pois sugere que os resultados experimentais obtidos de comunidades jovens e recém-estabelecidas provavelmente subestimam as consequências da perda de biodiversidade, enfatizando a importância de conservar ecossistemas mais antigos e ricos em espécies10.

Mudanças nos processos bióticos e abióticos ao longo do tempo, que só podem ser observadas em experimentos de longo prazo, são uma possível explicação para os efeitos amplificadores da biodiversidade no funcionamento do ecossistema. A alta diversidade de plantas tem sido associada a aumentos nas concentrações de carbono e nutrientesdo solo 3,9,11,12,13, complementaridade otimizada de recursos 3,8,14, diferenciação de nicho aprimorada entre plantas15, acúmulo de mutualistas em todos os níveis tróficos10,16e diminuição das ameaças de patógenos e herbívoros por meio de mecanismos regulatórios de cima para baixo mais fortes 17,18,19. Por outro lado, a baixa diversidade de plantas tem sido associada à pressão seletiva em direção ao aumento do investimento em defesas de plantas e ao uso menos eficiente de recursos 10,20,21,22. Em conjunto, as diferenças na montagem da comunidade multitrófica e nas interações bióticas em comunidades de plantas de alta versus baixa diversidade influenciam o desempenho da planta, alterando a estrutura e a função da comunidade consumidora, bem como impulsionando mudanças plásticas ou microevolutivas de espécies de plantas no nível das comunidades de plantas 23,24,25,26. Para resolver a complexa interação da história da comunidade, esses efeitos foram separados em dois componentes importantes: história da planta e história do solo. A história da planta refere-se a todas as respostas das plantas às pressões de seleção abiótica e biótica passadas experimentadas em suas respectivas comunidades, enquanto a história do solo refere-se a todas as propriedades abióticas e bióticas do solo desenvolvidas como resultado das interações planta-solo 23,24,27,28. Ambos os componentes são cada vez mais reconhecidos como fatores-chave nos efeitos de longo prazo na biodiversidade 29,30,31.

Estudos experimentais de campo fornecem informações valiosas sobre os efeitos de longo prazo do solo e da história da planta em condições ambientais realistas e em grande escala espacial32,33. No entanto, os experimentos de campo estão sujeitos a vários fatores externos descontrolados, como flutuações climáticas, distúrbios naturais e interações com outros organismos. Em contraste, experimentos de microcosmo em pequena escala, embora limitados na captura da complexidade e dinâmica dos ecossistemas naturais, oferecem controle preciso sobre fatores abióticos como temperatura, luz e água34. Para combinar as vantagens de ambas as abordagens, novas instalações experimentais chamadas 'Ecotrons' surgiram na década de 1990 (por exemplo, Ecotron em Silkwood, Reino Unido34; Ecotron em Montpellier, França35; Ecotron em Hasselt, Bélgica36). Roy et al. (2021)37 definem um Ecotron como uma instalação experimental que consiste em recintos replicados projetados para acomodar amostras do ecossistema, permitindo a simulação realista das condições ambientais acima e abaixo do solo, facilitando a medição simultânea e automatizada dos processos do ecossistema. Assim, os Ecotrons permitem o estudo integrado de processos ecossistêmicos complexos, interações multitróficas e funções ecossistêmicas. Eles podem abrigar uma variedade de organismos acima e abaixo do solo de vários níveis tróficos em uma grande série de câmaras de mesocosmo independentes, permitindo o controle e monitoramento precisos das condições ambientais em sistemas acima e abaixo do solo37 , 38 .

Neste estudo, montamos um experimento no iDiv Ecotron 38,39, conhecido como "JenaTron Experiment" (Figura 1 e Figura 2), para testar se as relações biodiversidade-funcionamento do ecossistema (BEF) em comunidades com diferentes níveis de riqueza de espécies de plantas são moduladas pela história do solo, história de plantas compartilhada ou um efeito combinado de ambos. O iDiv Ecotron é projetado especificamente para experimentos de biodiversidade multitrófica, com foco na investigação conjunta de interações acima e abaixo do solo em ecossistemas terrestres 38,39,40. É composto por 24 unidades experimentais idênticas, denominadas 'EcoUnits' (Figura 2F, G), cada uma capaz de acomodar até quatro ecossistemas individuais em compartimentos isolados (Figura 2K), permitindo a construção de ecossistemas complexos e quase naturais, minimizando o impacto da variabilidade ambiental. Uma vantagem importante é a capacidade de estabelecer múltiplas réplicas de monólitos de solo intactos (Figura 2A-C) sob condições ambientais controladas, o que permite a medição de processos ecossistêmicos intrincados, incluindo efeitos de feedback planta-planta e planta-solo, que muitas vezes são difíceis de capturar em experimentos de microcosmo de pequena escala38,39.

Na Europa, as pastagens seminaturais estão entre os ecossistemas terrestres mais biodiversos e complexos, fornecendo serviços ecossistêmicos vitais. No entanto, desde o início doséculo 20, essas pastagens extensivamente manejadas têm enfrentado ameaças crescentes de mudanças no uso da terra, tornando-as um foco importante para a conservação e pesquisa da biodiversidade. Um dos experimentos de biodiversidade mais antigos do mundo em pastagens extensivamente manejadas é o Jena Experiment32,33, localizado em Jena, Alemanha (50.951 ° N, 11.621 ° E, 139 m acima do nível do mar; site: https://the-jena-experiment.de). Estabelecido em 2002, o experimento investiga as relações entre a diversidade de plantas de pastagem e o funcionamento do ecossistema, com foco particular na ciclagem de nutrientes e nas interações tróficas32,33. Para a instalação do Experimento JenaTron dentro do iDiv Ecotron, utilizamos o Experimento Baseado em Características41 (TBE), um componente do Experimento Jena iniciado em 2010 e concluído em 2021. Em 2022, 23 parcelas do TBE foram selecionadas para estabelecer um gradiente de diversidade de plantas variando de uma a seis espécies, abrangendo mais de 24 comunidades de plantas dentro do iDiv Ecotron. Essas comunidades compreendiam seis espécies de plantas de pastagem, que se sobrepunham ao Experimento Principal do Experimento Jena e representavam três espécies de gramíneas (Anthoxanthum odoratum L., Dactylis glomerata L., Holcus lanatus L.) e três espécies forb (Leucanthemum vulgare agg., Plantago lanceolata L. e Ranunculus acris L.; ver Tabela 1 para obter detalhes sobre a composição de espécies de plantas e réplicas para cada nível de diversidade de plantas). Essas espécies, difundidas e frequentemente coexistindo em pastagens europeias seminaturais, também diferem em suas características de aquisição de recursos temporais, tornando-as ideais para estudos abrangentes de uso de recursos temporais, como a fenologia vegetal41. As 24 composições de plantas foram atribuídas aleatoriamente a todas as EcoUnits (Figura 1C), com cada EcoUnit subdividida em quatro compartimentos para acomodar as combinações fatoriais de tratamentos de histórico de solo e histórico de plantas.

A história do solo (Figura 1A) foi estabelecida escavando um total de 96 monólitos de solo do Experimento Jena. O solo do local é um solo de várzea rico em nutrientes classificado como Fluvisolo Eutric, desenvolvido a partir de sedimentos argilosos de rios32,33. Informações detalhadas sobre o pH do solo, mudanças na textura do solo e matéria orgânica dentro do perfil do solo do Experimento Jena podem ser encontradas em Lange et al. (2023)9. Dos 96 monólitos, 48 foram obtidos escavando dois monólitos de cada uma das 22 parcelas TBE, abrangendo monoculturas, misturas de duas e três espécies. Além disso, quatro monólitos foram retirados de uma parcela de oito espécies, que servirá como uma mistura de seis espécies no Experimento JenaTron. Cada um desses 48 monólitos de solo (profundidade: 0,8 m; diâmetro: 0,5 m) abrigou uma comunidade de residência específica de parcela desde 2010, representando assim uma história de solo específica da comunidade de plantas (+SH). Os 48 monólitos restantes foram escavados em quatro parcelas de solo descoberto que foram mantidas livres de vegetação desde o início do Experimento Jena em 2002, portanto, sem qualquer história de solo específica da comunidade de plantas (-SH). De cada uma das quatro parcelas de solo descoberto, 12 monólitos foram escavados. Os dois tratamentos de história do solo (+SH; -SH) foram combinados fatorialmente com dois tratamentos de história de plantas por meio do plantio de plantas pré-crescidas que refletiam a composição específica da comunidade de plantas do TBE em uma densidade igual, com plantas individuais espaçadas de 6 cm.

A história da planta (Figura 1B) foi estabelecida usando duas fontes de sementes distintas para cada uma das espécies de plantas selecionadas do pool de espécies do Experimento de Jena: A primeira fonte consistiu em sementes coletadas de plantas que passaram por uma história específica da comunidade desde 2010, correspondendo às parcelas exatas do Experimento Baseado em Características (TBE) das quais os monólitos do solo foram escavados (+PH). Essas sementes foram coletadas de maio a setembro de 2019 dependendo da fenologia de floração das espécies, garantindo um mínimo de cinco indivíduos por espécie e parcela foram amostrados. Após a coleta, as sementes foram limpas e armazenadas a -20°C até o início do Experimento JenaTron. A segunda fonte de sementes foi composta por sementes obtidas de um fornecedor comercial de sementes que produzia sementes de procedência regional. Essas sementes foram usadas para estabelecer as parcelas de TBE em 2010, representando plantas sem um histórico de seleção específico da comunidade dentro do Experimento Jena (-PH) e foram armazenadas a -20°C de 2010 até o início do Experimento JenaTron. Ambas as histórias das seis espécies de plantas perenes foram pré-cultivadas de fevereiro a maio de 2022 em quatro câmaras da estufa de pesquisa iDiv localizada em Leipzig, Alemanha (51.330°N, 12.393°E, 120 m acima do nível do mar).

A combinação fatorial de histórico do solo (SH) e histórico de plantas (PH) em cada nível de riqueza de espécies de plantas resultou em quatro tratamentos dentro de cada uma das 24 EcoUnits: (1) com histórico do solo, com histórico de plantas (+SH/+PH), (2) com histórico de solo, sem histórico de plantas (+SH/-PH), (3) sem histórico de solo, com histórico de plantas (-SH/+PH) e (4) sem histórico de solo, sem história de plantas (-SH/-PH; Figura 1C). O objetivo principal do Experimento JenaTron é investigar se o fortalecimento da relação entre a biodiversidade e o funcionamento do ecossistema se deve à história do solo, à história das plantas ou a uma combinação de ambas. Nossa hipótese é que as comunidades de plantas com histórico específico da comunidade de plantas e solo compartilhadas mostrarão a relação BEF mais forte, enquanto uma exclusão experimental da história do solo, história da planta ou ambas pode ter efeitos prejudiciais nas relações positivas da diversidade de plantas e funcionamento do ecossistema. Em última análise, se o solo ou a história das plantas alterassem a relação entre a riqueza de espécies de plantas e o funcionamento do ecossistema, isso serviria como uma consideração importante para a conservação e monitoramento de comunidades restauradas e novas preservadas localmente.

Protocolo

NOTA: Certifique-se de que o equipamento de proteção individual adequado (por exemplo, capacetes, luvas, coletes, sapatos de segurança, etc.) seja fornecido em todas as etapas do protocolo.

1. Solos: Preparação, escavação, instalação

  1. Fontes de solo, seleção de parcelas e preparação (fevereiro de 2022)
    1. Selecione duas fontes de solo do local de campo do Experimento de Jena:
      1. Selecione 23 parcelas TBE que abrigaram uma comunidade específica da parcela por 12 anos, a fim de cobrir um gradiente de diversidade de plantas de 1, 2, 3 e 6 espécies. Designe essas parcelas como tratamento JenaTron Experiment "com histórico de solo específico da comunidade de plantas" (+SH).
      2. Selecione 4 parcelas de solo descoberto com as mesmas propriedades do solo que as parcelas TBE (pH, teor de areia, etc.), mas mantidas sem cobertura vegetal desde 2002. Designe essas parcelas como tratamentos do JenaTron Experiment "sem um histórico específico da comunidade de plantas" (-SH).
    2. Remova cuidadosamente os 5 cm superiores de solo de todas as parcelas selecionadas usando uma miniescavadeira para equalizar as condições nos tratamentos do histórico do solo.
  2. Escavação de monólito de solo (março de 2022)
    1. Configure o dispositivo de extração de monólito em cada parcela, monte um sistema de corte em um cilindro de aço vazio e insira-o no dispositivo de extração (Figura 2A).
    2. Ligue o dispositivo e o sistema de corte girará em torno da parede externa do cilindro. O sistema corta um entalhe no solo no qual o dispositivo de extração pressiona simultaneamente o cilindro de aço. Paralelamente, use uma miniescavadeira para escavar um poço ao lado do cilindro de aço (Figura 2B).
    3. Quando o cilindro de aço estiver completamente embutido no solo, suba no poço lateral e prenda o monólito na borda inferior do cilindro de aço montando uma placa inferior temporária e use o dispositivo de extração de monólito para retirá-lo do poço de escavação (Figura 2C).
    4. Desmonte o sistema de corte do cilindro de aço, monte uma placa superior temporária no cilindro de aço, levante o monólito usando uma suspensão presa à miniescavadeira e vire-o de cabeça para baixo.
  3. Instalação do sistema de sucção de água (março de 2022)
    1. Desmonte a placa inferior, remova aproximadamente 5 cm da camada de solo com uma espátula e guarde-a para uso posterior.
    2. Incorpore um anel de sondas de sucção de água (8 velas conectadas com mangueiras de cloreto de polivinila [PVC]) em pó de quartzo, umedeça-o com água desmineralizada (VE) e reabasteça o fundo do cilindro de aço com o solo removido anteriormente.
    3. Conecte a peça final de PVC do anel da sonda de sucção de água à placa inferior e aparafuse-a posteriormente.
    4. Gire o cilindro de aço com a suspensão da miniescavadeira na posição vertical novamente, etiquete-o individualmente, vede as aberturas nas paredes do cilindro com fita adesiva e embrulhe o cilindro em papel alumínio para proteção durante o transporte.
    5. Transporte os monólitos de solo com um caminhão para o iDiv Ecotron, localizado na estação de campo experimental do Centro Helmholtz de Pesquisa Ambiental (UFZ) em Bad Lauchstädt, Alemanha (51.392°N, 11.876°E, 116 m acima do nível do mar).
  4. Instalação de sensores de solo (abril de 2022)
    1. Depois de desembalar, corte furos de encaixe precisos para os sensores horizontalmente no monólito de solo com uma lâmina de aço personalizada usando as aberturas na parede do cilindro em três profundidades diferentes (9,5 cm, 21,5 cm e 43,5 cm).
    2. Coloque os sensores de solo nos orifícios, use um tronco de madeira para colocá-los na posição correta e aparafuse as aberturas com tampões de vedação feitos sob medida.
  5. Instalação dos monólitos de solo nas EcoUnidades (abril de 2022)
    1. Levante cuidadosamente a parte técnica e superior de cada EcoUnit da parte inferior (Figura 2G). Transporte a parte inferior para os cilindros de aço que abrigam os monólitos de solo intactos equipados com sensores de solo.
    2. Prenda cada cilindro de aço a uma suspensão, levante-o com uma empilhadeira e monte um conector no anel da vela de sucção conectado à placa inferior.
    3. Levante quatro monólitos de solo para o recipiente inferior de cada uma das 24 EcoUnits (Figura 2F), com dois tendo o mesmo histórico de solo específico da comunidade de plantas (+SH) e dois sem histórico de solo específico da comunidade de plantas (-SH). Conduza os cabos dos sensores de solo pelas aberturas do recipiente de solo.
    4. Fixe os cilindros de aço na parte inferior com parafusos e, posteriormente, conecte os anéis das velas de sucção de água de cada cilindro ao sistema de sucção de água da EcoUnit através do conector previamente instalado.
    5. Use a empilhadeira para transportar o contêiner equipado com os monólitos de solo para um pavilhão (24 m x 24 m).
    6. Coloque cuidadosamente as partes técnicas e superiores (com paredes internas entre as subunidades [Figura 2K]) de cada EcoUnit de volta em cima da parte inferior.
    7. Organize todas as 24 EcoUnits em três linhas, cada uma consistindo em dois grupos de quatro EcoUnits, formando um total de seis blocos. Garanta uma distância de centro a centro de 6 m entre os blocos dentro de cada linha e 8,2 m entre as linhas. Em cada bloco, atribua aleatoriamente os quatro níveis de diversidade de plantas (1, 2, 3 e 6) às quatro EcoUnits, garantindo uma distribuição uniforme das espécies em todas as EcoUnits sempre que possível.

2. Plantas: Instalação de preparação e cultivo

  1. Seleção de espécies e material de sementes
    1. Selecione as seguintes seis espécies de plantas do pool de espécies do Jena Experiment: Anthoxanthum odoratum L. (Poaceae), Dactylis glomerata L. (Poaceae), Holcus lanatus L. (Poaceae), Leucanthemum vulgare agg. (Asteraceae), Plantago lanceolata L. (Plantaginaceae) e Ranunculus acris L. (Ranunculaceae).
    2. Para cada espécie, selecione o material de semente proveniente de duas fontes de sementes diferentes:
      1. Use sementes de plantas que cresciam nas parcelas TBE do Experimento Jena desde 2010 (com histórico de plantas, + PH).
      2. Use o material de semente original que foi usado para iniciar o TBE em 2010 proveniente de um produtor regional de sementes (sem histórico de plantas, -PH).
  2. Preparação do substrato (fevereiro de 2022)
    1. Colete solo específico de cada uma das parcelas selecionadas no local de campo do Experimento de Jena. Encha o solo em caixas plásticas de 20 L e armazene-o a 4 °C até ser usado para o cultivo de plantas.
    2. Peneire cada solo específico da parcela através de uma malha de 4 mm. Misture o solo das quatro parcelas de solo nu antes de peneirar.
    3. Para remover a biota indesejada, transfira areia de quartzo para recipientes de aço inoxidável e aqueça em um forno de secagem por 4 h a 200 °C.
    4. Misture solo específico da parcela e areia de quartzo por volume na proporção de 3:1 e encha a mistura de solo e areia em placas multipotes usando uma pá de plástico (total n = 152).
    5. Rotule cada prato multipote individualmente e coloque-os em uma estufa com ciclo dia-noite de 16 h/18 °C e 8 h/12 °C, mantendo umidade moderada de 60% a 70% de umidade relativa (UR).
    6. Regue as placas sob demanda e mantenha-as nuas por duas semanas para permitir que os bancos de sementes do solo germinem. Elimine todas as placas duas vezes para remover mudas indesejadas.
  3. Campanha de semeadura (março-abril de 2022)
    1. Determine a ordem de semeadura com base no tempo de germinação específico da espécie da seguinte forma:
      1. Semeie R. acris 2 semanas antes de outras ervas
      2. Semeie P. lanceolata e L. vulgare 1 semana antes das gramíneas A. odoratum, D. glomerata e H. lanatus.
    2. Semeie todas as espécies, exceto R. acris, diretamente no substrato solo-areia específico da parcela (3:1) em pratos multipotes com duas ou três sementes por vaso. Após a germinação bem-sucedida, desbaste todas as espécies em mudas únicas usando uma pinça de aço para molas.
    3. Pré-trate as sementes de R. acris em placas de Petri em papel de filtro umedecido com uma solução de ácido giberélico (1000 mg. L−1) para quebrar a dormência (Figura 2D). Incubar as sementes por 24 h.
    4. Transferir as sementes de R. acris para papel filtro umedecido com água desmineralizada (VE) até a germinação. Assim que as sementes atingirem o estágio de radícula, pique as mudas no substrato de solo e areia específico da parcela (3: 1) nas placas multipotes preparadas usando uma pinça de aço para molas.
    5. Regue todos os indivíduos da planta com água deionizada sob demanda e mantenha-os na estufa até o transporte para o iDiv Ecotron (Figura 2E-H)
  4. Campanha de plantio (maio de 2022)
    1. Projete esquemas de plantio individuais para todos os monólitos de solo com as seguintes características:
      1. Garantir um número equilibrado de indivíduos por espécie dentro das comunidades vegetais.
      2. Mantenha uma distância de 6 cm entre cada planta individual e sua vizinha.
      3. Randomize o padrão de plantio entre as EcoUnits, mas mantenha-o constante dentro das subunidades.
    2. Use um estêncil de plantio feito sob medida para marcar a posição exata de cada planta individual nos monólitos do solo. Use palitos de dente de plástico de cores diferentes para marcar, atribuindo uma cor específica a cada espécie. Após a marcação, remova o estêncil (Figura 2I).
    3. Plante as plantas pré-cultivadas em todos os monólitos do solo dentro de uma semana usando plantadores de bulbos com 4 cm de diâmetro (5280 indivíduos de plantas no total; Figura 2J).

3. Curso do experimento

  1. Fase de estabelecimento de três semanas (maio de 2022):
    1. Substitua todos os indivíduos que não sobreviveram à campanha de plantio dentro de 2 semanas após o plantio inicial (n = 124 [2,35%]).
    2. Acenda as luzes e defina o regime de iluminação para um ciclo dia-noite de 16/8 h. Para replicar a duração do dia regional no final da primavera e no verão no início do experimento, simule o crepúsculo diminuindo as luzes de 100% a 75% de intensidade ao longo de uma hora, depois para 0% na próxima hora (100% de intensidade: ~ 370 μmol / (m² · s)). Simule o amanhecer invertendo esse padrão de escurecimento.
    3. Equalize a umidade superior do solo em 20% (± 3%) em volume usando um kit de medição de umidade do solo.
    4. Defina a irrigação inicial para 450 mL a cada 12 h para cada subunidade.
    5. Conecte sensores de ar e solo para monitorar a temperatura e a umidade durante todo o experimento.
  2. Fase experimental (junho-outubro de 2022)
    1. Seguindo a sazonalidade natural, encurte a duração do dia em uma hora inteira a cada 2 semanas, de agosto a outubro, para levar em conta a duração do dia regional do final do verão ao outono.
    2. Aumente a irrigação inicial para 650 mL a cada 12 h em julho e 750 mL a cada 12 h em agosto, ajustando-se às demandas de água da planta.
    3. Elimine constantemente as mudas indesejadas no estágio de cotilédone usando uma pinça para manter a densidade da planta, minimizando a perturbação da estrutura do solo.
    4. De acordo com o manejo padrão para prados extensivamente manejados, realizar duas colheitas de biomassa acima do solo, cortando as plantas 3 cm acima da superfície do solo com uma tesoura.

Resultados

Para fornecer informações iniciais sobre a eficácia dessa abordagem em testar os efeitos independentes e interativos da história da planta e do solo nas relações de funcionamento da biodiversidade e do ecossistema, primeiro avaliamos fotografias de duas EcoUnits representativas após a fase de estabelecimento de 3 semanas do Experimento JenaTron, onde os efeitos do tratamento rapidamente se tornaram visíveis (Figura 3). Além das diferenças específicas do tratamento na altura e cor da comunidade de plantas (Figura 3A), também reconhecemos diferenças específicas do tratamento no tempo de floração de R. acris. Especificamente, as plantas cultivadas a partir de sementes sem histórico de plantas pareciam ter um início de floração mais cedo do que as plantas cultivadas a partir de sementes com o histórico de plantas específico da comunidade do Experimento Jena (Figura 3B).

Para avaliar se as comunidades recém-estabelecidas no iDiv Ecotron refletem com precisão as comunidades de campo originais, uma análise comparativa da altura da planta vegetativa específica da espécie foi realizada como um indicador do desenvolvimento final da planta entre o JenaTron Experiment e as parcelas TBE. No experimento JenaTron, a altura da planta foi determinada como o valor médio da folha vegetativa mais alta de três indivíduos por espécie de planta em cada uma das 24 comunidades e combinações de tratamento pouco antes da primeira campanha de colheita no final de julho de 2022. No TBE, a altura vegetativa da planta foi determinada como o valor médio da maior folha vegetativa de três indivíduos por espécie vegetal e parcela em julho de 2012. As medições de altura da planta do iDiv Ecotron exibem uma forte correlação com as das parcelas de campo do Experimento Jena (Figura Suplementar 1).

Para fornecer ainda mais um estudo de caso para análise de dados, a altura da planta vegetativa no iDiv Ecotron foi investigada com mais detalhes. Nós nos concentramos em análises em nível de espécie e comunidade e testamos se a história das plantas, a história do solo e a diversidade das plantas influenciam o crescimento vegetativo das plantas. Para isso, usamos modelos lineares de efeitos mistos (LMM) e resumimos os resultados via ANOVA (soma dos quadrados do tipo I; para resultados detalhados da ANOVA, consulte a Tabela Suplementar 1). No nível da parcela, as variáveis de resposta foram a altura vegetativa média da planta e o coeficiente de variação da altura da planta (CV = dp/média 100). Os efeitos fixos incluíram diversidade de plantas (numérica), tratamentos de história de plantas e solo e suas interações. Os efeitos aleatórios incluíram a EcoUnit aninhada dentro do bloco do salão Ecotron. No nível das espécies, incluímos adicionalmente espécies e sua interação com a diversidade de plantas e tratamentos históricos em termos fixos. As transformações de dados (log para altura da planta e raiz quadrada para altura (CV) garantiram que as suposições do modelo fossem atendidas. As análises foram conduzidas usando R (Versão 4.3.1)42 e o pacote nlme para LMMs43. Os resultados mostraram diferenças significativas entre as espécies na altura das plantas, com gramíneas mais altas que as forbes (Figura 4, Figura Suplementar 2). Em todas as espécies, a história do solo teve um efeito positivo na altura das plantas (F(1,66) = 11,11, P = 0,001), enquanto a história e a diversidade das plantas não tiveram impacto significativo (F(1,66) = 0,22, P = 0,64 e F(1,17) = 1,52, P = 0,23, respectivamente; Figura 4). No nível da comunidade, a diversidade de plantas não teve efeito sobre a altura (F(1,17) = 0,01, P = 0,91; Figura 5A) mas aumentou significativamente o CV da altura da planta dentro das comunidades (F (1,17) = 14,29, P = 0,002; Figura 5B). Não foram encontrados efeitos significativos da história da planta ou do solo sobre a altura da planta CV (F(1,68) = 0,55; P = 0,46; F(1,68) = 0,09, P = 0,76; Figura 5). Carregamos os dados e o script R no banco de dados Jena Experiment (https://doi.org/10.25829/QN9R-J839).

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Figura 1: Configuração do experimento JenaTron. (A) A História do Solo (SH) foi estabelecida escavando 96 monólitos de solo intactos do Experimento Jena (JE), dos quais metade (n = 48) foram obtidos de 23 parcelas que abrigaram uma comunidade específica de parcela por 12 anos (+SH), enquanto a outra metade (n = 48) foi obtida de quatro parcelas de solo nu mantidas livres de vegetação desde o início do Experimento Jena em 2002 (-SH). (B) A história da planta (PH) foi estabelecida usando duas fontes de sementes para cada uma das seis espécies de plantas: sementes coletadas de plantas cultivadas desde 2010 nas mesmas parcelas, onde os monólitos foram escavados no Experimento Jena (+ PH), e as sementes originais usadas para semear essas comunidades no campo em 2010 (-PH). (C) A história da planta e a história do solo foram cruzadas independentemente para cada composição em diferentes níveis de diversidade de plantas (1, 2, 3 e 6), resultando em quatro tratamentos em cada EcoUnit do iDiv Ecotron: (1) +SH/+PH, (2) +SH/-PH, (3) -SH/+PH e (4) -SH/-PH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: O iDiv Ecotron na Estação de Pesquisa do Centro Helmholtz de Pesquisa Ambiental (UFZ) em Bad Lauchstädt, Alemanha. (A) Equipamento de escavação de monólitos de solo no campo, (B) Escavação de monólitos de solo no campo, (C) Poço de escavação no campo, (D) Preparação de sementes de Ranunculus acris em placas de Petri em papel de filtro umedecido com solução de ácido giberélico na estufa, (E) Pré-cultivo de plantas com substrato de solo específico para parcelas em placas multipotes na estufa, (F) EcoUnits no salão iDiv Ecotron, (G) Representação esquemática de uma unidade experimental ("EcoUnit") com equipamento técnico (adaptado de Eisenhauer et al. (2019)23 e Schmidt et al. (2021)38), (H) Placas com todos os indivíduos a serem plantados no Experimento JenaTron) após o transporte para o iDiv Ecotron, (I) Marcação específica da espécie das posições de plantio para todos os indivíduos de plantas em um monólito de solo feito com um estêncil de plantio, (J) Plantio de indivíduos de plantas em um monólito de solo usando plantadores de bulbos, (K) Quatro lisímetros em uma EcoUnit com paredes internas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Dois representantes das 24 EcoUnits, cada uma abrigando uma comunidade em todas as combinações de tratamento da história da planta e do solo. (A) EcoUnit com uma mistura de 3 espécies (A. odoratum, H. lanatus e P. lanceolata) com diferenças específicas de tratamento na altura e cor da vegetação da comunidade. (B) EcoUnit com uma monocultura de R. acris, indicando diferenças dependentes da história da planta no tempo de floração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Efeitos da história da planta e do solo na altura vegetativa (cm) das seis espécies de plantas de pastagem antes da primeira colheita em julho de 2022. As espécies são listadas em ordem alfabética dentro de grupos funcionais (gramíneas seguidas de forbes). Os tratamentos de história da planta (+PH/-PH) estão no eixo x, e a história do solo (+SH/-SH) é codificada por cores (amarelo/preto) nos gráficos de caixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Efeitos da riqueza de espécies na média da comunidade e na variação da altura das plantas vegetativas. (A) Média da comunidade. (B) Variação na altura vegetativa da planta. (+PH/-PH) para a história da planta, (+SH/-SH) para a história do solo. A variação da altura da planta (CV) é mostrada por subunidade. As linhas tracejadas representam não significativas, as linhas sólidas representam efeitos significativos na diversidade das plantas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1 Comunidades de plantas no experimento JenaTron. Monoculturas de todas as espécies vegetais selecionadas (n = 6); Misturas de 2 espécies (n = 9); Misturas de 3 espécies (n = 7), todas com composições diferentes; e duas réplicas idênticas da mistura de 6 espécies (n = 2). Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar 1: Altura média da planta da espécie. Altura média das plantas nas parcelas (A) JenaTron Experiment (julho de 2022) e no campo (B) TBE (julho de 2012). Apenas os dados do tratamento com história de plantas e história de solo foram incluídos no painel A. Existe uma correlação significativa entre a altura das plantas no experimento JenaTron e as parcelas de campo (correlação de Pearson r (49) = 0,45, p = 0,0008). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Efeitos dos tratamentos de história de plantas e solo na altura vegetativa das plantas (cm) das seis espécies de plantas em diferentes níveis de diversidade de plantas (SR). Os símbolos de legenda +PH e -PH representam tratamentos com e sem histórico de plantas, enquanto +SH e -SH significam tratamentos com e sem histórico de solo, respectivamente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 1: A ANOVA resulta de modelos lineares de efeitos mistos que avaliam os efeitos da diversidade de plantas (riqueza de espécies, SR), histórico do solo (SH) e histórico de plantas (PH) na altura das plantas, tanto no nível da espécie quanto no nível da parcela. Os valores F e p são relatados para cada termo. Nota: numDF e denDF representam o numerador e os graus de liberdade do denominador para cada termo modelo. Valores de p < 0,05 sugerem um efeito estatisticamente significativo na altura da planta. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Medições acima e abaixo do solo, variáveis de resposta e métodos. Um espectro de medições acima e abaixo do solo, variáveis de resposta e métodos conduzidos no Experimento JenaTron para estudar os efeitos independentes e interativos da história da planta e da história do solo nas relações BEF para os ecossistemas como um todo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Com o Experimento JenaTron, fornecemos uma abordagem experimental complementar ao local de campo do Experimento Jena32,33 para aprimorar nossa compreensão mecanicista das relações BEF. O Experimento de Campo nos permite estudar os efeitos de longo prazo da história do solo e da história das plantas no funcionamento do ecossistema sob condições ambientais realistas, com parcelas grandes e não perturbadas permitindo medições repetidas ao longo de muitos anos. As combinações selecionadas aleatoriamente de espécies de plantas de um grande conjunto de espécies ao longo de um gradiente de diversidade de plantas bem estabelecido de monoculturas de até 60 espécies ajudam a identificar os efeitos da diversidade, excluindo os efeitos específicos da espécie tanto quanto possível32,33. No entanto, o Experimento de Campo, referindo-se aqui explicitamente ao 'Experimento ΔBEF' como parte do Experimento Jena (para mais detalhes, consulte Vogel et al. (2019)29), é limitado na investigação da história do solo e da história das plantas completamente independentes uma da outra e de influências potenciais de vários fatores externos, como flutuações climáticas, distúrbios naturais e interações com outros organismos29. Neste ponto, a abordagem complementar do uso de experimentos Ecotron entra no foco da pesquisa do BEF. Os experimentos Ecotron representam um elo importante entre experimentos de microcosmo de pequena escala e curto prazo, que estudam apenas algumas ou mesmo apenas uma única espécie e, assim, reduzem a alta complexidade dos experimentos de campo ou mesmo do mundo real 34,38. Portanto, o principal objetivo dos experimentos Ecotron não é imitar toda a complexidade da natureza, mas sim criar ecossistemas simplificados, mas biologicamente significativos. Isso permite entender melhor muitos, mas é claro que não todos, processos e interações biológicas que ocorrem no mundo real34,37. Além disso, os sistemas fechados de um Ecotron permitem estudar fluxos e processos, que muitas vezes não podem ser facilmente estudados em campo35.

Várias modificações da técnica experimental foram utilizadas em estudos anteriores, ressaltando a adaptabilidade significativa da instalação iDiv Ecotron. Por exemplo, o experimento "Insect Armageddon"44, realizado em 2018, envolveu uma reconfiguração das EcoUnits removendo as paredes internas acima do solo e a dissecção abaixo do solo com cilindros de aço. Em vez disso, os recipientes subterrâneos foram totalmente preenchidos com uma mistura de solo e areia, facilitando o estabelecimento de comunidades de pastagens compostas por 12 espécies de plantas europeias em uma área de superfície do solo de 1,5 m2 por EcoUnit. Este projeto experimental permitiu a introdução de dois níveis distintos de abundância de invertebrados acima do solo, permitindo que os pesquisadores investigassem os impactos do declínio da biomassa de invertebrados nas funções e serviços ecossistêmicos nos ecossistemas de pastagens da Europa Central. Outro exemplo ilustrativo é o experimento "EcoLux", realizado em 2020, que demonstrou uma modificação no regime de luz para investigar os efeitos da poluição luminosa à noite na diversidade e desempenho das plantas45 , bem como sua influência nas comunidades e funções do solo46. Olhando para o futuro, o potencial para novas modificações permanece substancial. O próximo experimento "ResCUE", programado para 2026, visa examinar as relações entre a diversidade de plantas e a estabilidade do ecossistema sob extremos climáticos26. Este experimento implementará uma seca quente padronizada, uma condição ambiental difícil de replicar em ambientes naturais, simulando a precipitação reduzida ao lado do aumento das temperaturas em um gradiente de diversidade de plantas de pastagem estabelecido no iDiv Ecotron. O estudo se concentrará na avaliação da resistência e recuperação de múltiplas funções do ecossistema em resposta ao evento climático extremo controlado26.

No entanto, o uso das instalações do Ecotron para fazer a ponte entre experimentos de campo e experimentos de microcosmo em pequena escala também acarreta limitações, como principalmente uma escala espacial ainda relativamente pequena, um baixo número de réplicas, menor complexidade biológica e a falta de representação da variabilidade climática natural37. Além disso, a instalação iDiv Ecotron não pode simular todos os tipos de cenários climáticos, como invernos, limitando sua capacidade de estudar plantas individuais em um ciclo anual realista ao longo de várias gerações. Portanto, como mencionado anteriormente, é muito importante considerar os estudos Ecotron como abordagens de pesquisa complementares que devem, em última análise, ser consideradas em combinação com os resultados de outras abordagens experimentais37. No entanto, a instalação iDiv Ecotron nos oferece a oportunidade única de estudar monólitos de solo intactos sob condições ambientais controladas, cruzar ortogonalmente plantas com diferentes histórias específicas da comunidade de plantas com solos com diferentes histórias específicas da comunidade de plantas e estudar seus efeitos no funcionamento do ecossistema ao longo de um gradiente de diversidade de plantas, o que é difícil de alcançar em condições de campo23, 35. Além disso, a técnica permite estudar as plantas como um todo, tanto acima quanto abaixo do solo, sob condições ambientais controladas, o que não é facilmente alcançável no campo. Por fim, no Experimento JenaTron, as comunidades de plantas plantadas (em vez de semeadas) foram estabelecidas para garantir densidades totais de plantas iguais, com cada espécie representada em proporções iguais. Em contraste, em comunidades semeadas, as espécies geralmente se estabelecem em taxas diferentes, e algumas espécies-alvo podem falhar completamente em se estabelecer ou podem permanecer em abundância muito baixa.

Para garantir a reprodutibilidade do protocolo apresentado, várias etapas críticas devem ser meticulosamente consideradas durante a execução: (1) Escavação de monólitos de solo: Uma das principais vantagens da instalação iDiv Ecotron é sua capacidade de estabelecer um número substancial de réplicas de monólitos de solo intactos sob condições ambientais controladas. Para garantir a integridade dos monólitos do solo, é essencial manter as condições ideais de campo para a extração do monólito do solo. Especificamente, a umidade excessiva do solo pode levar à compactação da coluna de solo, enquanto solos muito secos ou congelados podem resultar na formação de rachaduras. Nos casos em que o monólito é comprometido devido a esses fatores, ele deve ser descartado, necessitando de uma repetição do processo de escavação. (2) Seleção de espécies: O protocolo descrito usa seis espécies de plantas de pastagem do TBE, que foram selecionadas com base na sobreposição com o experimento principal, uma representação equilibrada de gramíneas e forbes e a possibilidade de estudar diferentes estratégias de uso de recursos (por exemplo, fenologia de plantas)41. Para um experimento de biodiversidade, seis espécies são um número baixo de espécies, e a seleção de outras espécies que possuem outras combinações de características pode levar a diferentes resultados experimentais e deve ser cuidadosamente considerada. (3) Densidade de plantas e proporções iguais de todas as espécies: Uma vantagem notável da configuração do Experimento JenaTron é que as comunidades de plantas são estabelecidas com densidades totais de plantas iguais e que cada espécie é representada com o mesmo número de indivíduos. Garantir densidade consistente de plantas e proporções iguais de plantio é crucial para a reprodutibilidade experimental, pois evita efeitos de confusão associados a um estabelecimento diferencial de espécies individuais. Portanto, o controle preciso da densidade de plantas é essencial para preservar o planejamento experimental e garantir resultados confiáveis.

Depois de iniciar o Experimento JenaTron seguindo o protocolo com ênfase especial em considerar as etapas mais críticas mencionadas, surgiram rapidamente efeitos discerníveis do tratamento na altura, cor e tempo de floração da comunidade de plantas. Análises comparativas subsequentes das alturas de plantas vegetativas específicas da espécie entre JenaTron e TBE confirmaram claramente que as comunidades estabelecidas no iDiv Ecotron realmente se assemelham às comunidades originais no campo. Para fornecer ainda mais um estudo de caso para análise de dados, analisamos a altura da planta vegetativa no experimento JenaTron com mais detalhes. As análises das alturas das plantas vegetativas específicas da espécie no JenaTron confirmaram o estabelecimento bem-sucedido de todas as espécies-alvo e revelaram diferenças significativas entre as espécies e grupos funcionais. Este resultado é esperado, pois as gramíneas são conhecidas por crescerem mais altas do que outros grupos funcionais no ExperimentoJena 47. Um efeito positivo significativo da história do solo foi detectado em todas as espécies, indicando que as condições anteriores do solo moldam o crescimento das plantas no Ecotron, potencialmente impulsionado por efeitos de feedback positivo de solos que anteriormente abrigavam uma comunidade de plantas (independente do nível de diversidade) e feedback negativo de solos mantidos livres de vegetação. As propriedades bióticas e abióticas das histórias do solo parecem diferir, dando às plantas em solos com histórico específico da comunidade de plantas uma vantagem sobre as plantas em solos sem essa respectiva história, pois a altura da planta desempenha um papel importante em sua capacidade de competir por luz e, portanto, é uma característica vital para o ganho de carbono48. Em contraste, não foi encontrado nenhum efeito significativo da história vegetal específica da comunidade de plantas na altura vegetativa média, o que implica que as propriedades do solo podem ter uma influência mais forte do que as fontes de sementes nas condições ambientais do Ecotron. No entanto, essa hipótese precisa ser testada de forma holística, investigando a multiplicidade de funções do ecossistema que foram medidas no Experimento JenaTron.

Nem as análises específicas da espécie nem da comunidade forneceram evidências de que a riqueza de espécies afeta a altura média das plantas vegetativas, contrastando com descobertas anteriores do Experimento de Campo, onde a altura das plantas aumentou com espécies mais altas49 provavelmente devido à competição de luz mais forte47,50. Uma maior complementaridade entre espécies em comunidades mais diversas pode levar a densidades de plantas mais altas51, potencialmente aumentando adicionalmente o crescimento da altura das plantas52. A falta de efeitos da diversidade de plantas na altura das plantas no Experimento JenaTron pode, portanto, ser devido à ausência de variação dependente da biodiversidade na densidade das plantas, indicando a importância potencial desse mecanismo para o desempenho individual da planta dependente da diversidade no mundo real52. No entanto, a riqueza de espécies teve um efeito significativo na altura da planta CV, sugerindo que a diversidade de plantas aumenta a complexidade estrutural da vegetação, consistente com estudos que ligam a diversidade a copas acima do solo mais complexas 49,50,52,53,54.

Tomados em conjunto, os resultados confirmam o estabelecimento bem-sucedido dos tratamentos-alvo do Experimento JenaTron, fornecendo os primeiros insights sobre a eficácia de nossa abordagem por meio da rápida manifestação de efeitos significativos do tratamento (Figura 3, Figura 4 e Figura 5). Além disso, a análise comparativa da altura das plantas vegetativas específicas da espécie indica que as comunidades recém-estabelecidas no iDiv Ecotron realmente se assemelham às observações de campo originais. A análise detalhada da altura da planta vegetativa serve como um estudo de caso para análise de dados e visualização de variáveis de resposta única. No entanto, este estudo de caso destaca as limitações de focar em uma única variável de resposta ao abordar de forma holística a hipótese abrangente, se o fortalecimento da relação entre a biodiversidade e o funcionamento do ecossistema ao longo do tempo se deve à história do solo, à história das plantas ou a uma combinação de ambas. Isso ressalta a importância de nossa abordagem altamente colaborativa para investigar os efeitos independentes e interativos da história da planta e do solo nas relações BEF23. Onze subprojetos da Unidade de Pesquisa Experimental de Jena (FOR 5000) trabalharam juntos no Experimento JenaTron, medindo uma ampla gama de variáveis de resposta em várias áreas de pesquisa, como microbiologia, ecologia química, fenologia, sensoriamento proximal, genética, epigenética, ecologia do solo e modelagem da teia alimentar. Este esforço integrativo visa (1) separar os efeitos da história das plantas dos efeitos da história do solo em vários níveis tróficos e funções do ecossistema, (2) investigar os efeitos específicos das espécies de plantas e específicos da interação em todos os níveis de riqueza de espécies de plantas e (3) explorar os mecanismos subjacentes das relações BEF23 (Tabela Suplementar 249, 50,55,56,57,58 ,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,
73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84).

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecimentos excepcionais vão para L. Boockmann, T. Meier, N. Naderi e L.-M. Walter por seu apoio como assistentes de pesquisa durante toda a duração do Experimento JenaTron. Muito obrigado a todos os funcionários da Umwelt-Geräte-Technik GmbH (UGT) por sua cooperação profissional e calorosa durante a escavação do monólito de solo no Experimento Jena. Gostaríamos também de agradecer a C. Lauterwasser, H.-C. Schulz e R. Widuwils por apoiar a UGT na escavação de monólitos de solo. Muito obrigado à equipe técnica do Jena Experiment S. Eismann, F. Freter, G. Kratzsch, U. Köber, K. Kunze e H. Scheffler por seu apoio no campo e sua ajuda diligente durante a campanha de plantio no iDiv Ecotron. Somos gratos a I. Merbach e à equipe técnica da Estação de Pesquisa do Centro Helmholtz de Pesquisa Ambiental (UFZ) em Bad Lauchstädt, especialmente a O. Bednorz e K. Kirsch, por seu apoio vital. Queremos agradecer a A.Q. Barth e R. Altmann por sua excelente colaboração na estufa iDiv. Muito obrigado a S. Haenzel, A. Lochner e A. Zeuner por sua ajuda indispensável na administração, organização e trabalho de laboratório. Agradecemos aos Mercator Fellows J. Cavender-Bares, F. Isbell, L. Mommer e K. Mueller, bem como ao colaborador próximo B. Schmid e aos investigadores principais U. Brose, H. Schielzeth, N. van Dam, W.W. Weisser, C. Wirth e J. Wolf por sua importante contribuição para a concepção, projeto e realização do Experimento JenaTron. Finalmente, agradecemos à Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) pelo apoio financeiro (FOR 5000), bem como ao Centro Alemão de Pesquisa Integrativa em Biodiversidade (iDiv, financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa [DFG-FZT 118, 202548816]), à Universidade de Leipzig, à Universidade Friedrich Schiller Jena e ao Instituto Max Planck de Biogeoquímica Jena pelo apoio financeiro e logístico.

Materiais

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