Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

Resumo

Este vídeo demonstra nova cultura, um método pelo qual embriões de galinha são cultivadas fora do ovo por até 24 horas. Este método permite o estudo do desenvolvimento inicial (linha primitiva para 14 som.), Um período correspondente ao E7-9 no mouse. Aplicações desta técnica incluem eletroporação, hibridização in situ e imunohistoquímica.

Resumo

O embrião de galinha é uma ferramenta valiosa no estudo do desenvolvimento embrionário precoce. Sua transparência, acessibilidade e facilidade de manipulação, torná-lo uma ferramenta ideal para estudar a formação e padronização do cérebro, tubo neural somito, e primórdios do coração. Aplicações da cultura de embriões de pintos incluem eletroporação de construções de DNA ou RNA, a fim de analisar a função do gene, os enxertos de contas do fator de crescimento revestido como FGFs e BMPs, bem como montar toda a hibridização in situ e imunohistoquímica. Este vídeo demonstra as diferentes etapas na cultura embrião de galinha; Primeiro, o embrião é explantes em solução salina. Então, o embrião é centrada em um anel de vidro. Membranas que envolvem o embrião são levantadas ao longo das paredes do anel. O anel é então colocada em um prato de cultura contendo um pool de albumina. O prato cultura é lacrado e colocado em uma câmara úmida, onde o embrião é cultivado por até 24 hrs. Finalmente, o embrião é removido do anel, fixadas e processadas para outras aplicações. Um guia resolução de problemas também é apresentada.

Protocolo

Parte 1: Banco configurar

1. A câmara úmida é preparado colocando Kimwipe / DDH ₂ O na câmara de plástico.
2. Um tubo de Falcon para coletar albumina, pratos para a cultura, anéis, vidro de relógio e eliminação de resíduos são colocados no banco.
3. Pirex é preenchido com solução salina 1,4 l (ver notas [a]).

Parte 2: Embrião é explantes em solução salina

1. Os ovos são retirados da incubadora após 16 horas (estágio 4). O ovo é opene tocando no shell com uma pinça. Shell peças são removidas.
2. A albumina fina é coletado em tubo de Falcon. A albumina espessa é retirado com uma pinça.
3. O embrião é colocado em um prato de plástico dentro do prato salina. A albumina restante é retirado com uma pinça.

Parte 3: Embrião é centrada no anel

1. O saco vitelino é inclinado com uma pinça, para que embrião voltado para cima.
2. O saco vitelino é cortado ao nível do equador ou abaixo.
3. Utilizando uma pinça fina, a membrana vitelina é rapidamente descascados. A membrana vitelina é orientado de forma que seu lado granular (shinny não) virado para cima.
4. Utilizando uma pinça fina, a membrana vitelina é colocado no vidro de relógio.
5. Utilizando uma pinça fina, um anel de vidro é aplicado em cima da membrana vitelina e embrião é centralizado.
6. A membrana vitelina é levantada em torno das bordas do anel de vidro. O conjunto é removido do prato salina.

Parte 4: A cultura está configurado sob microscópio

1. A membrana vitelina é levantada sobre o anel de vidro usando uma pinça fina ao microscópio.
2. Usando uma pipeta Pasteur, a solução salina é removido da borda externa do anel.
3. Com uma tesoura fina, membrana vitelina excesso é removido a partir da borda interna do anel de vidro. Cuidado é tomado para não perfurar a membrana com pipeta ou fórceps.
4. O embrião é gentilmente lavada com solução salina para remover membranas e células soltas gema.
5. 200 mL solução salina é adicionada à borda externa do anel (o que facilitará depois de transferência).
6. O conjunto é coberto com um prato de plástico invertido.

Parte 5: A cultura é transferido para incubadora

1. A placa de cultura Falcon é rotulado.
2. 2,5 ml de albumina fina é adicionado ao fundo do prato Falcon.
3. 200μl de albumina fina é adicionado à borda interna da tampa do prato Falcon.
4. O prato invertido é retirado da montagem.
5. Utilizando uma pinça fina, o anel de vidro é slided ao longo da borda do vidro de relógio, e transferido para o prato Falcon.
6. Todos os salina restante é removido da superfície interna do anel.
7. O prato Falcon é coberta com tampa e selada.
8. O conjunto é colocado em câmara úmida e, em seguida, na incubadora.
9. Os embriões são cultivados por até 24 horas a 38 ° C.

Parte 6: Após a cultura, o embrião é fixo, a cultura é transferido para incubadora

1. Um prato cheio de fixação é gelada PBS (PBS ou DEPC-se os embriões devem ser tratados para hibridização in situ).
2. A cultura é removida da incubadora e imediatamente colocado no gelo. A placa de cultura é imediatamente preenchida com gelado PBS / DEPC-PBS.
3. O embrião é separado da membrana vitelina. O embrião é transferido para o prato de fixação, utilizando-se o fim brusco de uma pipeta Pasteur.
4. O embrião é preso usando ponta e uma pinça fina. A PBS cobrindo o prato de fixação seja removido. Fixador é adicionado (ver notas [b]).
5. Dependendo da aplicação, o embrião é fixada por 6-8 horas a 4 ° C (criostato), S / N, 4 ° C (em situs), ou 1 hora em temperatura ambiente por imuno-histoquímica montar todo.
6. O fixador é removido e substituído com gelado PBS / PBS DEPC.
7. Para aplicações a jusante, como a hibridização in situ ou coloração immantibody: o sistema nervoso eo coração são perfurados com uma agulha de ponta romba microcapilar ou uma faca microdissecção, o que irá evitar aprisionamento de sonda / anticorpo em etapas posteriores.
   
   Notas: [a] Saline consiste em: Uma solução (para 1 l): 121,0 g NaCl, KCl 15,5 g, 10,4 g CaCl ₂ .2 H ₂ O, 12,7 g MgCl ₂ .6 H ₂ O; solução B (para 1 l) : 2,4 g Na ₂ HPO ₄ .2 H ₂ O, 0,2 g NaH ₂ PO ₄ .2 H ₂ O; Autoclave; Antes de usar, misturar 120 ml A com 2700 ml H ₂ O; Adicione 180 ml ​​B. Mix [1]; [b] Fixação é preparado imediatamente antes de usar (PFA 4% em PBS ou DEPC-PBS no situs).

Parte 7: Resultados Representante

Antes da cultura, o embrião está no estágio linha primitiva (HH4). No final do período de cultivo, o embrião tem desenvolvido para HH10 (comprimento 2-3 mm) e é visível no centro do prato cultura. É possível rotular um grupo de células com carbocyanine DII fluorescentespouco antes de cultura (0h) e seguir o seu movimento durante o período de cultura. Neste caso, as células abaixo do nó de Hensen (HN) foram marcados com DII. Estas células são mostrados para contribuir para somitos progressivamente em desenvolvimento (som) e notocorda (n).

Parte 8: Resolução de problemas

Problema	Causa	Remédio
Embrião permanece com a gema em vez de vir fora com membrana (etapa 2)	A má qualidade do ovo	Pedido recém-produzido os ovos, ovos de loja a 13 ° C após o recebimento. Incubar os ovos no mesmo dia como data de chegada.
Vitelínico deslize membrana longe de seguir relojoeiro vidro colocação de anel (passo 3)	Restos de albumina	No passo 2, certifique-se que todos os albumina é removido puxando-o longe de membrana com uma pinça inclinado
Embrião é inacessível: encontra-se abaixo da membrana (passo 4)	Lado errado da membrana é para cima	No passo 3, verifique se o lado da membrana que contêm grânulos da gema é voltado para cima. O lado brilhante, polido deve ficar voltada para baixo.
Embrião submerso em soro fisiológico / albumina cultura seguinte (passo 6)	Furo na membrana; soro fisiológico / albumina deixados no interior do anel antes da cultura	No passo 5, certifique-se que todos os albumina / salina é removido de dentro do anel; Na etapa 4, verifique se você não furar membrana com uma pinça (utilize uma pinça blunt terminou)
Embrião se desintegrou após a cultura	Infecção bacteriana	Esterilizar todos os instrumentos e suas obras, uso de antibiótico / antimicótico

Discussão

O método de cultura de Nova ² pode ser usado para uma ampla variedade de aplicações, que vão desde enxertos do fator de crescimento contendo grânulos ^3, para montar toda a hibridização in situ e imunohistoquímica montar todo ^4. Cultura ao longo de um período de 24 horas permite o acompanhamento contínuo do desenvolvimento embrionário em aplicações como o tempo de análise do movimento lapso célula ⁵ ou monitoramento de GFP contendo construções electroporated ^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs	Animal	Charles River Laboratories	Premium Fertile
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator	Tool	Lyon	RX
Hybridization Incubator	Tool	Robbins Scientific, SciGene	M1000
Pyrex dish (2)	Tool
Watchmaker’s glass 50mm	Tool	VWR international	66112-060
Glass rings	Tool	Physical Plant facility		cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)	Surgery	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Surgery	Fine Science Tools	11002-13	blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas	Surgery	Electron Microscopy Sciences	62082-00
Fine scissors	Surgery	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Microcapillary tube	Surgery	Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife	Surgery	Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam	Surgery	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave