Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

Resumo

Este é um guia para modificar a forma de micropipetas de vidro. Especificamente, usando calor e pressão de ar do cone é alargado, sem aumentar a abertura da ponta, levando a menor resistência da pipeta. Isto é fundamental para obter gravações de baixo ruído de pequenas células, mas é útil em muitas aplicações.

Resumo

Pressão polimento é um método para moldar pipetas de vidro para patch-clamp gravação. Nós desenvolvido pela primeira vez este método para a fabricação de pipetas adequado para a gravação de pequenos (<3 m) corpos celulares neuronais. O princípio básico é semelhante ao vidro soprado e combina a pressão do ar e calor para modificar a forma de pipetas de patch preparado por um puxador de micropipeta convencionais. Ela pode ser aplicada aos chamados moles (soda de limão) e rígido (borosilicato) óculos. Polimento de pressão de modo geral, pode reduzir a resistência da pipeta em 25%, sem diminuir o diâmetro de uma abertura (Goodman e Lockery, 2000). Pode ser aplicada a praticamente qualquer tipo de vidro e requer apenas a adição de uma válvula de alta pressão e encaixe a um microforge. Esta técnica é essencial para a gravação a partir de células ultrasmall (<5 m) e também pode melhorar a gravação de um único canal, minimizando a resistência da pipeta. A forma nua e crua é também útil para perfurada-patch clamp gravação uma vez que este resultados ponta forma em uma bolha maior membrana disponíveis para a perfuração.

Protocolo

Pipetas puxando

Usando um filamento como um extrator Sutter P-97 Flaming Puller microeletrodos / Brown, puxe um conjunto de aproximadamente 10-20 pipetas.

1. Selecione seu vidro. Usamos borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Armazenar o vidro com cuidado para que ele permaneça limpo e livre de poeira.
2. Conceber um programa de puxar. O principal objetivo é uma dica de abertura aproximadamente o tamanho desejado, que dependerá da aplicação. P-97 Sutter Cookbook Pipetar ² é uma excelente referência.
3. Observe o seu pipetas sob um microscópio para determinar o diâmetro de abertura e suavidade. Descartar áspera, dicas irregular, ou irregular. Para a gravação normal patch-clamp, uma abertura que é de 2-4 mM todo é melhor. A ponta romba leva a menor resistência para o diâmetro mesma abertura, que é o preferido. Forma e tamanho pode ser modificado durante o polimento, abaixo.

Polimento pipetas pressão

1. Anexar um suporte para uma pipeta, comprimido limpo linha de ar. Usando um regulador, definir a linha de ar comprimido a pressão para ~ 40 PSI. Conecte a linha de ar comprimido para uma válvula de controle de 4 vias que permitirá que a pressão titular pipeta a ser ligado e desligado. Conectar um titular pipeta para a válvula de controle com um comprimento de ⅛ em Tygon ® tubulação.
2. Use um equipamento de polimento (microforge) com um suporte de pipeta de alta pressão, uma bobina de polimento controlada por um pé-pedal, um microscópio equipado com uma ampliação baixa e alta, longa distância de trabalho (idealmente, 10x e 100x) ar objetivos. É fundamental ser capaz de observar a abertura da pipeta durante o protocolo.
3. Opcional: Brasão da pipeta com um isolador hidrofóbicos para diminuir a capacitância e melhorar as características de ruído (consulte "pipetas Puxando" para esta técnica).
4. Verifique se a válvula de pressão está na posição off. Coloque uma pipeta no suporte de pipetas e aperte o encaixe para os dedos.
   
   Nota de segurança: Se a pipeta é mantido firmemente no suporte pipeta, a pressão do ar fará com que a pipeta para ser ejetado do titular da pipeta.
   
   
5. Coloque a pipeta e titular no microforge. Titular posição da pipeta para o palco microscópio para que tanto a ponta da bobina e polimento são visíveis em potência (10x) baixa na microforge. Traga a ponta ~ 75 microns do filamento. Tenha em mente que o filamento se expande quando aquecida.
6. Mude para a alta potência objetivas (100x). Tanto a ponta da pipeta e da bobina de polimento deve estar em foco e no campo de visão. Se não, ajuste a altura da bobina de polimento. (Posição A pipeta não pode ser ajustado). A ponta da pipeta e bobina de polimento deve ser perto de lados opostos do campo de visão. Evite posicionar a bobina muito perto da ponta da pipeta porque vai expandir, uma vez que aquece e chocar-se com a pipeta.
7. Gire a válvula para direcionar o ar pressurizado para a pipeta, e aquecer a ponta da pipeta até o cone atrás da ponta começa a balão para fora.
8. Parar o aquecimento antes da ponta balões também extensivamente. A experimentação é necessária para determinar a distância apropriada, calor e tempo para a forma desejada.
9. Opcional: Reduza o diâmetro de abertura ponta a ponta por polimento, na ausência de pressão. As etapas 7 e 8 pode repetir para ajustar tanto a forma e as dimensões da ponta da pipeta.
10. Desligue a pressão e ao mesmo tempo apontando a ponta da pipeta para uma direção segura, retire a pipeta e colocá-lo em uma caixa de armazenamento limpa onde será protegido de poeira.
    
    Nota de segurança: Se a pressão do ar não é desligado, a pipeta pode ser expulso do titular pipeta durante a remoção.

Notas sobre a microforge

Nós usamos um microforge montado a partir de off-the-shelf componentes disponíveis comercialmente. (Você também pode comprar um kit de pressão de polimento de algumas empresas, por exemplo, ALA Ciência, GlassWorx). Independentemente do microforge, é essencial ter ótica que são bons o suficiente para ver a abertura da ponta, que é muitas vezes apenas alguns mM de diâmetro. Nós usamos uma lente de longa distância de trabalho 100x para esta finalidade. Além disso, o revestimento da bobina polimento com alta temperatura de fusão de vidro, a fim de minimizar a deposição de metal vaporizado sobre as pipetas.

Parte 3: Resultados Previstos

Polimento pressão moderada pode reduzir a resistência de uma pipeta sem uma alteração significativa na abertura de diâmetro. Se desejar, este protocolo pode ser usado para fazer pipetas com sub-micron aberturas e resistências entre 5-10MΩ.

Discussão

Nós originalmente desenvolvido este método para fazer pipetas útil para patch-clamp gravação 2-3 neurônios M em C. elegans ^1. Ele está em uso rotineiro no laboratório Goodman. Nós pipetas pressão polonês não só para a gravação de pequenos C. neurônios elegans, mas também para a obtenção de macropatch e single-channel gravações de canais iônicos expressos em oócitos Xenopus. Para um determinado diâmetro da ponta-abertura, a forma contundente produz uma pipeta de menor resistência...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve