Fonte: Vy M. Dong e Diane Le, Departamento de Química da Universidade da Califórnia, Irvine, CA
A síntese em fase sólida de Merrifield é uma invenção vencedora do Prêmio Nobel onde uma molécula reagente é ligada a um suporte sólido e sofre sucessivas reações químicas para formar um composto desejado. Quando as moléculas estão ligadas a um suporte sólido, reagentes e subprodutos em excesso podem ser removidos lavando as impurezas, enquanto o composto alvo permanece ligado à resina. Especificamente, mostraremos um exemplo de síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS) para demonstrar esse conceito.
Procedimento
1. Carregando a resina
Para um vaso de síntese de peptídeos de 100mL, adicione resina de cloreto de clororitil (CTC) de 2ml (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0,400 mmol). Adicione 20 mL DMF e deixe-os inchar por 30 minutos sob N2.
Escorra as contas sob vácuo e adicione 10 mL DMF.
Adicione 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr2EtN, e misture sob N2 por 15 min.
Escorra o solvente sob vácuo e repita o carregamento com Fmoc-Ala-OH por 15 min.
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Resultados
Resultados representativos para a síntese de peptídeos de fase sólida para o Procedimento 3.
Etapa do procedimento
Cor da solução
3.1
Controle - Amarelo claro e claro Reação – Amarelo claro e claro
3.2
Controle - Amarelo claro e claro Reação – Azul escuro
3.3
Solução azul escuro, azul das contas – ...
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Aplicação e Resumo
Neste experimento, demonstramos um exemplo de síntese em fase sólida via SPPS através da síntese de um dipeptídeo.
A síntese em fase sólida é amplamente utilizada na química combinatória para construir bibliotecas de compostos para triagem rápida. Tem sido comumente usado para sintetizar peptídeos, oligossacarídeos e ácidos nucleicos. Além disso, esse conceito foi implementado na síntese química. Por ser heterogêneo, esses reagentes de suporte sólido podem muitas vezes ser r...
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Para um vaso de síntese de peptídeos de 100mL, adicione resina de cloreto de clororitil (CTC) de 2ml (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0,400 mmol). Adicione 20 mL DMF e deixe-os inchar por 30 minutos sob N2.
Escorra as contas sob vácuo e adicione 10 mL DMF.
Adicione 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr2EtN, e misture sob N2 por 15 min.
Escorra o solvente sob vácuo e repita o carregamento com Fmoc-Ala-OH por 15 min.
Escorra o solvente sob vácuo e lave as contas com 10 mL DMFunder N2, e escorra sob vácuo 3x.
2. Desproteção do Grupo Fmoc
Adicione 10 mL 20% 4-metilpiperidina em DMF e mexa as contas sob N2 por 15 minutos.
Escorra o solvente sob vácuo e repita a desproteção.
Lave as contas com 10 mL DMF sob n2 e escorra sob vácuo 3x.
3. Realizando o Teste Kaiser
Realize o teste Kaiser adicionando 1-2 gotas de solução A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL pyridine), solução B (1 g ninhydrin, 20 mL n-butanol) e solução C (20 g de fenol, 10 mL n-butanol) cada um em dois tubos de teste. Um tubo de ensaio será o controle, enquanto o outro monitorará a reação.
Adicione algumas contas da resina do vaso de reação ao tubo de ensaio de reação e aqueça os dois tubos de ensaio a 110 °C.
Se a desproteção estiver completa, o conteúdo do tubo de ensaio ficará uma cor azul/roxo escuro. Se a desproteção estiver incompleta ou falhar, a solução permanecerá amarela. Compare o tubo de ensaio de reação com o tubo de teste de controle.
4. Acoplamento dos próximos blocos de construção
Escorra o solvente sob vácuo.
Lave as contas com 10 mL N-metil-2-pyrrolidona sob n2 e escorra o solvente sob vácuo.
Para iniciar o próximo acoplamento, adicione 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), HBTU de 610 mg (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr2EtN, e deixe a resina borbulhar sob n2 por 30 minutos.
Escorra o solvente sob vácuo.
Lave as contas com 10 mL DMF sob n2 e escorra sob vácuo 3x.
Realize o teste Kaiser (ver etapas 3.1-3.3) para procurar a conclusão do acoplamento. As contas e a solução no tubo de ensaio devem ser amarelas.
5. Cleaving o Peptídeo Fora da Resina
Adoça o restante do grupo Fmoc utilizando as etapas 2.1-2.3.
Depois que o solvente for drenado sob vácuo, adicione 40 mL de solução de decote (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% TIPS) à resina e bolha sob N2 por 3h.
Coloque um novo frasco receptor no sintetizador de peptídeo e escorra a soluçãoTFA contendo o peptídeo desejado sob vácuo no novo frasco.
6. Precipitação e eu solação do Peptídeo
Separe a solução TFA em 4 frascos cônicos e adicione 25 mL de éter frio (−20 °C) a cada frasco para precipitar o peptídeo.
Centrifugar os frascos (3.000 rpm, 0-4 °C) por 20 min. Decante a solução tfa restante e éter dos frascos cônicos e concentre o peptídeo precipitado para pagar o dipeptídeo desejado como um sólido branco.
