O trabalho foi suportado pelo NIH concede AI57159 (para SCH) e AI72346 (para AMvO). SCH é um Howard Hughes Medical Institute.

Funcionalização lamínula de vidro A bicamada planar utilizada no ensaio de fusão é apoiada em um filme hidratado de dextran. Dextran atua como um espaçador entre a bicamada planar e superfície de vidro. Isso evita que componentes da membrana de tornar-se preso na superfície do vidro e também fornece espaço para que o conteúdo de uma partícula do vírus pode escapar após a fusão. Lamínulas de vidro são funcionalizados através de tratamento com um epóxi silano, o que nos permite quimicamente vínculo dextran ao vidro (Elender, et al. 1996). <ol><li> Organizar 25 lamínulas mm em um suporte de coloração de cerâmica, e coloque a cremalheira em uma jarra ou copo. </li><li> Encha o recipiente com uma solução a 10% do laboratório glassware detergente grau. Coloque o recipiente em um limpador ultra-sônico por 30 minutos. </li><li> Lavar o recipiente e rack lamínula com água deionizada, e reabastecer com hidróxido de postassium 1M. Devolver o recipiente para o banho sonicador por mais 30 minutos. </li><li> Repita este procedimento de limpeza utilizando acetona e etanol. </li><li> Lavar a coverlips em água e seco. </li><li> Por fim, limpe as lamelas com uma stripper plasma de oxigênio por três minutos. </li><li> A etapa de limpeza última oxida a superfície, fazendo com que o vidro uniformemente hidrofílicas e reativas nas etapas seguintes silanização. </li><li> Preparar uma solução 0,2% de 3-glycidoxypropyltrimethoxy silano em isopropanol. Mergulhe as lamelas nesta solução por cinco minutos. </li><li> Descartar a solução de silano e enxaguar os tempos lamínulas vários isopropanol. </li><li> As lamelas estão agora revestido com uma camada de silano, mas eles devem ser curada para permitir que o silano para unir covalentemente para o vidro. Coloque as lamelas em um forno definido como 80 graus Celsius durante uma hora. </li><li> Enquanto as lamelas são a cura, pesar dextran 500 e preparar uma solução de 30% w / v. Pré-aquecimento da água irá facilitar a dissolução. Nós vamos usar cerca de 1 ml desta solução por lamínula. Uma vez que o dextran se dissolveu, defoam a solução em um dessecador a vácuo. </li><li> Quando as lamelas silanizadas terminar de cura, removê-los do rack de cerâmica plana e organizá-los no interior de uma caixa de plástico congelador. Use uma pipeta de 1 ml para cobrir a superfície superior de cada lamela com ~ 1 ml da solução de dextran. Feche a caixa de freezer e deixe em um local tranquilo para 24-36 horas. </li><li> Ao segurar as lamelas com uma pinça de plástico, despeje o excesso de dextran e substituí-los no rack de cerâmica. Enxágüe os tempos lamínulas várias em água, e permitir que as lamelas de molho em água por 48 horas. O frasco pode ser agitado suavemente em um rotador de mesa. </li><li> Seca as lamelas em um forno definido como 80 graus Celsius e armazenar em um dessecador a vácuo. </li></ol> Preparação de lipossomas Bicamadas lipídicas suportados são formadas por adsorção lipossomas para uma lamela dextran funcionalizada. O adsorvido fusível lipossomas uns com os outros até rupturas da membrana e se espalha sobre a superfície plana. <ol><li> A formulação típica lipossomas usado no ensaio consiste em 1,2, dioleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DOFC), 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), o colesterol, o cérebro dos bovinos Disialoganglioside (GD 1a), e N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-phosphoethanolamine em uma proporção de 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Todos os componentes são armazenados em clorofórmio ou clorofórmio e soluções de metanol. </li><li> Prepare uma mistura contendo dois micromoles de lipídios através da transferência de volumes de cada componente em um tubo de ensaio de vidro. Evaporar o solvente sob um fluxo de argônio ou gás nitrogênio. Remover o solvente restante, deixando o tubo de ensaio num exsicador de vácuo por duas horas. </li><li> Ressuspender o filme lipídico seco em 400 microlitros de tampão HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Transferir a suspensão para um tubo de microcentrífuga de plástico. Congelar a suspensão em um banho de nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria quente. Repita este ciclo de congelamento / descongelamento quatro vezes. </li><li> Montar uma extrusora de lipídios com 100 nm de policarbonato filtro de membrana, e expulsar a suspensão lipídica 25 vezes. A suspensão deve aparecer para ser mais transparentes após a extrusão. </li><li> Lipossomas deve ser usado no dia em que são preparados. Eles podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ser usado. </li></ol> Preparação celular microfluídicos fluxo A célula de fluxo simples microfluídicos é feita por um sanduíche de fita dupla pau entre um slide de quartzo e uma lamela funcionalizada. <ol><li> Obter um slide 20x20x3 milímetros de quartzo. Use uma broca de diamante para furar dois furos 1 mm em lados opostos. </li><li> Corte um quadrado 20 milímetros de uma folha de fita dupla pau, e usando uma lâmina de barbear, cortar uma secção de 15 x 2 mm a partir do centro. </li><li> Descole um dos lados do suporte de fita, e aderir a fita para o quartslides z. Aderir o outro lado para uma lamela funcionalizada. </li><li> Corte dois comprimentos de 20 cm de tubo de polietileno e inseri-los nos furos na lâmina de quartzo. </li><li> Selar a célula de fluxo com cola epóxi 5 minutos. </li><li> Quando a cola tem cura, a célula principal de fluxo e tubo com tampão. </li><li> A bicamada lipídica suportados podem ser formadas nessa fase por cerca de 80 microlitros de desenho da suspensão de lipossomas para os canais. </li></ol> Rotulagem partícula do vírus <ol><li> H3N2 influenza A (X-31) é normalmente utilizado para o ensaio de fusão, mas outras cepas de gripe e outros vírus têm sido usadas com sucesso. </li><li> Vírus é rotulado com até dois diferentes corantes fluorescentes para permitir a detecção de hemifusão e pore-formação. </li><li> Dissolver sulforhodamine b (SRB) em tampão HNE para fazer uma solução 20 mM. Combine 20 microlitros da solução de corante com 10 microlitros da suspensão viral, e deixar em temperatura ambiente por 20 horas. Durante este período, a tintura vai lentamente se acumulam no interior das partículas de vírus. </li><li> Retire o excesso de corante, passando a suspensão de vírus através de uma coluna do PD-10 dessalinização. Se o material viral suficiente é usado, uma faixa colorida pode ser visto na coluna. Esta banda contém vírus identificados e podem ser coletados como é eluída. </li><li> Se nenhuma banda é visível, recolher 200 frações microlitro e determinar quais frações contêm vírus rotulados medindo 565 nm a absorção em um espectrofotômetro. O vírus deve eluir em um volume total de aproximadamente 0,8 ml. </li><li> Etiqueta do envelope viral, adicionando 13 microlitros de uma formamida 2 mM dimetil (DMF) solução de octadecil rodamina 110 (Rh110C18) para a suspensão de vírus SRB rotulados. </li><li> Agitar a suspensão, anexando o tubo de laboratório a um rotator e deixe por 3 horas. </li><li> Purificar o vírus de Rh110C18 em excesso com uma PD-10 coluna de dessalinização como descrito anteriormente. </li></ol> Configuração microscópio O experimento é realizado em um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de alta de imersão em óleo NA adequado para microscopia de fluorescência reflexão interna total. A 488 e 568 nm linhas de um argônio / gás krypton de laser são usados ​​para excitar o vírus Rh110C18 e SRB rotulados. Gravação simultânea de cada etiqueta é realizado através da divisão da emissão de fluorescência verde e vermelho com um espelho dicróico e independentemente focando as imagens em metades separadas de um elétron câmera CCD multiplicando. Realização do ensaio Execução do ensaio de fusão envolve uma montagem passo a passo dos componentes bioquímicos no interior da célula de fluxo: a montagem da bicamada lipídica planar, docking de partículas do vírus rotulados, revestimento da superfície com fluoresceína e início da reação com tampão de pH baixo (Figura 1A) . <ol><li> Monte o fluxo de células para o palco microscópio, e anexar a tubulação de saída para uma bomba de seringa definir a fluir a uma taxa de 40 microlitros por minuto. </li><li> Abrir os canais de fluxo de lipossomas excesso de fluxo em 300 microlitros de HNE. </li><li> O foco do microscópio e ajustar a potência do laser para iluminar a superfície com 350 W / cm 2 de 488 nm e luz 70 W / cm 2 de 568 nm de luz. Se você estiver usando uma 1,45 NA 60x objetivo de imersão em óleo, defina a intensidade do laser de 100 Watts e 20 Watts micro micro, respectivamente. </li><li> Bomba de vírus rotulados (diluído 1 / 100) em uma célula de fluxo. Como o vírus se difunde para a superfície inferior do canal de fluxo, as partículas começam a aderir ao gangliosídeo incorporados na bicamada lipídica. </li><li> Quando uma densidade adequada de partículas do vírus acoplado foi atingido (até cerca de 1000 partículas por campo de visão). Mudar a tubulação de entrada para uma solução contendo dois microgramas por mililitro estreptavidina fluoresceína rotulados. A estreptavidina marcada irá se ligar a moléculas lipídicas biotina acoplado na bicamada, e eventualmente um fundo verde escuro será visível. </li><li> Lave o canal de fluxo com 300 microlitros de HNE. </li><li> Escolha uma área de imagem, o foco do microscópio e preparar a câmara CCD de tempo decorrido de aquisição de imagem. Definir o tempo de exposição de 100 ms e recolher os quadros a uma taxa de 10 Hz. </li><li> Iniciado por fusão fluindo em um buffer de ácido contendo 10 mM citrato de sódio e 140 mM NaCl. O pH do tampão deve ser ajustada para ser abaixo do pH crítico do vírus sendo ensaiadas. X-31 fusíveis em pH abaixo de 5,5. </li></ol> Resultados representante A Figura 1B mostra instantâneos de bicamada virions acoplado antes e durante a fusão. Cada ponto de difração limitada representa uma partícula do vírus individual. Fluorescência vermelha e verde têm sido fotografado separadamente para as metades superior e inferior de uma câmera CCD, que permite a observação simultânea do envelope viral e etiquetas de conteúdo. Há tipicamente o dobro de pontos no canal verde em comparação como vermelho, e isso reflete a menor eficiência de rotulagem pelo corante de conteúdo em comparação com o rótulo de envelope. A fluorescência emitida fundo verde da superfície ligada fluoresceína desaparece após a chegada do tampão citrato e permite a determinação do horário de início da reação de fusão. Hemifusão eventos são detectados como rajadas de fluorescência verde como o Rh110C18 extinto no envelope viral difunde em todo o talo hemifusão e é diluída na membrana planar. Uma nuvem se expandindo para fora fluorescentes podem ser vistos em torno de partículas hemifused, demonstrando livre difusão do corante graxos-acil ligado na membrana planar. Formação de poros é observado como a decadência da fluorescência vermelha da SRB preso no interior das partículas virais. A abertura de um poro de fusão permite que o corante de escapar para o espaço aquosa abaixo da bicamada planar e fora da região de observação. Trajetórias intensidade de fluorescência para cada partícula, traçados a partir da intensidade integrada de partículas individuais, facilitar a determinação do rendimento e tempos de hemifusão e formação de poros (Fig. 1C). Horários dos eventos hemifusão e formação de poros são determinadas como o ponto em que a inclinação máxima de uma explosão Rh110C18 fluorescência ou deterioração do sinal SRB ocorre. Em uma experiência de sucesso, cerca de 50 por cento das partículas marcadas com sinais Rh110C18 rendimento dequenching, e 30 por cento das partículas SRB rotulados dar sinal utilizável. Das partículas marcadas com ambos os corantes, aproximadamente 10 por cento mostram sinais de ambos os lípidos formação de mistura e poros. Fig. 2A-C mostra a distribuição dos hemifusão e tempos de formação dos poros lag a partir de uma experiência típica. Fig.2D-F mostra distribuições caso de eventos combinados a partir de cinco experimentos realizados nas mesmas condições. Mesmo com um número modesto de observações, a forma dos histogramas é aparente. Porque cada experiência é sincronizado por detecção do tempo de queda do pH, as experiências múltiplas podem ser combinadas e informações detalhadas sobre a limitação de taxa passos intermediários podem ser obtidos. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="figura 1" /> Figura 1. Delineamento experimental. A) partículas de vírus são rotulados com dois corantes fluorescentes para monitorar a cinética de hemifusão e formação de poros de fusão. Fluorescência é coletada por uma objetiva de microscópio de alta NA e fotografada em um CCD. B) imagens de fluorescência antes (esquerda) e durante (direita) a fusão do indivíduo partículas virais. Metade superior e inferior de cada imagem corresponde à fluorescência vermelha e verde, respectivamente, da área de ~ 50 x 100 mm 2 mesmo da bicamada suportados. C) A intensidade de fluorescência do marcador vermelho SRB conteúdo viral (traço superior), o verde Rh110C18 membrana corante (traço médio), eo sensor de pH de fluoresceína (traço inferior) oferecem horários exatos decorrido entre a queda de pH, hemifusão, e de fusão. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Cinética de fusão do vírus fluorescente etiquetado. Distribuições do tempo decorrido entre a queda de pH e hemifusão (A, D) e formação de poros (B, E). A ascensão e decadência das distribuições indicam a presença de vários passos intermediários. A transição entre hemifusão e abertura de um poro de fusão para partículas individuais é distribuído exponencialmente, o que sugere um passo limitante da velocidade única. AC painéis mostram os resultados de uma experiência única. DF painéis são compilados a partir de cinco experimentos separados realizados nas mesmas condições. Por favor, <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Preparação de fluido e contínuo bicamadas lipídicas suportados pode ser um desafio. Traços de contaminação defeitos de material ou superfície vai evitar a propagação de bicamadas. Limpeza cuidadosa e deposição de uma camada uniforme de dextran são essenciais. Imagem prolongada de partículas do vírus podem lixívia as etiquetas fluorescentes ou levá-los a tornar-se desativado. Foto-dano deste tipo é bem conhecido na bio-imagem e campos única molécula e é acreditado geralme...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

Fusão de membrana é um passo essencial durante a entrada de vírus encapsulados dentro das células. Ensaios de fusão convencionais tipicamente relatório sobre um grande número de eventos de fusão, tornando-se difícil analisar quantitativamente a seqüência de passos moleculares envolvidos. Nós desenvolvemos uma in vitro, duas cores-ensaio de fluorescência para monitorar cinética de fusão única partículas do vírus com uma bicamada destino em um apoio essencialmente fluido. Partículas de gripe viral são incubados com um fluoróforo verde lipofílico para manchar a membrana e um fluoróforo vermelho hidrofílico para manchar o interior viral. Nós depositamos uma bicamada lipídica contendo gangliosídeo na superfície do vidro dextran-functionilized de uma célula de fluxo, incubar as partículas virais na bicamada planar e imagem da fluorescência de 100 x 100 mm 2 de área, contendo várias centenas de partículas, em um CCD câmera. Por imagem tanto a fluorescência vermelha e verde, podemos monitorar simultaneamente o comportamento do corante de membrana (verde) e do conteúdo aquoso (vermelho) das partículas. Após a redução do pH para um valor abaixo do pH de fusão, as partículas irão fundir com a membrana. Hemifusão, a fusão do folheto externo da membrana viral com o folheto externo da membrana-alvo, será visível como uma mudança súbita na fluorescência verde de uma partícula. Após a fusão subseqüente dos dois restantes folhetos distal de um poro será formado eo fluoróforo vermelho-emitting na partícula viral será lançado sob a membrana alvo. Este evento dará origem a uma diminuição da fluorescência vermelha de partículas individuais. Finalmente, a fluorescência integrada a partir de um fluoróforo pH-sensíveis que está incorporado na membrana-alvo relatórios sobre o momento exato da queda de pH. Do três-tempo de fluorescência traços, todos os eventos importantes (queda de pH, lipídios mistura no conteúdo hemifusão, misturando sobre a formação de poros) podem agora ser extraídas de uma maneira direta e para cada partícula individualmente. Coletando os tempos decorridos para várias transições para muitas partículas individuais em histogramas, podemos determinar a vida útil dos intermediários correspondentes. Mesmo intermediários ocultos que não têm um observáveis ​​direta fluorescentes podem ser visualizados directamente a partir destes histogramas.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Nós apresentamos um<em&gt; In vitro,</em&gt; Duas cores-ensaio de fluorescência para visualizar a fusão de partículas do vírus de solteiro com uma bicamada alvo fluido. Ao classificar partículas virais com fluoróforos que diferencialmente mancha a membrana viral e no seu interior, somos capazes de monitorar a cinética de hemifusão e formação de poros.

Método para Medição da Cinética de Fusão Viral no Nível única partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K visualizações.  Harvard Medical School. Nós apresentamos um In vitro, Duas cores-ensaio de fluorescência para visualizar a fusão de partículas do vírus de solteiro com uma bicamada alvo fluido. Ao classificar partículas virais com fluoróforos que diferencialmente mancha a membrana viral e no seu interior, somos capazes de monitorar a cinética de hemifusão e formação de poros.

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Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Análise de LINE-1 retrotransposição no Núcleo de nível único

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Administração simples e eficaz e visualização de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos usando injeção de rim

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...