Agradecemos ao Dr. T. Otis, Departamento de Neurobiologia, UCLA, para compartilhar as instalações TPLSM conosco, Dr. C. Fahlke, Instituto de Fisiologia, RWTH Aachen, Alemanha, para o tipo de doação o plasmídeo pEYFP-ClC1, eo Sr. . R. Serrano para suporte técnico. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH / NIAMS concede AR047664 e AR54816.

Procedimentos experimentais para a eletroporação in vivo de músculos FDB e IO <ol><li> Antes de iniciar o em protocolos de eletroporação in vivo, plasmídeos de expressão de mamífero deve ser amplificado para produzir concentração na faixa de 2-5 mg para Nota plasmídeo / mL de TE:. Rotineiramente usar kits de amplificação comerciais e seguir os procedimentos do fabricante. Comercial plasmídeos expressão carregando o trabalho promotor CMV muito bem no músculo esquelético em transfections vivo. </li><li> Volume da alíquota necessária (10-20 mL) da solução de plasmídeo e salve-o em dois tubos Eppendorf de 0,5 ml (um para cada pé do mouse). </li><li> Prepare uma solução contendo 2 hialuronidase mg / ml em Tyrode estéril. </li><li> Usando uma caixa de anestesiar, profundamente anestesiar um rato usando 4% de isoflurano em O2 com uma máquina aprovado gás anestésico. Colocar o animal em uma almofada de aquecimento (37 ° C) e manter a anestesia usando uma máscara facial de roedores. Monitorar a profundidade anestésica por reflexo pitada dedo do pé. </li><li> Sob observação com um microscópio de dissecção, injetar 10 mL da solução de hialuronidase sob a footpads de um dos pés do mouse usando um 1 &quot;agulha de calibre 33 longa estéril. Penetrar na pele em um ponto perto do calcanhar do pé e avançar a agulha por via subcutânea para a base dos dedos dos pés para ~ 1 / 4 &quot;. </li><li> Repita o procedimento com o outro pé se assim o desejar. </li><li> Desligue a anestesia e coloque o mouse em uma gaiola. Permita que ele se recuperar totalmente da anestesia. </li><li> Após uma hora, anestesiar o animal para uma segunda vez e coloque-o no bloco de aquecimento. Seguindo o mesmo procedimento descrito para a solução de hialuronidase, injetar um total de 20-50 mg do DNA plasmidial (dependendo do tamanho da construção do plasmídeo). O volume de injeção total deve ser inferior a 20 mL / pé. Nota: quando L μ 15-20 é necessário, é aconselhável fechar a pele no ponto de entrada da agulha com tecido cola. </li><li> Desligue a anestesia e coloque o mouse em uma gaiola. Permita que ele se recuperar totalmente da anestesia e esperar por 10-15 min. </li><li> Anestesiar o animal pela terceira vez e coloque-o no bloco de aquecimento. </li><li> Selecione um pé do animal. Coloque uma agulha de acupuntura banhado a ouro sob a pele do calcanhar, e uma segunda na base dos dedos dos pés. Eletrodos são orientados paralelamente entre si e perpendicular ao eixo longitudinal do pé. </li><li> Ligue a cabeça das agulhas (eletrodos) para o estimulador elétrico que utiliza micro-clip conectores. Electroporate os músculos através da aplicação de 20 pulsos, 20 ms de duração / cada, em 1Hz. Dependendo do espaçamento dos eletrodos, amplitude da tensão dos pulsos é ajustado (através do monitoramento com um osciloscópio) para produzir um campo elétrico de 100 V ~ Nota / cm:. Não contrações em resposta aos estímulos devem ser observados se o nível de A anestesia é adequada. </li><li> Se assim o desejar, repita os procedimentos acima no pé contralateral do animal. </li><li> Devolver o animal para sua gaiola e uma vez totalmente recuperado da anestesia mantê-lo sob observação. Nota: se o procedimento foi normal, o animal deve recuperar a mobilidade total dentro de 30 minutos e depois está pronto para ser enviado de volta para a sala de animais no biotério. As injeções de hialuronidase e DNA no footpads não têm perceptível efeitos adversos sobre os animais. Uma vez recuperado da anestesia, os ratos são capazes de amble normalmente ao redor da gaiola. Como uma precaução adicional, adicionar à água potável do carprofeno animais em 0,0027 mg / ml durante 2 dias como um analgésico. </li><li> Expressão da proteína pode ser analisada 2-8 dias após a transfecção. No entanto, a expressão sustentada de muitas proteínas tem sido observado por vários meses. </li></ol> NOTA: Todos os procedimentos animais foram aprovados pela Research o chanceler UCLA Animal da Comissão, como manda a Lei do Bem-Estar Animal e do PHS Política de Assistência Humanitária e Uso de Animais de Laboratório. Resultados representativos: A correcta aplicação da eletroporação in vivo nos procedimentos descritos acima devem resultar na transfecção de plasmídeos eficaz nos músculos FDB e IO. No entanto, a eficiência de expressão de variantes de proteínas transgénicas dependerá do plasmídeo, o tamanho ea complexidade da proteína, as propriedades funcionais da proteína, e uma série de outras variáveis ​​fora de nosso controle. Como ilustrado na Figura 1 para um músculo FDB electroporated na presença de um comercial de codificação (PMR-mCherry) plasmídeo para a proteína mCherry, a maioria das fibras musculares são transfectadas com nosso protocolo, como ilustrado pelo fato de a maioria deles mostrar fluorescência vermelha. Isso não exclui a possibilidade de que as fibras individuais apresentam diferentes graus de expressão da proteína, ou que não são poucas fibras transfectadas em todos os três. Deve-be observou que a expressão eficiente de grandes quantidades de proteínas fluorescentes como mCherry, EGFP, ECFP, e EYFP, não prejudica a excitabilidade das fibras musculares e propriedades acoplamento excitação-contração. Na verdade, eles são indistinguíveis daqueles nos músculos farsa transfectadas (resultados não mostrados). Abordagens práticas utilizadas para verificar a expressão de proteínas fluorescentes localizadas-marcado em fibras musculares esqueléticas. A localização intracelular do di novo expressaram proteínas transgênicas é regularmente avaliada pelo simultânea aquisição, utilizando a TPLSM, imagens fluorescentes das tags e imagens respectivas de marcadores bem identificados das estruturas celulares. O mais típico destes últimos são: a) geração de segundo harmônico (SHG) imagens, que surgem a partir da anisotropia miosina do sarcômero A bandas (centrado no M-lines) 9,10 e, b) di-8-ANEPPS fluorescência imagens, que podem ser obtidos por rotulagem a superfície e transversal tubular (túbulos T) do sistema de membranas das fibras musculares com este dye11 impermeant potenciométrica. Em imagens de fluorescência de fibras musculares coradas com di-8-ANEPPS, o T-túbulos aparecem como faixas estreitas de fluorescência orientada aproximadamente ortogonal ao eixo longo da fibra. Estas bandas são desigualmente espaçadas umas das outras: elas são separadas por uma longa distância que se estende por todo o M-linhas, e um curta que se estende por todo o 11 Z-line. Expressão e localização de α-actinina-EGFP em fibras musculares esqueléticas. Um exemplo da expressão de uma variante com a tag da proteína muscular estruturais α-actinina é mostrado na Figura 2. Esta proteína é conhecida por ser um dos principais componentes do Z-line e, como tal, é rotineiramente utilizado como um marcador deste structure12. Nós transfectadas músculos FDB e IO com a codificação pEGFPN1-α-actinin1 plasmídeo para consumo humano (músculo não-) α-actinina marcados no terminal C com EGFP. Seis dias após a transfecção, descobrimos que, avaliado pela EGFP distribuição de fluorescência, α-actinina é principalmente expresso em faixas estreitas igualmente espaçados ao longo do eixo da fibra. A única banda por sarcômero é visto (Figuras 2A e 2D). A co-localização dessas bandas com o Z-linhas é demonstrada comparando a distribuição de EGFP fluorescência com o SHG (Figura 2B) e di-8-ANEPPS (Figura 2E) imagens. Como mostrado pela imagem de sobreposição (Figura 2C), α-actinina-EGFP bandas se alternam com as bandas SHG, indicando que eles estão localizados a meio caminho entre dois períodos consecutivos de M-bandas, coincidindo com a localização do Z-lines. Nas fibras musculares transfectadas corados com di-8-ANEPPS, α-actinina-EGFP bandas são vistos centrado entre cada par de túbulos T (Figura 2F) que são conhecidos para flanquear a Z-linhas (ou seja, separadas por uma distância mais curta), indicando assim que transgênicos α-actinina é direcionado para o Z-line. Expressão de DHPRα1s marcados no N-terminal com EGFP A eficiência de transfecção muscular com pEGFPC1.1-DHPR α 1s é verificada em imagens TPLSM (eg Figura 3A), mostrando que a maioria das fibras expressar EGFP-DHPRα1s (uma proteína transmembrana). A característica mais proeminente de fibras transfectadas é o padrão duplo em faixas de EGFP fluorescência (Figuras 3A &amp; 3B), como seria de esperar se esta proteína foi voltado para o T-túbulos. Também pode ser observado na Figura 3 que, embora diferentes fibras mostrar vários níveis de intensidade de fluorescência, o padrão de bandas de fluorescência de uma fibra individual parece ser mantida homogênea ao longo da fibra. Na maior ampliação (Figura 3B), pode ser visto claramente que o espaçamento desigual entre as bandas é semelhante à observada em fibras coradas di-8-ANEPPS (eg Figura 2E). As imagens de sobreposição (Figura 3B e 3E) mostram que as bandas SHG estão localizados dentro do maior espaçamento entre EGFP-DHPRα1s bandas, corroborando que esta proteína está no T-túbulos. Adicionais FRET medições com o ânion não-fluorescentes lipofílico DPA (dados não mostrados) demonstrar ainda mais que a metade está dentro de EGFP alguns nanômetros do folheto interno de membranas túbulos T &#39;. Localização e avaliação funcional da expressão de EYFP-ClC1 Fibras transfectadas com pEYFP-ClC1, que codifica uma construção EYFP-tagged (no N-terminal) do canal de cloreto de músculo esquelético (ClC1), bandas de mostrar EYFP de fluorescência (Figura 4A) com um padrão semelhante ao observado para EGFP-DHPRα1s &#39;expressão (Figura 3A) e correspondentes ao arranjo dos túbulos T, conforme ilustrado com di-8-ANEPPS coloração (Figura 2E). Como esperado, a sobreposição de EYFP-ClC1 (Figura 4A) e imagens de SHG (Figura 4B), como mostrado na overlay (Figura 4C), mostram que as bandas SHG estão centradas na grande espaçamento of entre bandas EYFP fluorescência. , A fim de avaliar se a expressão de EYFP-ClC1 resulta em um aumento significativo na condutância de descanso das fibras musculares, como esperado a partir da superexpressão de canais de cloro funcional, fibras musculares enzimaticamente dissociada do músculo FDB transfectadas e estudou as suas propriedades eletrofisiológicas usando uma configuração de dois microeletrodos experimental descrito anteriormente 6,11,13. Figura 5 mostra os resultados de duas fibras: uma expressando uma grande quantidade de EYFP-ClC1 avaliado a partir de medições globais intensidade de fluorescência em um microscópio de fluorescência padrão (não mostrado), eo outro é um controle não-transfectadas. O registro de tensão na Figura 5A (obtido a partir da fibra muscular expressar EYFP-ClC1) demonstra que, devido ao excesso de condutância em repouso, a fibra é quase não-excitáveis. Pulsos de estímulo de corrente de até 400nA (0,5 ms) necessário para ser usado a fim de obter uma resposta muito pequena ativa (sem overshoot Figura 5A). Após a substituição da solução de Tyrode externo para um contendo 500 mM do bloqueador dos canais de cloreto de sódio 9-ACA, 200 pulsos atuais nA foram suficientes para provocar um potencial de ação (Figura 5B), embora muito mais lento e mais amplo do que os registrados na fibra de controle ( Figura 5C). Como esperado, a adição de 9 ACA teve efeitos mínimos sobre esta fibra controle (Figura 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. Eficiência Transfection do método de eletroporação in vivo. Brightfield (A) e de fluorescência (B) imagens de um músculo FDB transfectadas com pmr mCherry. Dias após o protocolo de eletroporação: 12 dias. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">clique aqui</a> para uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Expressão e direcionamento de α-actinina-EGFP em fibras FDB. Painéis A e B são EGFP fluorescência e imagens SHG, respectivamente, de uma fibra expressando α-actinina-EGFP. Painel C é uma superposição das imagens em A e B. Os painéis D e E são as imagens de fluorescência de outra fibra expressando α-actinina-EGFP e corados com di-8-ANEPPS, respectivamente. Painel F é a superposição de imagens em D e E. Dias após eletroporação protocol: 6 dias. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Expressão e direcionamento de EGFP-DHPRα1s em fibras FDB. Painel A, EGFP imagem da fluorescência de um grupo de fibras expressando EGFP-DHPRα1s. Painel B é uma ampliação da praça no painel A, a fim de mostrar melhor o padrão de bandas da expressão da proteína. Painel C é a imagem SHG correspondente à imagem no painel A. Painel D é a sobreposição das imagens A e C. Painel E é um alargamento da área indicada no painel de D. Dias após o protocolo de eletroporação: 20 dias. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Expressão e direcionamento de EYFP-ClC1 em fibras FDB. Os painéis A e B são EYFP fluorescência e imagens SHG, respectivamente, de fibras expressando EYFP-ClC1. Painel C é a superposição das imagens em painéis A e B. Painel D é um perfil de intensidade medida ao longo da linha branca em destaque na imagem no painel C. Dias após a eletroporação protocolo: 7 dias. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Fibras avaliação eletrofisiológica transgênicos expressando EYFP-ClC1. Painéis A e B são registros de tensão de uma fibra expressar EYFP-ClC1 em resposta a pulsos de corrente antes e após o tratamento com 9-ACA, respectivamente. Painéis C e D são registros de voltagem (potenciais de ação) provocou em resposta a pulsos de corrente em uma fibra não-transfectadas antes e após o tratamento com 9-ACA, respectivamente.

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The authors have nothing to disclose.

Descrevemos aqui os passos detalhados que devem ser seguidas a fim de atingir transfections eficaz de plasmídeos de DNA em fibras musculares esqueléticas em por eletroporação in vivo. As principais vantagens da nossa abordagem são a simplicidade de implementação, e sua mínima invasividade que resulta em perigo para a saúde negligenciável para os animais. Na realidade, os protocolos acima descritos eletroporação não implicam muito mais do que duas injeções subcutâneas por pé, seguido po...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

A crescente interesse em biologia celular é a de expressar formas transgenicamente modificado de proteínas essenciais (por exemplo, constrói fluorescente etiquetado e / ou variantes mutantes), a fim de investigar sua distribuição endógenos e relevância funcional. Uma abordagem interessante que foi implementada para cumprir este objectivo em células totalmente diferenciadas é o<em&gt; In vivo</em&gt; Transfecção de plasmídeos por vários métodos em tecidos específicos, tais como o fígado<sup&gt; 1</sup&gt; Muscular, esquelético<sup&gt; 2,3</sup&gt;, E até mesmo o cérebro<sup&gt; 4</sup&gt;. Apresentamos aqui uma descrição detalhada dos passos que devem ser seguidas a fim de transfecção eficiente material genético nas fibras do<em&gt; Flexores dos dedos brevis</em&gt; (FDB) e<em&gt; Interósseos</em&gt; (IO) músculos de camundongos adultos usando um<em&gt; In vivo</em&gt; Abordagem eletroporação. Os parâmetros experimentais foram optimizados de forma a maximizar o número de fibras musculares, minimizando os danos transfectadas tecido que pode prejudicar a qualidade ea quantidade das proteínas expressas em fibras individuais. Temos verificado que a implementação da metodologia descrita neste trabalho resulta em um alto rendimento de proteínas solúveis, ou seja EGFP e ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpaína, FKBP12, β2a-DHPR, etc; proteínas estruturais, ou seja minidystrophin e α-actinina e proteínas da membrana, ou seja α1s-DHPR, RYR1, cardíacas Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Trocador, NaV1.4 Na canal, SERCA1, etc, quando aplicada a FDB, IO e outros músculos de camundongos e ratos. A expressão eficiente de algumas dessas proteínas tem sido verificado com bioquímicas<sup&gt; 3</sup&gt; E provas funcionais<sup&gt; 5</sup&gt;. No entanto, de longe, a abordagem mais comum de confirmação utilizados por nós são de microscopia fluorescente padrão e dois fótons de microscopia de varredura a laser (TPLSM), que permitem identificar não apenas a expressão geral, mas também a localização detalhada intracelular, de construções de proteína fluorescente etiquetado. O método poderia ser igualmente utilizado para transfecção de plasmídeos que codificam para a expressão de proteínas de relevância fisiológica (como mostrado aqui), ou por interferência de RNA (siRNA) com o objetivo de suprimir a expressão de proteínas normalmente expressa (não testado por nós até o momento). Note-se que a transfecção de fibras musculares FDB e IO é particularmente relevante para a investigação da fisiologia de mamíferos desde que as fibras musculares enzimaticamente dissociada estes músculos são atualmente um dos modelos mais adequados para investigar os mecanismos básicos de acoplamento excitabilidade e excitação-contração em corrente ou tensão condições clamp<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Descrevemos os procedimentos detalhados para a transfecção eficiente de DNA plasmidial nas fibras dos músculos do pé de ratos ao vivo usando o eletroporação ea visualização posterior de expressão da proteína através de microscopia de fluorescência.

Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

17.7K visualizações.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. Descrevemos os procedimentos detalhados para a transfecção eficiente de DNA plasmidial nas fibras dos músculos do pé de ratos ao vivo usando o eletroporação ea visualização posterior de expressão da proteína através de microscopia de fluorescência.

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Eletroporação única célula in vivo dentro do cérebro intacto desenvolvimento

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Biologia

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Intranucleares microinjeção de DNA em Dissociated neurônios de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.