O plasmídeo pCAG-gapEGFP foi um presente do Dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmídeo foi um presente do Dr. M. Feller (Berkeley, CA). Agradecemos ao Dr. Edward Ruthazer para sugerir o uso de uma estratégia de duas plasmídeo para a rotulagem única célula e Schohl Anne (Montreal, QC) para validar os dois plasmídeo estratégia Cre / loxP em estudos-piloto e membros de laboratório Crair para suporte técnico. Apoiada por R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) e NIH P30 EY000785 (MC).

1. Equipamentos de Set-up para Eletroporação <ol><li> Eletrodos: Nós modificamos Dumont # 5 pinça para uso como eletrodos. <ol><li> Separar e dividir o fórceps. </li><li> Um fio de solda na ponta mais larga de cada dente. Enrole o fio ligado e dentes com fita isolante deixando aproximadamente 25-30 mm da ponta dos dentes expostos. </li><li> Coloque a pinça modificada para trás junto com qualquer espaçador de plástico adequado (por exemplo um botão) entre os dois pinos para fornecer a ação da mola. </li></ol></li><li> Equipamentos elétricos: Usamos um estimulador elétrico para entregar pulsos de corrente para eletroporação e um monitor de áudio e osciloscópio para confirmar a forma de onda e número de pulsos a ser entregue. <ol><li> Conecte o fio de um pino da pinça para um pedal que também é ligado em série com o estimulador. O pedal funciona como um interruptor. Quando deprimidos que completa o circuito para eletroporação. </li><li> Conecte o fio do pino de outras para o estimulador elétrico. </li><li> Conecte o estimulador ao osciloscópio e monitorar o áudio. </li></ol></li><li> Micropipeta e injetor set-up: Nós usamos afiada pipetas de vidro e puxou o Nanoinject II sistema injetor para injetar volumes muito pequenos de corante ou solução DNA diretamente na retina. <ol><li> Montagem do sistema injector em um micromanipulador de 3 eixos. </li><li> Puxe pipetas de vidro com uma vela de comprimento e pequena ponta. </li><li> Voltar encher a pipeta puxado com óleo mineral e segura de injector (para detalhes ver manual de instruções Nanoinect II). </li><li> Usando uma tesoura afiada microdissecting um corte a ponta da pipeta, criando uma pequena abertura (~ 2-3 mm). </li><li> Encher a pipeta com a quantidade desejada de uma solução de injeção através da ponta da pipeta. Enquanto a integridade da ponta tem, ele pode ser usado para injeções múltiplas e animais. Nota: i) Assegurar o suficiente solução injectável é carregado nas pontas de tal forma que o óleo mineral backfilled nunca é injetado no olho. ii) O Nanoinject II do sistema e do equipamento eletrônico específico utilizado neste vídeo não são críticas para a realização bem sucedida de rotulagem RGCs. Injeções feitas com outros dispositivos, como um picospritzer e eletroporação com outros estimuladores comum também pode ser usado para RGCs rótulo. </li></ol></li></ol> 2. Soluções plasmídeo para Rotulagem RGC <ol><li> Para a rotulagem pequenos grupos de RGCs: Usamos uma construção de codificação EGFP (~ 2-3 mcg / mL) reforçada proteína verde fluorescente) sob o controle de um promotor de CAG (promotor de frango β-actina com uma imediata CMV enhancer precoce). EGFP é marcado com a seqüência de palmitoylation GAP-43 (crescimento associado a proteína-43) visando-lo para a membrana celular (mut4EGFP) 12. Esta construção é referido como pCAG-gapEGFP. </li><li> Para a rotulagem única célula: Usamos uma combinação de duas construções. O primeiro vetor é um promotor CAG condução Cre recombinase (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] plasmídeo 13775) 13 eo segundo vetor contém uma cassete PARAR floxed seguido por membrana alvo EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) é utilizado na concentração de aproximadamente 1.000-10.000 vezes menor que pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), confinando EGFP expressão forte para um pequeno número de células (por força da a relativamente baixa concentração pCAG-Cre). </li></ol> 3. Injeção de retina e Protocolo Eletroporação <ol><li> Dia pós-natal 0 (P0) para filhotes P5 são anestesiados por hipotermia, enquanto os ratos mais velhos do que P5 são anestesiados com uma injeção intraperitoneal (0,7 ml / kg) de um coquetel de cetamina (4,28 mg / mL), xilazina (0,82 mg / ml) e acepromazina (0.07mg/ml) 14. </li><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e dicas de eletrodos em um esterilizador talão quente. Posteriormente fresco tanto em solução salina estéril antes do uso para evitar danos térmicos aos olhos. </li><li> Colocar o mouse em um escopo dissecção e posição do injetor. </li><li> Para camundongos com idade inferior a P14 (antes da abertura dos olhos), cirurgicamente abrir a pálpebra, cortando toda a extensão da abertura da pálpebra futuro com micro dissecação b tesoura primavera. </li><li> Faça o globo ocular se projetam parcialmente suavemente aplicar pressão ao redor do olho com as pontas dos forceps c. </li><li> Mantenha o olho no lugar por beliscar suavemente a pele ao redor do globo ocular. </li><li> Ajuste micromanipulador e trazer pipeta junto ao globo ocular. </li><li> Pressione pedal, que é ligado à II Nanoinject sistema, para expelir algumas gotas de solução de injeção e, assim, verificar se a pipeta não está entupido. </li><li> Com uma mão estabilizar o globo ocular, mova o micromanipulador de tal forma que a ponta da pipeta de vidro perfura através do epitélio pigmentar da retina e entra na retina. </li><li> Injetar desIRED quantidade de solução pressionando o pedal para o sistema II Nanoinject. Por exemplo, para rotular RGCs única fazemos uma única injeção de 2,3 4.6nL. </li><li> Retrair a pipeta e coloque cuidadosamente dicas eletrodo diretamente sobre o local da injeção e deprimem pedal de estimulador para completar o circuito e electroporate o olho. Normalmente usamos pulsos quadrados com as configurações de força de 25V, 50mseg duração, além 1seg. 10 pulsos (5 pulsos de cada polaridade) são aplicados pulsos para os ratos com mais de P4 e 6 (3 pulsos de cada polaridade) são aplicados para P0 a P3 ratos. </li><li> Com cuidado, empurre para trás do globo ocular no soquete e aplicar pomada oftálmica estéril sobre as pálpebras cortadas. </li><li> Animais lugar sobre uma almofada de calor com temperatura controlada e em recuperação completa, incluindo o reaquecimento adequado e mobilidade, o retorno dos animais à sua mãe. </li><li> Monitorar os animais a cada 12 horas para qualquer sinal de sofrimento, dor ou desconforto, como perda de mobilidade, postura anormal ou falta de noivo. Repetidas rodadas de anestesia, injecções e eletroporação não deve ser realizada no mesmo animal. </li></ol> 4. Notas <ol><li> O método de injeção descritos neste vídeo é uma injeção de &#39;cego&#39;. É possível visualizar a quantidade e localização de injeção quando se trabalha com ratos albinos e soluções coloridas (DII ou solução plasmídeo com traços de azul rápido). No entanto, com cepas pigmentadas ratos no local de injeção não pode ser diretamente visualizado e, portanto, é difícil descrever verbalmente se alguém chegou ao local pretendido retina ou quão longe se deve mover-se a pipeta para atingir a camada de RGC especificamente. Por isso, aconselhamos os novos usuários a começarem com injeções de DII em ratos albinos uma vez que estas injecções podem ser visualizados imediatamente no retina e à rotulagem das projeções RGC para a retina e do cérebro podem ser usados ​​para avaliar a qualidade de injeção. Prepare DII 10% em N, N-Dimetilformamida (100%) para injectáveis ​​focal. Usuários uma vez que este procedimento é dominado deve ser capaz de consistentemente alvo RGCs com soluções claras DNA plasmídeo em ratos pigmentados. </li><li> O método de injeção descritos neste vídeo pode ser usado para fazer injeções focal DII para rotular pequenas populações de células para estudo retinotopy (4.6nL etiquetas de algumas centenas RGCs) 14 e RGCs rótulo granel com fluoróforos (Alexa555, 488 etc), conjugada com subunidade B da toxina da cólera para estudar olho específico de segregação, excluindo o passo eletroporação em # 10 acima. Um volume de injeção máxima total de 2-3uL de ratos mais velhos do que P14 e 1-2uL para camundongos com idade inferior a P14 de qualquer solução é recomendada. </li><li> Pipetas podem ser backfilled com soluções a ser injetado seguido de preenchimento com óleo mineral antes de montar a pipeta no injector e quebrar a ponta. Isto é especialmente útil quando se utiliza soluções alta concentração de DNA (~ 6ug/uL), que são em geral muito viscoso e difícil de carga da ponta da pipeta. </li><li> Se a pipeta de vidro se torna obstruído, limpe cuidadosamente a ponta da pipeta com um cotonete embebido em água para soluções de DNA e de etanol (100%) para a tintura (DII) soluções. </li><li> Depois de injetar no olho, retirar a ponta da pipeta do globo ocular e pressione o pedal para injetar novamente. Isto é para confirmar que a ponta não ficar entupidos durante o processo de injeção. Se nenhuma solução for distribuído, é bastante provável que a injeção não foi bem sucedida. No entanto, isso não deve ser tomado como um sinal de absoluta de que a injecção não foi bem sucedida. O experimentador pode injetar o mesmo olho novamente se locais de injecção múltipla e rotulagem de maior número de células é desejada. </li><li> Para a rotulagem RGCs único, definir a velocidade de injeção para retardar na caixa de controle Nanoinject. Isso reduz ainda mais a quantidade de solução injetada na retina como o sistema demora mais tempo a essa configuração para dispensar a solução ao mesmo tempo, a ponta do pipetas de vidro está sendo recolhida rapidamente a partir do globo ocular. </li><li> Eletroporação do dia pós-natal 0-3 (P0 a P3) ratos exige cuidados adicionais, pois é muito fácil danificar o olho (isto se torna evidente depois de alguns dias de recuperação, quando o olho é comprovadamente menor que o normal). Redução do número de pulsos e tensão aplicada é aconselhável para o início de ratos neonatal. Depois de P4, os globos oculares são mais resistentes aos danos da eletroporação. </li><li> Em nossa experiência versões membrana alvo de EGFP ou RFP (&#39;gapEGFP, ver 12) são muito superiores a GFP não modificada para o exame retinofugal projeções para o cérebro. No entanto, pCAG-tdTomato, que carece de uma membrana alvo de modificação, também funciona bem (Figura 1E). Além disso, dextran conjugados corantes fluorescentes também podem ser usados ​​para RGCs etiqueta usando o protocolo de eletroporação descrito acima. </li><li> Tipicamente, 9 em cada 10 injeções levará a RGCs rotulados, embora apenas cerca de 15% das injeções com a abordagem dupla plasmídeo iráresultado em apenas um único RGC ser rotulado. O número de casos de sucesso pode ser aumentada através da injeção de DNA em vários locais em um olho ou pela injeção de plasmídeos codificação de diferentes proteínas fluorescentes em cada olho. </li></ol> 5. Resultados representante RGC rotulagem foi observada em todas as idades, variando de P2 para P25, com EGFP rotulagem em RGCs por 24 horas após a eletroporação e mantido expressão para, pelo menos, três semanas após transfecção. Dendrites fluorescente etiquetado (Figura 1A, B) e mandris axonal (Figura 1F) de RGCs única pode ser claramente visualizado e reconstruído. Além de RGCs, esta técnica pode ser usada para rotular outros tipos de células da retina, tais como células horizontais, células bipolares e amácrinas vários subtipos de células (Figura 1C) Este método não interfere com o curso do tempo normal de refinamento mapa visual como demonstrado por retinotopy normal na SC (Figura 1E). Em todas as idades, em cerca de 90% dos casos, uma injeção de pequeno volume (~ 2,3 4.6nL) de pCAG-gapEGFP levou a expressão em uma RGCs poucos (Figura 1D). Em aproximadamente 15% dos ensaios utilizando uma única injeção da pCAG-Cre e plasmídeos pCAG-LNL-gapEGFP combinação por animal, levou a rotulagem único neurônio da retina, incluindo RGCs (Figura 1A, B, D) e outros tipos de células, tais como amácrinas células (Figura 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 - A, B. Exemplos de EGFP rotulados única células ganglionares da retina (cabeça de seta apontando para axônio) em um flat-mount retina no pós-natal dia 14 (P14) C. Exemplo de célula única amácrinas starburst em P8 D.. . Um conjunto de EGFP rotulados neurônios da retina, incluindo RGCs e células amácrinas em retina flat-mount at P14 RGCs. E. dorsais e ventrais no olho direito foram electroporated e rotuladas com EGFP e RGCs temporal e ventral no olho esquerdo foram galvanizados e rotulados com tdTomato em P1. As zonas alvo (asteriscos) formado pela RGCs rotulado pode ser visto em seu local topograficamente correto no SC em P9 (todo-mount, o contorno branco). F. Exemplo de um único EGFP rotulados RGC arbor (2-D de projeção), em uma seção sagital (250 mm de espessura) do SC (linha pontilhada). Para maior clareza, imagens em (D) e (F) foram convertidas para tons de cinza e invertida. Barras de escala (mm): (A) - (D), (F): 100; (E): 500

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste vídeo mostramos um protocolo de eletroporação in vivo que resulta em rotulagem de clusters único ou pequeno de neurônios da retina em ratos pós-natal com as construções de DNA que codificam proteínas fluorescentes. Pequenos grupos de fluorescente etiquetado projeções para o RGC dLGN e SC reproduzida padrões projeção semelhante como estudos anteriores usando rotulagem RGC com corantes lipofílicos, indicando que eletroporação não interferiu normais RGC refinamento arbor axônio. Nós utili...

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiais </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinça </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Estimulador elétrico </td><td> Instrumentos grama </td><td> Modelo S4 </td></tr><tr><td> Osciloscópio </td><td> Agilent </td><td> Modelo 54621A </td></tr><tr><td> Áudio do monitor </td><td> Instrumentos grama </td><td> Modelo AM8B </td></tr><tr><td> Puxador </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modelo P-97 </td></tr><tr><td> Vannas Scissors um </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Micro Tesoura b </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA Pinça c </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II Sistema </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Pipetas de vidro </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Pedal </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-Dimetilformamida </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

A segmentação e refinamento das projeções para o mesencéfalo RGC é um sistema de modelo popular e poderosa para o estudo de como os padrões precisos de forma a conectividade neural durante o desenvolvimento. Em camundongos, as projeções retinofugal estão dispostos de uma forma topográfica e forma dos olhos específicas camadas no núcleo geniculado lateral (dLGN) do tálamo e colículo superior (SC). O desenvolvimento desses padrões precisos de projeções retinofugal tem sido tipicamente estudados pela rotulagem populações de RGCs com corantes fluorescentes e marcadores, tais como peroxidase 1-4. No entanto, estes métodos são muito grosseiro para fornecer informações sobre alterações de desenvolvimento em cada morfologia arbor RGC axonal que são a base da formação do mapa retinotopic. Eles também não permitem a manipulação genética de RGCs. Recentemente, a eletroporação tornou-se um método eficaz para proporcionar o controle espacial e temporal preciso para entrega de moléculas carregadas na retina 11/05. Atuais protocolos de eletroporação da retina não permitem a manipulação genética eo rastreamento de projeções retinofugal de um único cluster ou pequena de RGCs em ratos pós-natal. Tem sido argumentado que a pós-natal em eletroporação in vivo não é um método viável para transfecting RGCs desde a rotulagem de eficiência é extremamente baixa e, portanto, requer a segmentação em idades embrionárias quando progenitores RGC são submetidos a diferenciação e proliferação 6. Neste vídeo nós descrevemos um protocolo de eletroporação in vivo para a entrega prevista para genes, shRNA, e dextranos fluorescentes para RGCs murino pós-natal. Esta técnica proporciona um custo efetivo, rápido e relativamente fácil para plataforma de triagem eficiente de genes candidatos envolvidos em vários aspectos do desenvolvimento neural, incluindo retração axônio, ramificação, laminação, regeneração e formação de sinapses em vários estágios de desenvolvimento do circuito. Em resumo, descrevemos aqui uma valiosa ferramenta que irá fornecer mais ideias sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento mapa sensorial.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Nós demonstramos uma<em&gt; In vivo</em&gt; Protocolo de eletroporação para transfecting aglomerados único ou pequeno de células ganglionares da retina (RGCs) e outros tipos de células da retina em ratos pós-natal em uma ampla faixa de idades. A capacidade de rótulo e manipular geneticamente RGCs pós-natal<em&gt; In vivo</em&gt; É uma ferramenta poderosa para estudos de desenvolvimento.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

transfection-mouse-retinal-ganglion-cells-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

15.3K visualizações.  Yale University. Nós demonstramos uma In vivo Protocolo de eletroporação para transfecting aglomerados único ou pequeno de células ganglionares da retina (RGCs) e outros tipos de células da retina em ratos pós-natal em uma ampla faixa de idades. A capacidade de rótulo e manipular geneticamente RGCs pós-natal In vivo É uma ferramenta poderosa para estudos de desenvolvimento.

Vídeo: Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neurociência

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Alinhamento de Fibra de OCT de Retina de Camundongo com Imagens Confocais

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autor em destaque: Avanços na imagem da retina in vivo e ex vivo para melhorar o diagnóstico e o tratamento do glaucoma 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...