Agradecemos a Brian G. Coon e Claudia B. Hanna para discussões úteis e de apoio. Este projecto foi apoiado pelo start-up fundos do Dep. de Ciências Biológicas, da Universidade Purdue de Claudio R. Aguilar e um American Cancer Society Research Grant Institucional de Claudio R. Aguilar através do Centro de Câncer Purdue.

A. Cultura de Células e indução de proteínas Esta seção descreve as condições de cultura celular, ciclo celular sincronização com Nocodazol, seguida de indução da expressão da proteína a partir de um promotor regulável em células de levedura. <ol><li> A cepa de levedura tipo selvagem W303 (leu2-3, 112 trp1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) é transformada com cópia de alta (2μ) DNA plasmídeo que contém o nosso gene de interesse (ENTH2) sob o controle de um promotor de metionina-repressor (MET25). 2mM metionina é suficiente para suprimir a atividade do promotor, enquanto a mídia sem metionina permite a expressão máxima. Assim, uma gama de concentrações de metionina pode ser usado para expressar a proteína no nível desejado. Transformação de um plasmídeo de DNA em células W303 é feito usando o método LiAc-TE acordo com os procedimentos padrão. 2 Nota: Este experimento deve ser realizado através do crescimento das células durante a noite, na presença de 2mM metionina para assegurar a expressão da proteína apenas em níveis de fundo. Na manhã seguinte, a expressão da proteína deve ser induzido pela ressuspensão das células em meios de falta de metionina imediatamente a sincronização do ciclo celular seguinte (cerca de 4h). No entanto, descobrimos que o ENTH2-dependente fenótipo divisão celular é induzida somente após uma concentração considerável de ENTH2 construiu nas células (geralmente depois de 4-6h de indução de proteínas 3), fazendo o curso de tempo para a análise de todas as manifestações de o fenótipo muito longo (pelo menos 16h). Descobrimos que as células de crescimento durante a noite, na presença de 0,2 mM metionina reprime o fenótipo morfológico, mas permite a concentração de proteína subcrítica que podem ser rapidamente aumentado para fenótipo induzindo-os níveis, quando transferido para mídia sem metionina. Isto permite uma análise detalhada das manifestações graves do defeito a divisão celular em um período relativamente curto de tempo. Nós, portanto, recomendamos que o experimentador determinar a concentração de metionina, que é sub-limiar para a indução do fenótipo em uma base caso a caso. </li><li> Escolha seis colônias de uma placa contendo as células recém-transformada e inocular em 50 ml de meios seletivos com 0,2 mM de metionina em um frasco esterilizado cônica usando técnicas estéreis. Incubar durante a 30 ° C com agitação a 200 rpm. (Para mais informações sobre as condições de cultura padrão fermento, ver ref. 4) </li><li> Na manhã seguinte, a densidade de células estimativa através da medição da densidade óptica da cultura em 600nm. Transferir o equivalente a 20 OD 600nm de células em um tubo de centrifugação estéril e colheita girando a 2200 rpm durante 5min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em YPD em uma concentração de 0,4 OD 600nm / ml e adicionar Nocodazol para uma concentração final de 15μg/ml de partir de um estoque de 1mg/ml em DMSO. Incubar por 4h a 30 ° C com agitação em 200 rpm. Nota: Os métodos alternativos de prisão, incluindo parada na fase G0 usando fator alfa-ou em fase G1-S usando hidroxiuréia pode ser usado. Nós descobrimos que a prisão em mitose utilizando Nocodazol é simples e eficaz o suficiente para os nossos propósitos. </li><li> Após 4h, verifique porcentagem de células em mitose preso pela contagem do número de células com igual gomos de tamanho através da visualização no microscópio. Se a prisão for superior a 90%, avance para o passo seguinte. Caso contrário, manter as células em Nocodazol até que a porcentagem desejada de paragem da mitose é alcançado. </li><li> Células colheita por centrifugação a 2200 rpm para 5min e lave com água gelada por três vezes. Após a lavagem final, ressuspender o sedimento em meios seletivos falta de metionina, a uma densidade de células de ~ 0,5 OD 600nm / ml. Transferência de metade do volume de células para um novo tubo estéril e adicionar metionina para uma concentração final 0,2 mM. Isto irá servir como um controle para efeitos devido aos níveis basais de expressão da proteína. Isto marca o primeiro ponto do tempo do experimento (tempo = 0h). Analise as células a cada hora por 6h. </li></ol> B. Análise do Desenvolvimento Fenótipo Nota: Todos os métodos de análise descritos a seguir não precisam ser executadas simultaneamente. Determinação dos níveis de expressão de proteínas por western Blotting <ol><li> Em cada ponto do tempo, medir o OD 600nm da cultura e colheita 2 OD 600nm equivalentes de células por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de água estéril e transferir a suspensão para um tubo eppendorf de 1,5 ml. Repetir a centrifugação para obter uma pelota. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 50μl tampão de amostra SDS-PAGE Laemmli (50 mM Tris pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, 2% β-mercaptoetanol e 0,006% de azul de bromofenol). Adicionar 50μl de contas ácido lavou o vidro (diâmetro 0,2-0,4 microns) e vortex por 1 min. </li><li> Tubos de ferver em um 95 ° C de calor block por 2 minutos, vortex durante 30 segundos e recomeçar a ferver durante 5 minutos. Congelar a amostra de proteína a -20 ° C. </li><li> Executar amostras de proteínas em um gel 12% SDS-PAGE, transferido para uma membrana de nitrocelulose e executar Western blotting com anticorpos adequado para detectar a proteína de interesse. Neste exemplo, investigar a presença de hemaglutinina (HA) com a tag domínios ENTH pela incubação com o mouse de anticorpos anti-HA (Covance, Princeton, NJ), 1:2000 diluição em Blotto-Tween (1XPBS, 5% de leite sem gordura seca , 0,1% Tween). HRP tag anticorpo de cabra anti-rato secundário (Pierce) na diluição 1:2.500 de, também em Blotto-Tween, é permitido ligar o anticorpo primário na membrana por 1h em temperatura ambiente. Supersignal Substrato Pico Oeste Chemiluminescent é usado para detectar anticorpos do mouse HRP tagged anti. </li><li> Quantificar os níveis de expressão da proteína por densitometria. </li></ol> Esta seção descreve dois métodos de desenvolvimento de fenótipo de rastreamento em função do aumento da concentração de proteína. O primeiro método é a célula de base populacional, enquanto os estudos de segundo, ao nível de uma única célula. Quantificação de divisão celular e morte celular fenótipo <ol><li> Em cada ponto do tempo, a transferência de 1 ml de suspensão celular para um tubo eppendorf estéril usando técnicas estéreis e células colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 70μl de mídia, seguidos por 30μl de metileno azul de um estoque de 1mg/ml em água estéril. Azul de metileno é um corante azul vital que se torne incolor no ambiente redutor do citoplasma, portanto, as células mortas podem ser identificados pela cor azul. </li><li> Pipeta ~ 6μl desta suspensão sobre uma lâmina de vidro limpa e coloque uma lamínula sobre a queda. Pressione a lamínula com cuidado para formar uma camada fina e uniforme de células entre as interfaces de vidro. </li><li> Divida a lamela em 9 quadrantes e tomar 3 imagens por quadrante, conforme indicado na figura. 2. O número de células / campo não deve ser maior que 30 células para permitir a quantificação precisa. Cada lamela pode ser trabalhada por aproximadamente 15 minutos antes que as bolhas de ar danificar a preparação. </li><li> Contar o número de células mostrando o fenótipo em estudo. O defeito divisão celular induzida sobre ENTH2 superexpressão leva à morte celular e, portanto, nós também contar o número de células mortas identificados pela cor azul. </li><li> Calcular a porcentagem de células fenotípicas. </li><li> Plotar os dados como mostrado na figura. 3. </li></ol> Visualização do fenótipo específico defeitos usando microscopia de fluorescência Divisão celular as células defeituosas, como visto em cima ENTH2 superexpressão, são muitas vezes caracterizados por defeitos da parede celular e mislocalization3 septina (visualizado como GFP fusão proteínas). A parede celular de levedura de brotamento podem ser facilmente visualizados através da coloração com calcofluor white (CFW), que se liga irreversivelmente a quitina na parede celular de levedura. <ol><li> Em todos os tempos ponto de 1ml, alíquotas da cultura em um tubo eppendorf estéril e as células da colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 100μl de solução CFW 1mg/ml em água estéril e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Colheita de células por centrifugação e lavar 3 vezes com PBS 1X. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100μl de 1X PBS e imagem sob o microscópio usando óptica UV (parede celular) e FITC filtro (GFP-septina) com ampliação de 100X. </li><li> Quantificar porcentagem de células com defeito da parede celular e mislocalization septina seguindo os passos 4-6 na seção B.2.1 </li></ol> B.3. Determinação do fenótipo de desenvolvimento no nível da célula única: Time-lapse de microscopia de vídeo. <ol><li> Limpar uma lâmina de vidro com uma depressão côncava com álcool 70% e deixar secar ao ar. </li><li> Ferva 0,06 g de agarose em 5ml meios seletivos falta de metionina em um tubo de vidro esterilizado no microondas até que a agarose se dissolva completamente. </li><li> 200μl rapidamente pipeta do agarose contendo mídia na depressão de slides e inverter uma outra lâmina de vidro limpa sobre ele, para que não se bolhas de ar ficam presos embaixo. </li><li> Quando o gel solidifica, mova o controle em cima sem problemas de distância da lâmina depressão, mantendo suas superfícies paralelas em todos os momentos. Isso garante que a superfície da cama agarose fique nivelada com a superfície da lâmina depressão. Limpe a região em torno da cama deslize agarose com um tecido delicado. O slide está pronto para uso. </li><li> Em tempo = 4 horas, 1 ml de transferência de células da cultura para um tubo eppendorf estéril e colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Nota: Recomenda-se um tempo mais tarde ponto de ser escolhido para garantir altos níveis de expressão da proteína para que o desenvolvimento fenótipo é garantida. As experiências-piloto são obrigados a detere tempos de indução em uma base caso a caso. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 100μl de produtos frescos faltam meios seletivos metionina. </li><li> Aplique vaselina nas bordas da lamínula. Em seguida, coloque uma gota de suspensão de células no centro da cama e espalhar uniformemente agarose pressionando suavemente uma lamela sobre eles. </li><li> Selar as bordas da lamínula com vaselina e corrigir a sua posição, alinhando as bordas com unha polonês. Aguarde até que a seca unha polonês. </li><li> Coloque o slide em um palco aquecida de um microscópio e escolher um campo que não contém mais de 10 células espaçadas adequadamente. Como as células se dividem, o campo vai ficar lotada com o tempo. </li><li> Ter uma imagem do campo a cada 5 minutos para a 5 horas. Progressão fenótipo pode ser estudado por montar as imagens em um filme usando software ImageJ ( <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ, EUA National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005</a> ) </li></ol> Nota: Nós usamos microscópio Zeiss Axiovert 200M, Zeiss AxioCam MRM monocromática câmera digital e lente Carl Zeiss Axiovision software de aquisição de imagem (versão 4.4) para imagens de células vivas. Controle de temperatura é conseguida pela colocação de slides em um palco mantido aquecido a 30 ° C por 37 Pecon Tempcontrol dispositivo. A fim de evitar re-ajustar o foco repetidamente, é conveniente para programar o software de aquisição de imagem para adquirir automaticamente alguns z-stack imagens em todos os tempos ponto-e escolher a imagem com o melhor foco mais tarde, quando a montagem do filme. Alguns softwares de aquisição de imagem tem a opção de foco automático para experimentos curso do tempo. É conveniente usar essa opção em quando disponível. Células de levedura tipo selvagem crescem melhor a 30 ° C, portanto, de controle de temperatura é crítica. A fim de assegurar calor adequado, é útil para fornecer uma fonte externa de calor, além do estágio aquecida. Por exemplo, deixamos a luz transmitida branca do microscópio sobre para toda a duração da imagem. Também é fundamental para evitar bolhas de ar ao preparar a cama agarose e sanduíche de celular. O ar preso dentro da bolha se expande quando aquecida ao longo do tempo e tendem a levar as células de distância do campo que está sendo fotografada. Também é importante assegurar que as posições de células individuais dentro do campo não muda significativamente ao longo da duração do processo de imagem, especialmente durante a re-focalização tentativas. Plugins de estabilização de imagem estão disponíveis para ImageJ para corrigir pequenas mudanças na posição das células após o filme foi montado. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / / código Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

Este protocolo descreve como monitorar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico (célula de levedura capaz de se submeter a divisão celular propriamente dita) sobre superexpressão da proteína. Ao fazer este procedimento é importante para se lembrar de colher células de levedura por peletização na velocidade de centrifugação recomendada como velocidades mais rápidas podem danificar as células e os resultados obscuros. Azul de metileno e calcofluor branco deve ser adicionado ao vivo células pouco antes d...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Embora este protocolo é baseado na superexpressão de uma proteína, que pode facilmente ser adaptado para fenótipos morfológicos dependente supressão da expressão da proteína. Nosso laboratório está interessado em estudar as propriedades de sinalização do epsin endocítica adaptador de proteína. Para esse fim foi utilizada uma abordagem dominante negativo em que expressou a over-conservada<u&gt; E</u&gt; Psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology domínio (ENTH), a fim de interferir com as funções de endógenos epsin-2 (Ent2 ou YLR206W). Observamos que a superexpressão do domínio ENTH de Ent2 (ENTH2) em células de tipo selvagem levou a um defeito de divisão celular que é dependente do mislocalization de uma família de proteínas andaimes, septinas.

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

analysis-development-morphological-phenotype-as-function-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K visualizações.  Purdue University. Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis Saccharomyces cerevisiae.

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Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Uso de Rotorod como um método de análise qualitativa de Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...