Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para a RAW a partir do seguinte: Institutos Nacionais de Saúde concede K01 DK083512, DP2 OD008470, e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor iniciantes Scholar concessão de uma subvenção # 5 FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame College of Science e do Departamento de Ciências Biológicas; e uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame de Elizabeth e Michael Gallagher, em nome da família Gallagher para promover a investigação em células estaminais. Os financiadores não tinham qualquer papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa de peixe-zebra em Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar da nossa colônia de peixe-zebra. Finalmente, agradecemos aos membros do nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e idéias sobre este trabalho.

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos métodos que permitem a visualização dos componentes do segmento nefrónio no peixe-zebra adultos. A injeção de conjugados de dextran fluorescentes permite rotulagem PCT preferencial devido as propriedades de endocitose dessas células do túbulo proximal 30,38. Este método pode ser realizado com grande flexibilidade, devido à existência de dextranos que pode ser obtida com um grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Além disso, a utilização de dextranos de lisina-fixável é uma forma especialmente conveniente para rotular PCT segmentos, como procedimentos de marcação secundárias não são necessários. Isso permite a detecção do sinal relativamente simples e é compatível com muitas outras marcas fluorescentes, imunomarcação e uso de linhas repórter transgênicos. Rotulagem de fosfatase alcalina também marca o túbulo proximal, com forte reação no PCT e reactividade ligeiramente mais fraco no PST. Finalmente, a coloração com DBA permite rotulagem dos segmentos tubulares distais, que exibem um characteristic ramificada morfologia. Várias moléculas de lectina, que são proteínas de ligação de açúcar de origem não-imune, têm sido amplamente utilizados para distinguir os segmentos de nefrónios de mamíferos 47. É interessante que no peixe-zebra DBA correlaciona-se com os segmentos do túbulo distai, uma vez que é utilizado para marcar ductos coletores em rins de mamíferos 47. Tomados em conjunto, estes métodos podem ser utilizados em várias combinações para documentar composição e função renal. Uma vez que todos estes métodos podem ser usados ​​em preparações de rim de inteiros, eles fornecem ferramentas para avaliar estrutura nefrónios e função ao longo do órgão, sem depender exclusivamente a utilização de mais demorado, métodos tediosas, por exemplo, o trabalho de criocorte e imunomarcação. No entanto, os corantes descritos neste artigo métodos são viáveis ​​no criocorte. Análise cryosection gera amostras (em comparação com todo mount) que são mais adequadas para imunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, embora, naturalmente, este tipo de análise requer a disponibilidade de anticorpos primários adequados. Infelizmente uma grande limitação em trabalhar com o modelo animal peixe-zebra continua a ser a fraca disponibilidade de anticorpos. Assim DESEJO continua a ser o mais utilizado, ou seja, &quot;go-to&quot;, procedimento para a análise da expressão gênica. DESEJO usando reações de substrato BCIP, NBT, e / ou INT para produzir precipitados roxo ou vermelho não é compatível com coloração fluorescente em criossecções. Uma opção seria a utilização de invocar a detecção DESEJOS fluorescente, um procedimento que foi optimizado para as amostras de peixes-zebra embrionários e pode ser adaptado para uso com o rim de adulto. A descrição dos métodos neste artigo de vídeo deve permitir uma maior experimentação com técnicas como DESEJO fluorescente em combinação com linhas de peixes-zebra transgénicos em que os segmentos individuais são marcadas com um repórter como eGFP ou mCherry. Alternativamente, os métodos descritos aqui could ser testados em combinação com outros corantes vitais, por exemplo, outras lectinas. Assim, uma nova adaptação e ampliação dos métodos descritos aqui poderia ser invocado para atender às necessidades do investigador para preparações integrais renais montagem e análise. Como tal, estes métodos têm larga aplicação potencial de peixe-zebra com o modelo para os estudos de regeneração em curso e também em modelos de doença genética. Há uma necessidade premente de pesquisas inovadoras e tratamentos para males renais. Milhões de pessoas sofrem de algum tipo de doença renal a cada ano que resulta de causas congênitas, agudas e / ou crônicas. Além disso, a prevalência da doença renal continua a aumentar em todo o mundo, fazendo com que essas doenças um problema global de saúde pública 14,15. Tratamentos como a hemodiálise estão disponíveis através do qual uma máquina de diálise externo serve para livrar o sangue de resíduos metabólicos do paciente, se os seus rins não são capazes de desempenhar esse papel. Infelizmente, Esta intervenção tem limitações, como é necessário para a sobrevivência de tratamento contínuo. Além disso, os doentes irão eventualmente necessitar de um transplante de rim, o que pode levar anos para receber uma vez por paciente é colocado em uma lista de espera. Mesmo depois da obtenção de um transplante de rim, muitos pacientes sofrem efeitos adversos, como resultado do procedimento e deve lutar esses efeitos para o resto de suas vidas. Essas dificuldades demonstram a grande necessidade para o desenvolvimento de novos tratamentos para ajudar a prevenir qualquer doença renal ou talvez aumentar a regeneração dos tecidos 8,16,52,53. Dadas as limitações óbvias éticos da utilização de cobaias em laboratórios biomédicos humanos, os modelos animais são essenciais para o estudo da patogénese da doença humana e para o ensaio de novos tratamentos. Como um resultado da sua semelhança e proximidade anatómica evolutiva, o ratinho se tornou o modelo o mais amplamente usado para a doença humana 45. No entanto, existem algumas limitações com este animal, incluing incapacidade de visualizar o desenvolvimento de órgãos in vivo e praticidade de completar telas genéticos de larga escala. Peixe-zebra é um organismo modelo relevante e útil para o estudo do desenvolvimento dos órgãos e modelagem de doenças humanas 45,46. Em relação à doença humana, homólogos funcionais no peixe-zebra existem para quase 70% de todos os genes humanos 54,55. Trabalhos recentes destacaram a utilidade do peixe-zebra para muitas áreas de 31,37,56 pesquisa renal. Estudos de regeneração e reparo no peixe-zebra após AKI sugerem que a regeneração epitelial tubular e neonephrogenesis são dois processos que ocorrem e se sobrepõem ao longo da regeneração timecourse 30,37. A utilização de um antibiótico aminoglicósido gentamicina chamada tem sido utilizada como um paradigma da lesão, através do qual a estudar os resultados de LRA 29,30,37 em peixes-zebra adultos. Ao longo de aproximadamente duas semanas de período após lesão de gentamicina, a Tubul proximales regenerar, e, entretanto, novos néfrons formar por todo o órgão 29,30,37. Em geral, os mecanismos que regulam a regeneração epitelial permanecem altamente controversa. Em um mecanismo proposto para o processo de reparação, não é o evento lesão aguda inicial, seguido por um desprendimento de células mortas para o lúmen. Em seguida, há uma série de desdiferenciação, proliferação e migração de eventos, após o qual as novas células se diferenciam, o repovoamento da membrana basal lesada e restaurar a função para o local ferido. Alternativamente, outros estudos sugeriram que as células de substituição surgem a partir de células estaminais / progenitoras que residem dentro dos túbulos dos néfrons. No que respeita ao processo de neonephrogenesis no peixe-zebra, agregados celulares foram observadas após AKI pela injeção de gentamicina 29,30. Estes agregados depois amadurecer em novos néfrons que sondar em túbulos já existentes 29,30. O traço comum que une néfrons regeneração epitelial e neonephrogenesis é seu fator de mistério pura: no momento não são exponencialmente mais perguntas sobre como esses feitos regenerativos ocorrer do que há idéias disponíveis. Até o momento, no entanto, várias linhas emocionantes de evidências sustentam a noção de que a pesquisa de regeneração renal usando zebrafish pode realmente fornecer informações comparativas pertinentes para AKI humano que também pode ter direto de translação potencial 56-58. Rastreio químico para identificar pequenas moléculas que aumentam a proliferação das células progenitoras renais no embrião do peixe-zebra recentemente conduziu à identificação do inibidor de histona desacetilase butanoato de metilo-4 (feniltio) (m4PTB) 56,57. A administração desse composto de larvas do peixe com induzida por gentamicina AKI revelou que a sobrevivência larval aumentou e que a proliferação tubular renal foi melhorada 56,58. Quando os ratos com lesão renal aguda induzida por isquemia moderada foram tratados com m4PTB, sua recuperação foi acelerada em association com uma redução tanto atrofia e ciclo celular tubular prisão de proliferação de células tubulares renais 58. Estas descobertas sugerem que as vias responsáveis ​​para o normal desenvolvimento do peixe-zebra renal e / ou a resposta regenerativa de LRA será conservada com mamíferos 56. Assim, embora mais estudos são necessários para separar os mecanismos de regeneração, ou seja identificar as vias de sinalização que estão envolvidos e entender suas interações-o peixe-zebra fornece um caminho promissor para perseguir este objetivo importante na área de nefrologia. As ferramentas tais como as etiquetas de células nefrónio descritos neste protocolo representa um grupo de ensaios que podem ser utilizados para avaliar a composição e funcionalidade renal em modelos LRA. Além disso, eles podem ser utilizados para caracterizar os modelos transgénicos de doença renal e podem proporcionar formas para identificar agentes terapêuticos químicos capazes de promover a restauração da estrutura depois de nefrónio barragem renalidade.

O rim é um órgão complexo que cumpre uma série de funções fisiológicas no corpo. A função mais importante do rim é a excreção de resíduos metabólicos, e esta tarefa está intimamente entrelaçada com a manutenção da homeostase dos fluidos. O rim executa esses trabalhos por filtração do sangue e formação de urina, enquanto concomitantemente regulação da pressão arterial, os níveis de eletrólitos e equilíbrio ácido-base. Túbulos epiteliais altamente especializadas chamadas nefrónios servir como a unidade funcional de base do rim 1,2. Nos vertebrados adultos, néfrons são normalmente organizados em um arranjo bem enrolada em torno de um sistema de drenagem centralizada, permitindo, assim, muitos túbulos de embalar para o relativamente pequeno órgão. Por exemplo, cada rim humano pode conter mais de 1 milhão de néfrons 3. Outros mamíferos como o mouse possuem na ordem de 8-10000 néfrons por renal 4. O grau de complexidade renal difere entre esses mamíferos e outras vertebrates devido a variações no número total de néfrons e seu layout arquitetônico dentro do rim. Espécies de vertebrados formar até três sucessivas estruturas renais durante o desenvolvimento, e cada forma exibe uma complexidade crescente em relação à dotação de néfrons e disposição: os pronephros, mesonephros e metanefro. A última estrutura renal a ser retida serve como o rim adulto tipicamente um órgão ou um mesonefros metanefros 2. Cada forma de rim, no entanto, tem uma composição à base de nefrónio 2. O néfron é o carro-chefe do rim e é responsável pela filtragem do sangue, juntamente com secreção metabólito e reabsorção. Néfrons são estruturas tubulares simples formadas por células epiteliais e têm uma organização segmentar, em que domínios discretos, altamente especializados e de epitélios diferenciados executar tarefas específicas. Na ordem do fluxo de filtrado através do néfron, normalmente há três partes principais que comprise cada uma das unidades: (1) o corpúsculo renal, (2) um túbulo proximal com, intermédia, e distais, e (3) uma conduta de recolha 1. O túbulo proximal é responsável pela reabsorção de solutos orgânicos, mais notavelmente glicose e os aminoácidos 1. O túbulo intermediário (ou alça de Henle) é um importante local de sal e água a regra 1. Finalmente, ajuste fino de sal e outros íons ocorre no túbulo distal e ducto coletor e é altamente regulado pelo sistema endócrino 1. A partir daí, o filtrado viaja através do ureter e da bexiga, em última análise, que sai do corpo como um produto residual 1. A perda da função renal pode ser resultado de uma multiplicidade de causas que impedem a atividade de néfrons normal. Essas causas podem ocorrer durante o desenvolvimento do rim, por exemplo, defeitos congênitos que levam à má formação de néfrons 5 ou causas de diferentes tipos de lesão (decorrente tanto genética e environmeorigens ntal). Lesões adquiridas são amplamente classificados como lesão renal aguda (IRA) ou lesão renal crônica (DRC). LRA envolve uma perda abrupta da função renal, muitas vezes resultante de isquemia ou toxina exposição 6,7. Nos mamíferos, reparação epitelial de néfrons é possível após tais lesões 8, e muitas pessoas exibem a restauração completa da função renal após AKI. No entanto, AKI também está associada com alta morbidade e mortalidade que foram relatados através de uma ampla 30 - 70% de incidência 6,7. DRC, em contraste, está associada com a perda progressiva da função renal que resulta de anos de danos prolongado, tipicamente associada com fibrose 8,9. Além disso, existe uma interação entre AKI e CKD, como qualquer um pode predispor um indivíduo para o outro 10-12. Por exemplo, aqueles que sofreram AKI são mais suscetíveis à doença renal crônica e mesmo a morte 13. A incidência da doença renal, em ambos os EUA e em todo o mundo, atingiu epideproporções de microfone e está prevista a aumentar como a população idosa expande-, portanto, há uma necessidade crescente de identificar intervenções de medicina regenerativa para o rim 14,15. Apesar do conhecimento de que pacientes com LRA pode se recuperar, há muito tempo se pensou que o rim é um órgão sem poderes regenerativos inatas. Esta visão tradicional foi revisado drasticamente nos últimos anos 16. Estudos investigando dano renal em camundongos e ratos após AKI têm mostrado que as células epiteliais do túbulo do néfron podem proliferar e reconstruir néfrons funcionais 17-20. Embora os mamíferos possuem essa capacidade adaptativa para regenerar néfrons, existem limitações notáveis ​​e respostas inadaptadas podem ser desencadeadas que levam a fibrose renal e CKD 21. Por exemplo, um estudo recente demonstrou que a ablação das células epiteliais repetido em nefrónios murino foi associada com a regeneração diminuída e nefrónios-sugerindo fibrose renal havea limitada limiar regeneração 22. Não há nenhuma evidência de que o rim de mamífero adulto forma novas nefrónios para substituir os perdidos ou danificados, assim, a sua destruição leva a um défice de 8,9 nefrónio permanente. Curiosamente, alguns vertebrados respondem a AKI regenerando néfrons epitélio e por também produzir novos néfrons, um processo conhecido como neonephrogenesis ou néfrons neogênese 23. Neonephrogenesis ocorre em peixes após exposição a uma toxina ou ressecção parcial e modelos de lesão incluíram historicamente o peixinho 24,25, tilápia 26, patim 27, medaka 28 e, mais recentemente, o peixe-zebra 29,30. Destes, peixe-zebra fornecer um modelo de pesquisa genética viável para descobrir as vias celulares e moleculares responsáveis ​​pela regeneração renal. Neste artigo de vídeo, demonstramos como rotular segmentos dos néfrons em peixe-zebra adulto. O conhecimento da anatomia de néfrons, as características moleculares,e características funcionais são essenciais para estudos renais futuro de sucesso usando zebrafish. O rim adulto do peixe-zebra é uma estrutura mesonefros e é inerentemente menos complexo, em termos de número de nefrónios e organização do que a estrutura de metanefros encontrada em mamíferos adultos, aves, répteis e 31. Contudo, a organização segmento nefrónio do peixe-zebra é análogo aos mamíferos, e foi documentada no rim embrionário com base em estudos de expressão de genes 31-35. Nefrónios de embriões de peixes-zebra conter segmentos lineares tubulares que incluem o túbulo proximal (PCT), túbulo proximal recta (PST), distal precoce (DE), e distal tarde (DL) 31-35 (Figura 1). Nefrónios adultos Zebrafish possuem segmentos tubulares semelhantes 30,31,36,37 (Figura 1). O PCT, também podem ser identificados por um fenótipo funcional: As células epiteliais na PCT irá incorporar compostos de dextrano marcados com fluorescência (10-70 kDa em tamanho) presentes nocirculação, que foi usado tanto no rim embrionário do peixe-zebra e adulto para avaliar a absorção de endocitose por essas células do túbulo proximal, 38-41 (Figura 1). Uma diferença em segmentos dos néfrons entre peixe-zebra e mamíferos é que carecem de um peixe-zebra túbulo intermediário, ou alça de Henle 30-37; uma vez que este segmento funciona em mamíferos para conservar a água e peixe-zebra são uma espécie de água doce, sem a urgência de concentrar a urina, não é de estranhar que zebrafish falta neste segmento 32,33. Assim, a composição global nefrónio é largamente conservada entre o peixe-zebra e rim de mamífero 32,33. Estas semelhanças permitiram peixe-zebra para ser uma ferramenta eficaz de investigação para investigar as funções dos genes expressos-renais durante nefrogênese desenvolvimento 32-35,42 e modelar inúmeras doenças renais 43,44, o que agrava a lista substancial das condições humanas que podem ser investigada usandozebrafish 45,46. Hoje, o rim adulto peixe-zebra é um modelo atraente para estudos comparativos de regeneração renal devido à sua rastreabilidade genética eo palato expansão dos recursos tecnológicos disponíveis para interrogar a função do gene e vias de sinalização nesta espécie. Vários estudos têm utilizado os mesonephros peixe-zebra para investigar os mecanismos de regeneração após AKI 29,30,37. Para a pesquisa AKI continuou usando o rim adulto peixe-zebra, é essencial dispor de métodos requintados para rotular diferentes regiões e métodos de néfrons para examinar a funcionalidade de néfrons. Existem vários métodos de análise de rim adulto foram adaptados a partir de protocolos de rim embrionário. A injecção intraperitoneal de dextrano marcado fluorescentemente no peixe-zebra adultos rótulos do epitélio em PCT Mesonefros nefrónios via endocitose 30, como em embriões de peixe-zebra 38-41 (Figura 1). Este método tem sido utilizado para visualize quando túbulos proximais recuperar a sua propriedade reabsorvendo seguinte AKI, o que permite uma avaliação das restaurado função fisiológica 30 (Figura 1). Outra característica do túbulo proximal nefrónio é que as células epiteliais deste segmento possuir uma borda em escova 37 que apresenta elevados níveis de actividade de fosfatase alcalina endógena. Assim, o epitélio proximal pode ser localizada visualmente no rim adulto peixe-zebra utilizando uma técnica de fluorescência com base conhecido como ELF- (Enzyme-Labeled Fluorescência) -97 47. Aqui, nós descrevemos como realizar ensaios de captação de dextrano fluorescentes 30,48 no rim adulto peixe-zebra, de modo a obter uma avaliação funcional do túbulo proximal e mapear o tamanho e os contornos do segmento tubular. Em seguida, descreve-se técnicas para identificar as regiões do túbulo proximal do nefrónio adulto com a fosfatase alcalina marcador fluorescente. Em terceiro lugar, mostramos pela primeira vez que o Rhodamina marcada com lectina de aglutinina de Dolichos biflorus (DBA), a qual tem sido utilizada como um marcador geral das condutas de recolha no rim de mamíferos 49, marca os túbulos distais do rim adulto peixe-zebra. Como DBA é mutuamente exclusiva à coloração da fosfatase alcalina, esses rótulos fornecem uma maneira de distinguir amplamente pan-proximal contra trechos pan-distais do néfron zebrafish adulto. Ao longo da implementação destas manchas fluorescentes em todo tanto montagem e cortes histológicos criostáticas, nós correlacionar esses rótulos com domínios de genes transportadores de soluto que identificam cada um dos segmentos de néfrons de expressão. Portanto, este protocolo também contém um guia para os procedimentos de processamento de tecidos modificados para todo tecido adulto montagem de hibridação in situ (desejo) a análise com base em nosso protocolo DESEJO embrião 50. Estes procedimentos podem ser utilizados em combinações diferentes (Figura 2) para documentar características morfológicas e funcionais of adultos néfrons nos rins do peixe-zebra. Assim, estes protocolos podem ser aplicados a estudos de regeneração, a caracterização fenotípica dos outros modelos de doenças renais, e até mesmo utilizado para estudar a formação de rim adulto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

O modelo de peixe-zebra tem emergido como um sistema relevante para estudar o desenvolvimento do rim, a regeneração e a doença. Ambos os rins de peixes-zebra embrionários e adultos são compostas de unidades de nefrónios funcionais conhecidos como, que são altamente conservadas com outros vertebrados, incluindo mamíferos. Pesquisa em zebrafish demonstrou recentemente que dois fenômenos distintos transpire após néfrons adultos estão sujeitos a danos: primeiro, não há regeneração robusta dentro de néfrons existentes que substitui as células epiteliais do túbulo destruídos; segundo, inteiramente novos nefrónios são produzidos a partir de células progenitoras renais em um processo conhecido como neonephrogenesis. Em contraste, os seres humanos e outros mamíferos parecem ter apenas uma capacidade limitada de regeneração epitelial nefrónio. Até à data, os mecanismos responsáveis ​​por esses fenômenos de regeneração renal permanecem pouco compreendidos. Desde rins peixe-zebra adulto sofrer tanto a regeneração epitelial néfrons e neonephrogenesis, eles fornecem um par experimental excelentedigma para estudar esses eventos. Além disso, há uma grande variedade de ferramentas genéticas e farmacológicos disponíveis no modelo de peixe-zebra que podem ser utilizadas para delinear os mecanismos celulares e moleculares que regulam a regeneração renal. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve um conjunto de técnicas de marcação que podem ser usadas para medir a composição e funcionalidade renal teste nefrónio do rim adulto peixe-zebra. Assim, estes métodos são amplamente aplicáveis ​​para o futuro caracterização fenotípica dos paradigmas de peixe-zebra adultos de lesão renal, que incluem mas não estão limitados a, os regimes de exposição nephrotoxicant ou métodos genéticos de morte celular-alvo, tais como a nitro-redutase mediada técnica de ablação celular. Além disso, estes métodos podem ser utilizados para estudar a formação de perturbações genéticas em rim de adultos e pode também ser aplicado para avaliar o estado da doença renal crónica durante a modelação.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

O rim adulto do peixe-zebra é um excelente sistema para os estudos de regeneração e de doenças renais. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve várias metodologias que podem ser implementadas para avaliar a composição de néfrons túbulo e avaliar a reabsorção renal.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.7K visualizações.  University of Notre Dame.  O rim adulto do peixe-zebra é um excelente sistema para os estudos de regeneração e de doenças renais. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve várias metodologias que podem ser implementadas para avaliar a composição de néfrons túbulo e avaliar a reabsorção renal. 

Vídeo: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Coleta de sangue para análise bioquímica em Zebrafish Adulto

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...