Este trabalho foi financiado por uma doação para MK e BKK da Medical Foundation Ellison. MK é um Ellison Medical Foundation Scholar novo no Envelhecimento. Gostaríamos de agradecer Soumya Kotireddy para a assistência durante as filmagens.

Parte 1: Prepare cepas e placas para replicativa análise expectativa de vida Esta seção descreve a preparação das placas sólido YEPD para uso no experimento período replicativo vida e da preparação de células de levedura para a análise de ciclo de vida. <ol><li> Utilizando uma técnica estéril apropriado, preparar placas de ágar YEPD (extrato de levedura 1%, 2% Bacto-peptona, agar 2%, 2% de glicose) que será utilizada para células de levedura de cultura e para a análise replicativa vida. Você deve preparar, pelo menos, duas placas para cada 4-5 cepas a serem analisadas no experimento vida. As placas devem ser preparadas pelo menos 2 dias antes do experimento tempo de vida e deixa-se secar antes de iniciar o ensaio de vida. Se a experiência não será iniciado dentro de 4-5 dias de despejar as placas, eles devem ser colocados em uma incubadora refrigerada e envolto em parafilme ou plástico para evitar dessecação. </li><li> Remover cepas de leveduras das existências de congelados e raia para colônias única em ágar YEPD. Até 6 cepas podem ser facilmente riscado no mesmo prato YEPD dividindo a placa em tamanho igual torta em forma de cunhas. </li><li> Incubar as células a 30 ° C por 2 dias. </li><li> Remover as células da incubadora e células correção de uma única colônia em um prato doce YEPD. Duas manchas de duas diferentes colônias deve ser gerado para cada cepa. Neste momento, as cepas a serem analisadas devem ser codificadas para garantir a replicação experimento vida é feita &quot;às cegas&quot;, onde o dissectors não sabe a identidade das cepas individuais. </li><li> Incubar o patch, as células codificadas a 30 ° C até a noite seguinte. </li><li> Remover as células e células de ânimo leve correção de cada linhagem codificada para novas placas YEPD, que servirá como as placas experimental utilizado para a análise período replicativo vida. As células devem ser corrigidos ao longo de uma linha vertical no lado esquerdo da placa de YEPD (Figura 1). Cerca de 3-5 amostras por placa é ótima, assumindo replicativa análise expectativa de vida em 20 células de cada patch. Não é necessário (nem desejável) para transferir um grande número de células para a placa de YEPD fresco, pois isso fará com que as células a crescer grossa durante a incubação overnight, o que pode limitar a sua vida útil subseqüente replicação. </li><li> Incubar as placas recém-corrigida durante a noite no topo do banco. </li></ol> Parte 2: células de posição para análise replicativa vida. Nesta seção descrevemos como posicionar as células de levedura na placa e como obter células-filhas virgens para análise replicativa vida. Deste ponto em diante, todas as placas devem ser parafilmed, exceto quando submetidos a dissecação, a fim de prevenir dessecação. <ol><li> Usando um microscópio equipado com um aparelho de microdissecção adequado para levedura, a transferência de cerca de 50 células da cepa primeiro patch para uma posição na placa distal para as células corrigidas. Se o seu estágio do microscópio é graduado, essas gradações podem ser usados ​​para garantir as células serão fáceis de encontrar, durante as iterações subseqüentes. No Axioscope Zeiss 40, as células da cepa primeiro patch pode ser colocada nas coordenadas 90 x 10 e vestiu verticalmente a partir daí. </li><li> Limpe a agulha de células repetidamente tocando a superfície do ágar, em seguida, criar um buraco no agar, forçando a agulha através da superfície do ágar. Esse buraco vai servir como um marcador para orientá-lo sobre o prato durante as iterações subseqüentes de dissecção e remoção das células filha. Tenha cuidado para não obter células de levedura no buraco, ou eles vão crescer e formar uma colônia. </li><li> Diretamente acima do buraco, alinhar verticalmente células de levedura individuais em 20 posições uniformemente espaçadas, com diâmetros de agulhas 1-3 (~ 100 M) entre cada posição da célula (Figura 1). Cada poucas células, coloque duas células adjacentes uns aos outros na mesma posição na linha, em vez de um. Isto permite a redundância durante a virgem filha de seleção de célula, se uma das células transferidas não se divide. </li><li> Entre os dias 10 e 11 º posições na linha, criar uma série horizontal de 7-8 furos no agar. Isto irá servir como um marcador para orientá-lo sobre a placa durante as iterações subseqüentes de dissecção e remoção das células filha. Tenha cuidado para não obter células de levedura nos buracos, ou eles vão crescer e formar uma colônia. </li><li> Repita os passos de 2,1-2,4 para cada patch no prato, continuando a série de células verticalmente ao longo do mesmo eixo. Para o passo 2.2, o número de buracos criados deve corresponder ao número de patch (um furo para o primeiro patch, dois furos para o segundo, etc.) </li><li> Uma vez que as células já foram preparados para cada patch, parafilme a placa e incubar a 30 ° C por aproximadamente 2 horas. </li><li> Repita os passos de 2,1-2,6 para cada placa no experimento. </li></ol> Obter células virgem filha para a análise de ciclo de vida: parte 3 Nesta seção, vamos iniciar a análise de ciclo de vida, assegurando que cada célula começa como uma virgem filhacélula. <ol><li> Remova as placas da incubadora e verificar que a maioria das células dispostas foram submetidos a uma divisão celular. Se o tempo adicional é necessário para permitir a divisão celular para ser concluída, voltar a placa para a incubadora. </li><li> Começando com a primeira célula vestida, use a agulha para retirar células-filhas a partir da célula-mãe colocando delicadamente a agulha em cima das células em anexo. Às vezes é útil para explorar o lado da base do microscópio, enquanto a agulha está descansando sobre as células. </li><li> Coloque a célula-filha destacada na linha vertical, substituindo a célula-mãe e todas as células filhas adicionais e movê-los temporariamente de lado. </li><li> Repita o passo 3.2 e 3.3 para cada uma das células dispostas. Se uma célula não se divide, dê uma célula-filha de uma das células redundantes posicionado no passo 2.3. Quando terminar, você deve ter 20 células-filhas para cada patch alinhados verticalmente sobre a placa de vida. </li><li> Colete todas as células mãe e filha células extra em uma pilha e transferi-los de volta para uma área perto da patches (&quot;cemitério&quot;). É importante manter as células indesejadas longe de células em fase de análise expectativa de vida para prevenir a formação de microcolônias e esgotamento de nutrientes local. </li><li> Parafilm a placa e incubar a 30 ° C por aproximadamente 2 horas. </li><li> Repita os passos de 3,2-3,6 para cada placa no experimento. </li></ol> Parte 4: Medição da capacidade de replicação das células individuais <ol><li> Preparar os dados de vida folhas span. A vida útil folha de dados pode ser uma grade simples, onde cada linha corresponde a uma célula-mãe individual e cada coluna corresponde a uma idade-ponto (Figura 2). Etiqueta de cada folha de dados de acordo com o número de cepas a serem analisadas. </li><li> Remova as placas da incubadora e verificar que a maioria das células dispostas passaram por pelo menos uma divisão celular. Se o tempo adicional é necessário para permitir a divisão celular para ser concluída, voltar a placa para a incubadora. </li><li> Começando com a primeira célula formou na primeira placa, observar visualmente a célula mãe e filha (s) e determinar o número de divisões celulares que tenham ocorrido. Em geral, é fácil determinar quantas células-filhas de uma mãe produziu, com base em padrões característicos de arranjos celulares. Registrar o número de células filhas produzidas pela célula-mãe na caixa apropriada na súmula tempo de vida. </li><li> Use a agulha para retirar células-filhas a partir da célula-mãe, como descrito no passo 3.2. </li><li> Manter a célula-mãe na sua posição na vertical e mova a célula-filha (s) para temporariamente de lado. </li><li> Repita os passos de 4,3-4,5 para cada uma das células dispostas. </li><li> Coletar todas as células filhas descartados e movê-los para o &#39;cemitério&#39;, localizado próximo as manchas original. </li><li> Parafilm a placa e incubar a 30 ° C por 2-3 horas. </li><li> Repita os passos de 4,3-4,8 para cada placa no experimento. </li><li> Repita os passos até que todas as células 4,2-4,9 mãe pararam de se dividir. Como a idade células mãe, a progressão do ciclo celular se torna mais lenta e será desejável para incubar a placa por longos períodos de tempo entre a idade-points. As placas podem ser colocadas a 4 ° C durante a noite. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante. Os dados brutos produzidos por um período de experiência de vida é um replicativa números lista correspondente às células produzidas por cada célula-mãe em cada idade-ponto (Figura 2). Somando-se cada linha da folha de pontuação, o tempo de vida replicativa para cada célula-mãe é obtido. Dados para células-mãe do mesmo grupo experimental podem ser agrupados para gerar uma curva de sobrevida (Figura 3A) e para realizar cálculos estatísticos, tais como expectativa de vida média, tempo de vida mediana e desvio padrão. Um teste não-paramétrico, como o teste de Wilcoxon Rank-Sum, pode ser realizada para determinar se diferenças significativas no tempo de vida foram detectados entre os grupos experimentais. Quando o experimento funciona corretamente, a curva de sobrevivência deve ser consistente com cerca de Gompertz-Makeham mostrando uma cinética sigmoidal shap com baixa mortalidade precoce seguido um declínio relativamente rápido na sobrevivência e um achatamento da curva de uma idade mais avançada. A maioria das linhagens selvagens têm valores replicativa tempo de vida na faixa de geração de 20-30, embora fora variação desta faixa tem sido relatada. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Diagrama de um típico prato período replicativo vida. À noite, antes de começar microdissecção de células de levedura, 3-5 cepas são levemente corrigido para a superfície de uma placa de YEPD (caixas vermelhas) em uma linha vertical ao longo de um lado da placa. Depois de um crescimento durante a noite, aproximadamente 30 células individuais de cada linhagem estão dispostas verticalmente em uma linha contendo 20 posições. Tempo de vida Analysis será realizada em células v virgem filha obtidos a partir dessas células iniciais. Células extra obtido a partir de microdissecção durante o experimento (por exemplo, células-filhas indesejadas) são colocados em &quot;cemitério do&quot; (oval cinza), que está localizado longe das células experimentais, a fim de evitar o esgotamento local de nutrientes como colônias são formadas. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. A vida replicativa folha de registro span. Dados brutos de um experimento de tempo de vida replicativa é mostrado. Cada linha corresponde a uma única célula de levedura mãe e cada coluna corresponde a uma idade ponto. O número inserido em cada caixa é o número de células filhas produzidas por essa célula-mãe nessa idade ponto. Cada cepa é rotulado com um número codificado de tal forma que o indivíduo dissecar as células de levedura não tem conhecimento da identidade das cepas sendo analisado. Vinte células são analisadas para cada estirpe. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Sobrevivência representante e curvas de crescimento a partir de um experimento de tempo de vida replicativa. (A) As curvas de sobrevida são obtidos através da plotagem da fração de células mãe ainda está viva em função da idade replicativa (número de divisões celulares. (B) As curvas de crescimento são obtidos traçando a número médio de células-filhas produzidas por uma cepa dada em função da idade ponto. Neste exemplo, a tensão # 2 é de vida mais longa, mas é um crescimento mais lento, como evidenciado pela inclinação reduzida inicial da trama de crescimento.

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	<li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+yeast+aging.">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species.">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li><li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast.">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast.">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li><li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes.">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li><li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients.">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

O envelhecimento é um processo degenerativo caracterizado por uma deterioração progressiva de componentes celulares e organelas, resultando em mortalidade. A levedura de brotamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Tem sido amplamente utilizado para estudar a biologia do envelhecimento, e diversos determinantes da longevidade de leveduras foram mostrados para ser conservada em eucariotos multicelulares, incluindo vermes, moscas e ratos<sup&gt; 1</sup&gt;. Devido à falta de facilmente quantificado associado à idade fenótipos, o envelhecimento em leveduras foi ensaiada quase exclusivamente através da medição do tempo de vida das células em diferentes contextos, com dois paradigmas de vida diferentes extensão de uso comum<sup&gt; 2</sup&gt;. Esperança de vida cronológica refere-se ao período de tempo que uma célula mãe pode sobreviver em uma não-divisão, o estado de quiescência-like, e se propõe a servir de modelo para o envelhecimento de células pós-mitóticas em eucariontes multicelulares. Tempo de vida replicativa, em contrapartida, refere-se o número de células filhas produzidas por uma célula-mãe antes de senescência, e é pensado para proporcionar um modelo de envelhecimento nas células mitoticamente ativo. Aqui apresentamos um protocolo generalizada para medir o tempo de vida replicativa das células-mãe de brotamento de leveduras. O objetivo do ensaio período replicativo vida é determinar quantas vezes cada buds célula-mãe. As células mãe e filha podem ser facilmente diferenciadas por um pesquisador experiente, usando um microscópio de luz standard (ampliação total 160X), como o Axioscope Zeiss 40 ou outro modelo comparável. Separação física das células-filhas a partir de células mãe é conseguido usando um micromanipulador manuais equipada com uma agulha de fibra óptica. Cepas de leveduras típicas de laboratório 20-30 produzir células-filhas por mãe e um experimento de tempo de vida exige de 2-3 semanas.

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Neste artigo apresentamos um protocolo geral para medir o tempo de vida replicativa das células-mãe do fermento.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.5K visualizações.  University of Washington. Neste artigo apresentamos um protocolo geral para medir o tempo de vida replicativa das células-mãe do fermento.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biologia

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Quantificar Yeast Life Span cronológica por conseqüência de células envelhecidas

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Methods Article

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento