Para começar, lave as iPSCs cultivadas com PBS ou DPBS da Dulbecco. E adicione um mililitro de mistura proteolítica e colagenolítica. Incube o prato a 37 graus Celsius por dois minutos para separar as células.
Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio de cultura iPSC pré-aquecido para interromper a reação. Dissociar as células da placa de cultura celular pipetando para cima e para baixo sete a 10 vezes para obter uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros.
Pellet as células a 200xg por cinco minutos à temperatura ambiente. E aspirar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em dois mililitros de meio de cultura iPSC suplementado com 50 micromolares Y27632.
Agora, use 10 microlitros da suspensão celular para contar as células usando uma câmara de Neubauer. Ajustar a concentração da suspensão celular para 9.000 células por 150 microlitros usando meio de cultura iPSC suplementado com 50 micromolares Y27632. Para gerar corpos embrionários ou EBs, agite o tubo de suspensão celular para evitar a sedimentação celular antes de semear 150 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa.
Cultivar os EBs em atmosfera humificada por 48 horas. Ao final da incubação, retirar 100 microlitros de meio por poço. E adicione 150 microlitros de meio fresco pré-aquecido sem Y27632.
Crie uma grade de quatro por quatro covas no parafilme colocando a grade de parafilme no rack de tubo de 0,2 mililitro com o lado envelopado de papel voltado para cima. E pressione suavemente um dedo enluvado contra cada orifício do rack para incorporar os EBs na matriz da membrana basal. Em seguida, remova o papel e corte a grade de covinha para fora do quadrado de parafilme usando tesoura para ajustar seu tamanho para caber em um prato de cultura de células de 60 mililitros.
Coloque o parafilme ondulado de volta no rack de tubo de 0,2 mililitro para fornecer uma base para a geração de gotículas da matriz da membrana basal. Transfira cuidadosamente os EBs, um após o outro, do poço do prato de cultura para as covinhas de parafilme usando uma pipeta com uma ponta de pipeta cortada de 200 microlitros. Depois de mover 16 EBs para a grade, pegue uma nova ponta de pipeta de 200 microlitros e remova o meio restante das covinhas.
Agora, pipete uma gota de matriz de membrana basal em cada covinha contendo um EB. Pegue uma ponta de pipeta de 10 microlitros e mova rapidamente os EBs para o centro de cada gotícula sem perturbar as bordas da gotícula. Coloque o parafilme ondulado com as gotas da matriz da membrana basal em uma placa de cultura de células de 60 milímetros. E incubar por 15 a 30 minutos a 37 graus Celsius para permitir que a matriz se polimerize.
Além disso, para separar os EBs embutidos na matriz do parafilme, adicione cinco mililitros de meio de diferenciação sem vitamina A ao prato. E vire o quadrado de parafilm de cabeça para baixo usando pinças para que o lado com os EBs fique voltado para o fundo do prato. Agite cuidadosamente a placa para separar as gotas da matriz da membrana basal contendo os EBs do parafilme.
Se alguns deles ainda estiverem presos, pegue uma borda do quadrado de parafilme usando pinças e enrole-o rapidamente em direção ao centro do prato várias vezes. Em seguida, cultive os organoides cerebrais em um agitador orbital a 55 rpm em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar a 37 graus Celsius. Mantenha os organoides no DM sem vitamina A com trocas de meio a cada dois dias.
Uma imagem de campo brilhante de um organoide cerebral humano de 32 dias pós-semeadura com estruturas semelhantes a ventrículos na periferia e uma morfologia compacta e saudável é mostrada.
