Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

Dentro de um armário de biossegurança, remova o tecido adiposo murino com pinças estéreis. Uma vez removido o excesso de PBS, transfira o tecido para outra placa de Petri e lave duas vezes por cinco minutos cada com 10 mililitros de solução de PBS AA. Adicionar 20 mililitros de solução de colagenase preparada em um copo de cristal contendo um centímetro quadrado de tecido fragmentado e uma barra magnética.

Incubar o copo selado a 37 graus Celsius com agitação contínua. Filtrar o homogeneizado através de uma abertura de aço inoxidável de 40 malhas de 0,38 milímetros Filtrar em uma placa de Petri e coletar a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Suspender cuidadosamente a fração vascular estromal em 20 mililitros de DMEM suplementado a quente e centrifugar a suspensão.

Após descartar o sobrenadante, lave suavemente as células duas vezes com 40 mililitros de meio DMEM não suplementado. Suspender o palato em cinco mililitros de DMEM suplementado. Transfira a suspensão para uma garrafa T de 25 centímetros quadrados e incube.

Lavar as células três vezes com cinco mililitros de PBS AA aquecido e duas vezes com DMEM não suplementado. Para remover quaisquer restos celulares e células não murinas adicione cinco mililitros de DMEM fresco e aquecido suplementado e troque o meio a cada três a quatro dias. Quando as células atingirem 90 a 100% de confluência, adicione um mililitro de solução quente de tripsina EDTA às células lavadas com DMEM.

Incubar por cinco a sete minutos a 37 graus Celsius. Adicione quatro mililitros de DMEM suplementado à monocamada celular destacada e desagregue suavemente a suspensão. Suspender as células em cinco mililitros de DMEM suplementado a quente.

Depois de centrifugar e descartar o sobrenadante, misture suavemente o pellet em um mililitro de DMEM suplementado. Manchar as células com azul de tripano e contá-las em uma câmara de Neubauer. Células de sementes em frascos T-75.

Para garantir a formação de colônias e alta proliferação, observe a morfologia das células coradas pela hematoxilina e eosina ao microscópio óptico. As colorações de hematoxilina e eosina revelam citoplasma extenso com prolongamentos alongados e microfilamentos intracelulares abundantes.