Para começar, prepare dois mililitros de formalina a 4% ou qualquer outro fixador apropriado. Mantenha também uma placa de Petri, fórceps e tesoura cirúrgica prontas antes de iniciar o procedimento. Coloque os peixes criolesionados devidamente eutanasiados em uma placa de Petri contendo água deionizada.
Com a tesoura, realizar um corte pelo corpo, anterior e posterior ao pedúnculo caudal. Deixe o tecido sangrar na água deionizada dentro da placa de Petri. Com pinças, coletar e transferir o pedúnculo caudal para a solução de fixação preparada em um tubo de microcentrífuga.
Inverta cuidadosamente o tubo várias vezes. Antes de montar, lave o tecido fixado em PBS por 10 minutos em um balancim. Em seguida, transfira-o para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros contendo uma solução de sacarose a 30% em água deionizada, pré-resfriado a quatro graus Celsius e inverta suavemente o tubo várias vezes.
Deixe o tubo na posição vertical a 4 graus Celsius por pelo menos 24 horas. Preencha um molde de incorporação com uma camada de cinco milímetros de meio de montagem OCT. Com pinças, coloque o pedúnculo caudal na parte inferior do molde.
Ajuste sua orientação para cortes transversais ou coronais. Deixe o meio congelar em uma caixa de gelo seco. Assim que o tecido estiver estabilizado na posição desejada, preencha o restante do molde antes que a OCT congele completamente.
Armazenar o molde a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora antes de seccionar o tecido usando um criostato. A extensão da criolesão em diferentes dias pós-criolesão, ou ICPD, foi analisada nos cortes caudais do pedúnculo usando coloração tricrômica composta por azul de anilina, fuschin ácido e laranja-G. As áreas danificadas foram determinadas pela ausência de coloração laranja.
Aos 4 e 7 dpci, o corte transversal exibia músculo esquelético extensamente degenerado no flanco crioleado do corpo. A análise por imunofluorescência mostrou que, aos 4 DPCI, o lado lesado do pedúnculo caudal continha abundantes células positivas para DAPI, mas pouca ou nenhuma F-actina e tropomiosina 1, indicando músculos degenerados. Aos 7 dpci, a tropomiosina 1 e a actina F puderam ser detectadas na ferida, próximas à linha média vertical do corpo, indicando o início da formação de novas miofibras.
A 30 dpci, ambos os lados do corpo apresentaram distribuição semelhante da coloração com F-actina, indicando eficiente restauração do músculo esquelético.
