Use uma vela de ovo para traçar ao longo do perímetro da bolsa de ar acima do embrião E14 ou E15 com um lápis e cubra a área delineada com fita transparente. Usando tesouras curvas ou finas, corte suavemente ao redor da área traçada. Tenha cuidado para não cortar a membrana do embrião ou vasos sanguíneos.
Em seguida, descarte a parte superior da concha. Depois de decapitar o embrião do pintinho, coloque a cabeça em um prato de 10 centímetros com uma solução de CMF fria e estéril. Usando pinças finas estéreis, descasque a pele que cobre o cérebro para revelar a dura-máter subjacente.
Remova os ossos do crânio em formação nos lados esquerdo e direito do cérebro. Os ossos do crânio em formação ainda não cobrem a maior parte do cérebro. Use suavemente pinças pontiagudas finas para rasgar as meninges, sobrepondo o centro do cérebro e descasque-o para cada lado para descobrir o cérebro.
Usando pinças curvas finas, pegue o cérebro da frente inferior e puxe-o suavemente para fora de sua cavidade. Dissecção o cérebro em suas três partes principais prosencéfalo, mesencéfalo ou tecta óptica e cerebelo. Retire a pia-máter sobrejacente da tecta usando pinças finas e coloque as regiões cerebrais dissecadas em um pequeno prato estéril sobre gelo.
Para incorporar e cortar o cérebro, pegue suavemente o tecto óptico ou a região do prosencéfalo com pinças curvas como uma colher e borre levemente em gaze estéril para remover líquido extra. Prepare um molde simples formando papel alumínio em torno de um objeto de tamanho adequado. Aqui, um pequeno bloco de corte de tecido vibratório de metal retangular é usado como objeto.
Use uma pipeta de transferência estéril e preencha o molde com agarose de baixo derretimento. Coloque rapidamente a região do cérebro em agarose e deixe solidificar por aproximadamente quatro a cinco minutos no gelo. Corte as seções em um cortador de tecido vibratório usando uma faca de safira.
Use a espátula estéril para colher e remover a fatia da bandeja. Deslize suavemente a secção para fora da espátula e para uma inserção de membrana utilizando outra espátula estéril. Coloque a placa de seis poços de fatias cerebrais em inserções de membrana na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte ao plaqueamento, use uma pipeta Pasteur estéril para aspirar o meio por baixo da pastilha e adicione um mililitro de meio de fatia fresco a cada poço abaixo da inserção da membrana. Em seguida, para introduzir as células GBM nas fatias cerebrais, remova um a vários esferoides de sua placa de cultura usando uma micropipeta de 20 microlitros ajustada para cinco microlitros. Expulse suavemente o meio com esferoides na fatia cerebral desejada e deixe os esferoides crescerem na fatia por dois a cinco dias.
Os resultados de viabilidade de cortes de tecto óptico x vivo após uma semana em cultura são mostrados nesta figura. As imagens confocais de um corte cerebral corado para núcleos com bisbenzimida e imunocorado para laminina mostram claramente vasos sanguíneos normais e intactos opticamente seccionados em várias configurações. A imagem de projeção máxima da pilha confocal Z do corte cerebral corada pelo fator de transcrição SOX 2 e núcleos totais com bisbenzimida é mostrada aqui.
Esses resultados sugerem que fatias cerebrais de embriões de pintinhos podem ser cultivadas em inserções de membrana por aproximadamente duas semanas e permanecem viáveis com vasos sanguíneos de aparência normal e expressão de fator de transcrição.
