Prepare a solução de ORO dissolvendo 0,5 gramas de pó de ORO em 100 mililitros de isopropanol para gerar uma solução de estoque. Prepare a solução de trabalho para todos os músculos combinando a solução estoque ORO e a água deionizada em uma proporção de 60 para 40. Cubra a solução de trabalho durante 10 minutos para permitir que as partículas se fixem.
Filtre-o através de uma malha de 40 micrômetros, seguido por um filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Em seguida, remova a solução de formaldeído dos músculos decelularizados na placa do poço e lave os músculos três vezes com um volume igual de PBS. Em seguida, substituir o PBS por um volume igual de solução de isopropanol a 60% e incubá-lo no agitador de balanço por cinco minutos.
Uma vez feito, substitua a solução de isopropanol a 60% por solução de trabalho ORO antes de 10 minutos de incubação no agitador de balanço. Em seguida, substitua a solução de trabalho ORO por um volume igual de 1% de SDS e inspecione a solução de SDS periodicamente. Quando a solução se tornar visivelmente rosa, substitua a solução SDS por 1% SDS fresco.
Quando a solução permanecer límpida por 24 horas, substitua o SDS de 1% pelo PBS. Sob um microscópio estéreo com quatro vezes de aumento, remova quaisquer detritos óbvios ou partículas presas na parte externa do músculo corado. Se a coloração for satisfatória, mostrando as esferas vermelhas brilhantes flutuando em uma matriz transparente, adquira as imagens de coloração usando uma câmera acoplada ao microscópio estéreo.
Os músculos devidamente decelularizados eram brancos e semitransparentes. Quando os músculos decelularizados foram corados com ORO para visualizar o tecido adiposo intramuscular, ou IMAT, as gotículas lipídicas IMAT foram aparentes dentro das estruturas musculares claras como esferas vermelhas. Os músculos saudáveis dos membros posteriores de camundongos mostraram um pouco de IMAT natural, evidenciado por pouco ou nenhum lipídio vermelho ou positivo, em comparação com os músculos dos membros posteriores injetados com cardiotoxina ou glicerol.
A decelularização incompleta foi identificada imediatamente após o tratamento inicial com SDS ou após o washout da coloração ORO como fibras rosa claro semiopacas. A depuração incompleta de ORO foi identificada após washout de ORO como um fundo uniforme rosa ou vermelho em vez de linhas de fibra distintas.
